付永智，馬曉君，王茂晗，陳芝媛，趙 涵，李 哲，蘇詠梅，吳建華，朱文進(jìn)

（河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北秦皇島 066004）

MSTN基因（Myostatin，肌肉生長(zhǎng)抑制素）又稱(chēng)GDF-8，屬于轉(zhuǎn)化因子β（TGF-β）超家族，作為對(duì)動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用的基因之一，其與多個(gè)基因互作，通過(guò)終止肌細(xì)胞增殖而抑制肌肉生長(zhǎng)發(fā)育[1-2]。研究表明，MSTN基因的突變是肌肉肥大、增生的重要條件[3]。目前對(duì)牛、羊和家禽MSTN基因多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn)，其與畜禽的生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能有關(guān)[4-8]。MSTN基因由3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子組成，其中外顯子序列在不同物種之間屬于高保守性[9-10]，但是基因中外顯子序列約占10%，大部分為內(nèi)含子序列。雖然哺乳動(dòng)物的基因表達(dá)普遍不需要內(nèi)含子，但是內(nèi)含子中含有具備啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和抑制子作用和功能的序列以及多種順勢(shì)作用元件，對(duì)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量有重要的調(diào)控作用[11-12]。內(nèi)含子中堿基發(fā)生突變可能會(huì)引起這些序列功能的改變，影響正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。

本研究對(duì)中國(guó)14 個(gè)品種家驢542 個(gè)個(gè)體的MSTN基因第1 內(nèi)含子進(jìn)行多態(tài)性分析，以期從分子水平上了解家驢的遺傳多樣性，為家驢MSTN基因功能的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 實(shí)驗(yàn)用血樣采自14 個(gè)品種家驢542 個(gè)個(gè)體的頸靜脈，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室后，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。樣品信息?jiàn)表1。

表1 樣本信息

1.2 DNA 的提取和PCR 擴(kuò)增 血液中DNA 用苯酚-氯仿法抽提。特異性引物根據(jù)馬MSTN基因序列（GQ.183900.1）用在線軟件Premer Premier 3.0 Plus 設(shè)計(jì)，引物序列為F：5'-TGCTCCACAATGAATCTCG-3'，R：5'-TGAGACTGAAATCTGCTGCA-3'，預(yù)擴(kuò)增長(zhǎng)度為213 bp，由生工生物（上海）股份有限公司合成。

20 μL PCR 擴(kuò)增體系為：上下游混合引物（10 pmol/μL）1.5 μL、模板DNA（10 ng/μL）1.5 μL、2×EsTaqMaster Mix(dye) 10 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃10 min，變性94 ℃40 s，退火56 ℃40 s，延伸72 ℃40 s，35 個(gè)循環(huán)，終延伸72℃10 min。

1.3 中國(guó)14 個(gè)品種家驢MSTN基因第1 內(nèi)含子多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè) 中國(guó)14 個(gè)品種家驢MSTN基因第1 內(nèi)含子多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)采用PCR-SSCP 技術(shù)，非變性聚丙烯酰胺凝膠濃度為12%，70 mL 凝膠組分為：30% Asr-bis（29:1）28 mL，5×TBE 14 mL，10%過(guò)硫酸銨490 μL，TEMED 50 μL，ddH2O 補(bǔ)至70 mL。電泳條件為：180V 恒壓18 h。電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染，將不同帶型樣品的PCR 產(chǎn)物送往生工生物（上海）股份有限公司北京測(cè)序部測(cè)序。

1.4 中國(guó)14 個(gè)品種家驢MSTN基因第一內(nèi)含子遺傳多樣性分析 基因型鑒定結(jié)果用Excel 表格整理，并計(jì)算基因頻率、基因型頻率和多態(tài)信息含量（PIC）。用SPSS 軟件檢驗(yàn)Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中國(guó)14 個(gè)品種家驢MSTN基因第1 內(nèi)含子PCR 擴(kuò)增結(jié)果MSTN基因第1 內(nèi)含子PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物1.6%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。可見(jiàn)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)約213 bp，大小符合預(yù)期，且條帶特異性良好，可直接進(jìn)行測(cè)序或后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 MSTN 基因第1 內(nèi)含子PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.2 中國(guó)14 個(gè)品種家驢MSTN基因第1 內(nèi)含子PCRSSCP 分析 對(duì)中國(guó)14 個(gè)品種家驢542 個(gè)個(gè)體的MSTN基因第1 內(nèi)含子PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP 分析，其分型結(jié)果和測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2 和圖3。

由圖2 和圖3 可見(jiàn)，中國(guó)家驢MSTN基因第1 內(nèi)含子存在多態(tài)性，SSCP 結(jié)果顯示3 種帶型，對(duì)不同帶型的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與參考序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，基因1 323 位點(diǎn)堿基發(fā)生T→C 突變，由此產(chǎn)生TT、TC 和CC 3 種基因型。

圖2 MSTN 基因第1 內(nèi)含子PCR-SSCP 分析結(jié)果圖

圖3 MSTN 基因第1 內(nèi)含子擴(kuò)增片段測(cè)序峰值圖

2.3 中國(guó)14 個(gè)品種家驢MSTN基因第1 內(nèi)含子不同基因型頻率和基因頻率分析 由表2 可見(jiàn)，14 個(gè)品種家驢的基因型頻率分布不同，其中，大型德州驢CC 基因型頻率最高（0.53），小型太行驢TC 基因型頻率最高（0.62），大型渤海驢TT 基因型頻率最高。14 個(gè)品種家驢T 等位基因頻率的分布（0.62～0.80）高于C 等位基因頻率的分布（0.20～0.38），該突變位點(diǎn)產(chǎn)生的基因和基因型頻率在品種間的分布沒(méi)有明顯規(guī)律。

表2 中國(guó)14 個(gè)品種家驢MSTN 基因第1 內(nèi)含子突變位點(diǎn)（g.1323 T＞C）基因頻率和基因型頻率分析

2.4 中國(guó)14 個(gè)品種家驢MSTN基因第1 內(nèi)含子遺傳多樣性分析 中國(guó)14 個(gè)品種家驢MSTN基因第1 內(nèi)含子多態(tài)性位點(diǎn)g.1323T→C 的多態(tài)信息含量和Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 多態(tài)信息含量計(jì)算和Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)

由表3 可知，14 個(gè)品種家驢遺傳多態(tài)性均為中度多態(tài)，其中太行驢多態(tài)信息含量最高，為0.360 0；渤海驢最低，為0.271 8。渤海驢的多態(tài)信息含量較低，可能是由于渤海驢采樣是在相鄰的村鎮(zhèn)，有相同公驢的后代。

Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，晉南驢處于極度不平衡狀態(tài)（P＜0.01），廣靈驢和慶陽(yáng)驢處于不平衡狀態(tài)（P＜0.05），其余11 個(gè)品種處于平衡狀態(tài)（P＞0.05），說(shuō)明晉南驢、廣靈驢和慶陽(yáng)驢可能在采樣或樣本量存在問(wèn)題或在該位點(diǎn)存在隨機(jī)遺傳漂變。

3 討 論

家畜MSTN基因第1 內(nèi)含子多態(tài)性豐富。劉曉琴等[13]對(duì)6 個(gè)品種豬MSTN基因多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)第1 內(nèi)含子存在5 個(gè)突變位點(diǎn)（g.1735G→A、g.2099C→T、g.2882T→C、g.2970C→T 和g.3013A→G）。岳續(xù)朋等[14]研究發(fā)現(xiàn)，西門(mén)塔爾牛和夏洛萊牛MSTN基因第1內(nèi)含子819～1127bp區(qū)域存在AA、BB、CC、AB、BC 和AD 6 種基因型。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)不同的方法在馬MSTN基因第1 內(nèi)含子檢測(cè)到5 個(gè)突變位點(diǎn)（g.1485C→T、g.1634T→G、g.2024G→A、g.2115A→G和g.2327A→C）[15-18]。其中g(shù).2115A→G 突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)與焉耆馬、伊犁馬的胸圍、體長(zhǎng)顯著相關(guān)[19]；Hill[20]和Tozaki[21]等發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與純種馬短跑能力和體高有顯著關(guān)聯(lián)，并將其作為預(yù)測(cè)比賽能力和骨骼肌指標(biāo)的標(biāo)記。家驢與馬為同屬動(dòng)物，根據(jù)MSTN基因高保守性推測(cè)，家驢MSTN基因第1 內(nèi)含子也可能存在影響家驢性狀的突變位點(diǎn)。然而，關(guān)于家驢MSTN基因第1 內(nèi)含子多態(tài)性的研究報(bào)道較少，只有Liu 等[19]通過(guò)PCR-RFLP 方法在中國(guó)13 個(gè)品種家驢328 個(gè)個(gè)體中檢測(cè)到2 個(gè)突變位點(diǎn)，分別為g.2014G →A 和g.2395C →G，且基因型分別為GG 和CC 型占比最高，g.2014G →A 位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)，g.2395C →G 位點(diǎn)處于不平衡狀態(tài)。本研究采用PCRSSCP 方法在中國(guó)14 個(gè)品種家驢MSTN基因第1 內(nèi)含子中檢測(cè)到另一個(gè)突變位點(diǎn)（g.1323T →C），該位點(diǎn)在不同品種或類(lèi)型之間的基因型分布沒(méi)有明顯規(guī)律，且遺傳多樣性豐富，除了晉南驢、廣靈驢和慶陽(yáng)驢群體外，其他品種群體均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。但Liu等[22]和本研究都沒(méi)有將檢測(cè)到的MSTN基因第1 內(nèi)含子突變位點(diǎn)與家驢相關(guān)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，這些突變位點(diǎn)是否與同屬的動(dòng)物馬一樣，存在與驢體尺或其他性狀相關(guān)有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

通過(guò)PCR-SSCP 技術(shù)檢測(cè)，首次證實(shí)中國(guó)14 個(gè)品種家驢MSTN基因第1 內(nèi)含子區(qū)域存在g.1323T →C突變，但該位點(diǎn)在不同品種或類(lèi)型中的基因型和等位基因的分布沒(méi)有明顯規(guī)律，該堿基的突變是否與家驢性狀有關(guān)聯(lián)尚需進(jìn)一步研究。