陸益，于佳熙，梁政

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院耳鼻咽喉科，天津 300052）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在西方國家惡性腫瘤發(fā)病率中排名第5，在我國具有較高的復(fù)發(fā)率[1-2]。約50%接受根治性膀胱切除術(shù)的患者在術(shù)后2～3年內(nèi)出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)，其中10%～15%被診斷為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[3]。鉑類聯(lián)合化療和腫瘤靶向藥物并未對膀胱癌患者有最佳療效，反而會引起嚴(yán)重不良反應(yīng)[4-5]。然而，一種新藥的研發(fā)和批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的過程既昂貴又耗時(shí)。因此，藥物再利用近年來因在腫瘤治療中取得了有效成果而受到關(guān)注[6-7]。鹽酸氯丙嗪是抗精神病藥物中具有代表性的吩噻嗪類藥物，主要作用于中軸神經(jīng)系統(tǒng)[8]。此外，研究發(fā)現(xiàn)氯丙嗪可以在腫瘤細(xì)胞系中發(fā)揮抗腫瘤作用，它可通過抑制絲蘇氨酸蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白（Akt/mTOR）通路，誘導(dǎo)腦腫瘤細(xì)胞的凋亡和自噬，還可以直接與細(xì)胞色素氧化酶亞基4（COX4-1）結(jié)合，阻斷耐藥腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的G1期[9-10]。氯丙嗪通過抑制組蛋白去乙?；?（sirtuin 1）并激活p53在結(jié)直腸癌中發(fā)揮促凋亡的作用[11]。因此，氯丙嗪具有強(qiáng)大的抗腫瘤作用，但對膀胱癌是否具有抑瘤作用尚不清楚。Yes相關(guān)蛋白1（YAP1）是蛋白激酶Hippo通路的重要組成部分，與膀胱癌的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程密切相關(guān)[12]。Ras相關(guān)蛋白1（RAP1）是RAS超家族的成員，屬于RAP1的兩個(gè)亞型之一[13]，可參與腫瘤的形成并誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[14]，然而RAP1A在膀胱癌中的作用尚不完全清楚。因此，本研究旨在探索氯丙嗪對膀胱癌的抗腫瘤作用及其分子機(jī)制，為膀胱癌患者治療的多向選擇提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人膀胱癌細(xì)胞BT-B細(xì)胞（天津市環(huán)湖醫(yī)院）經(jīng)STR鑒定；氯丙嗪（Sigma公司）；胎牛血清（Gibco公司）；青霉素和鏈霉素（Sigma-Aldrich公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；MTT細(xì)胞增殖測定試劑盒（Solarbio公司）；抗體：YAP1（Santa公司，sc-101199），GAPDH（Abcam公司，ab8245），p-YAP1-ser127（CST公司，13008），RAP1A（CST公司，2399s），β-actin（Abcam公司，ab8227），N-cad（CST公司，13116）和Slug+snail（Abcam公司，ab180714）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）；SYBR Green Master Mix試劑（啟衡星）；YAP1、RAP1A和GAPDH的引物序列在北京奧科公司合成；pCDH-YAP1和pCDHRAP1A為過表達(dá)質(zhì)粒，Sh-RAP1A和Sh-YAP1為降表達(dá)質(zhì)粒，均在實(shí)驗(yàn)室合成，pCDH-vector和plsi-vector分別作為過表達(dá)和降表達(dá)對照質(zhì)粒由天津市腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室捐贈，以上所有質(zhì)粒通過測序確認(rèn)；轉(zhuǎn)染試劑：ViaFect（Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌細(xì)胞系BT-B由含有10%胎牛血清和1%的青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為對照組（0 μmol/L）和不同濃度氯丙嗪給藥組（10、20、40、80 μmol/L）；將呈對數(shù)生長的細(xì)胞均勻種入96孔板，按照不同濃度氯丙嗪處理后，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入MTT培養(yǎng)基混合溶液（MTT∶培養(yǎng)基=1∶9），避光孵育4 h后除去MTT溶液并加入DMSO溶液，室溫?fù)u床避光孵育10 min后，分光光度計(jì)（Thermo公司）測定OD值。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為對照組（0 μmol/L）和不同濃度氯丙嗪給藥組（10、20 μmol/L），將呈對數(shù)生長的細(xì)胞均勻種入12孔板，氯丙嗪給藥處理24 h，細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時(shí)畫垂直跡線，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24 h和48 h后在熒光顯微鏡下拍照。

1.2.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為對照組（0 μmol/L）和不同濃度氯丙嗪給藥組（10、20 μmol/L），將兩組細(xì)胞饑餓12 h，細(xì)胞計(jì)數(shù)得到所需細(xì)胞數(shù)。向24孔板中加入400 μL含血清的培養(yǎng)基，放置Transwell小室，然后將200 μL無血清細(xì)胞懸液種植在小室中并培養(yǎng)24 h。甲醇固定20 min，吉姆薩染液2染色15 min，吉姆薩染液3染色10 min，于顯微鏡下拍照。

1.2.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為對照組（0 h）和不同時(shí)間段20 μmol/L氯丙嗪給藥組（1、2 h），將呈對數(shù)生長的細(xì)胞均勻種入6孔板，配制蛋白裂解液（1.1×SDS+100×PMSF）于氯丙嗪給藥處理1 h和2 h后分別收集蛋白，NanoDrop儀器測定濃度并均一，4%～12%預(yù)制膠進(jìn)行蛋白電泳并使用快速轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)入PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗抗體：YAP1（1∶500）、GAPDH（1∶2 000）、p-YAP1-ser127（1∶250）、RAP1A（1∶500）、β-actin（1∶2 000）、N-cadherin（1∶1 000）和Slug+Snail（1∶200）4℃過夜孵育。次日二抗抗體（1∶5 000）室溫?fù)u床孵育1 h，顯影曝光。

1.2.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為對照組（0 μmol/L）和氯丙嗪給藥組（10 μmol/L），將呈對數(shù)生長的細(xì)胞均勻種入帶有圓玻片的12孔板，氯丙嗪給藥處理后分別于1 h和2 h終止藥物作用，4%多聚甲醛（PFA）室溫固定10 min，0.1% triton-100X室溫滲透10 min，3%BSA封閉1 h，一抗抗體YAP1（1∶500）保濕盒4℃過夜孵育。次日加入熒光二抗（綠光488 nm，1∶200）避光室溫孵育1 h，DAPI染核10～20 min，封片，蔡司共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.7 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為對照組（0 μmol/L）和氯丙嗪給藥組（20 μmol/L），將呈對數(shù)生長的細(xì)胞均勻種于6孔板中，氯丙嗪給藥處理24 h。Trizol試劑提取RNA，Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，-20℃保存。設(shè)置PCR反應(yīng)條件，在LC480熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。反應(yīng)條件為預(yù)變性：95℃，3 min；變性：95℃，3 s；退火：60℃，30 s；共40個(gè)循環(huán)。目的基因引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物合成序列Tab 1 Primer sequencesfor RT-qPCR

1.2.8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為對照組（vector組）和不同表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（pCDH-RAP1A組、Sh-RAP1A組、pCDH-YAP1組、Sh-YAP1組），將呈對數(shù)生長的細(xì)胞均勻種入12孔板，貼壁繼續(xù)培養(yǎng)，配制轉(zhuǎn)染體系（質(zhì)?！棉D(zhuǎn)染試劑=1 mg∶3 μL）靜置20 min，緩慢滴加轉(zhuǎn)染體系，48 h后收集蛋白，蛋白免疫印跡步驟同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Prism8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，蛋白免疫印跡結(jié)果應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行蛋白灰度分析，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯丙嗪對BT-B細(xì)胞增殖能力的作用 與對照組（0 μmol/L）相比，10 μmol/L氯丙嗪給藥組（72.47±4.14，t=11.53，P<0.001）、20 μmol/L氯丙嗪給藥組（63.98±1.74，t=35.83，P<0.000 1），40 μmol/L氯丙嗪給藥組（41.03±2.83，t=36.1，P<0.000 1）和80 μmol/L氯丙嗪給藥組（1.16±0.88，t=194.6，P<0.000 1）細(xì)胞72 h存活率均顯著降低。氯丙嗪在濃度為10 μmol/L和20 μmol/L時(shí)顯著抑制細(xì)胞生長，而在濃度為40 μmol/L和80 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力逐漸下降趨近于0，所以選擇藥物濃度10 μmol/L和20 μmol/L進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2 氯丙嗪對BT-B細(xì)胞遷移能力的作用 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組（0 μmol/L）相比，10 μmol/L和20 μmol/L氯丙嗪給藥組劃痕24 h（t=5.80，P<0.01；t=7.43，P<0.01）和48 h（t=5.13，P<0.01；t=6.61，P<0.01）后細(xì)胞遷移率隨藥物濃度增加而降低（圖1A、B）；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示（圖1C、D），與對照組（0 μmol/L）相比，10 μmol/L和20 μmol/L氯丙嗪給藥組細(xì)胞24 h遷移穿過腔室的數(shù)目隨藥物濃度增加而減少（t=18.51，P<0.000 1；t=19.04，P<0.000 1）。

圖1 氯丙嗪BT-B細(xì)胞遷移能力的影響Fig 1 Effect of chlorpromazine on migration ability of BT-B cells

2.3 氯丙嗪對YAP1和RAP1A表達(dá)的影響 結(jié)果表明，與對照組（0 h）相比，氯丙嗪處理1 h和2 h后YAP1蛋白（t=6.12，P<0.05；t=7.64，P<0.05）和磷酸化YAP1蛋白（t=6.47，P<0.05；t=8.04，P<0.05）表達(dá)逐漸下降，2 h時(shí)下降明顯（圖2A、C、D）；與對照組（0 h）相比，RAP1A蛋白表達(dá)水平經(jīng)氯丙嗪給藥處理后也顯著降低（t=4.87，P<0.05；t=8.30，P<0.05；圖2B、E），與YAP1蛋白水平變化結(jié)果一致；免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組（0 h）相比，氯丙嗪處理后2 h，YAP1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的熒光表達(dá)均明顯變?nèi)酰▓D2F），與YAP1蛋白水平變化一致。

圖2 氯丙嗪在BT-B中對YAP1和RAP1A表達(dá)的影響Fig 2 Effect of chlorpromazine on the expressions of YAP1 and RAP1A in BT-B cells

2.4 氯丙嗪對YAP1和RAP1A mRNA水平的影響RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組（0 μmol/L）相比，20 μmol/L氯丙嗪給藥組中YAP1和RAP1A的mRNA表達(dá)水平均顯著降低（t=21.13，P<0.001；t=40.59，P<0.001）（圖3）。

圖3 氯丙嗪在BT-B細(xì)胞中對YAP1和RAP1A mRNA表達(dá)水平的影響Fig 3 Effect of CPZ on the mRNA expressions of YAP1 and RAP1A in BT-B cells

2.5 YAP1和RAP1A與BT-B細(xì)胞EMT的調(diào)控關(guān)系 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，與對照組（vector組）相比，RAP1A過表達(dá)組（pCDH-RAP1A組）和RAP1A敲低組（Sh-RAP1A組）中YAP1的蛋白水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖4A、B）。如圖4C、D和E所示：與對照組相比，YAP1過表達(dá)組（pCDH-YAP1組）中，RAP1A蛋白（t=9.05，P<0.05）表達(dá)增加，EMT相關(guān)標(biāo)記分子N-cadherin蛋白（t=7.24，P<0.05）表達(dá)增加，Slug+snail蛋白（t=5.57，P<0.05）表達(dá)增加；YAP1敲低組（Sh-YAP1組）中，RAP1A、N-cadherin和Slug+snail蛋白表達(dá)下降（t=4.36，P<0.05；t=4.50，P<0.05；t=4.49，P<0.05）。

圖4 YAP1和RAP1A與膀胱癌EMT的關(guān)系Fig 4 Relationship between YAP1 and RAP1A and EMT in bladder cancer

3 討論

高復(fù)發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率是膀胱癌患者預(yù)后不良的重要因素，盡管已經(jīng)開發(fā)出多種靶向治療藥物，但由于存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)而難以進(jìn)入臨床使用[4，15-16]。藥物再利用給腫瘤治療提供了新的方向。氯丙嗪是美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的臨床常用精神科藥物，多項(xiàng)研究研究證明了氯丙嗪還具有抗腫瘤作用。早期研究證明，氯丙嗪與他莫昔芬聯(lián)合用藥可有效抑制乳腺癌中他莫昔芬耐藥細(xì)胞的生長[17]，還可以抑制口腔癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡[6]。氯丙嗪可能通過靶向脯氨酸-谷氨酸-亮氨酸富集蛋白1（PELP1），抑制胃癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲[18]。氯丙嗪作為一種鎮(zhèn)靜藥，在應(yīng)用過程中可能會存在誘發(fā)膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)，但是其致病機(jī)制尚不明確，是否與給藥劑量、療程及方法相關(guān)也尚不完全明確[17]。有研究根據(jù)大規(guī)模數(shù)據(jù)庫和系統(tǒng)回歸建模分析構(gòu)建了綜合遺傳和表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)（IGEN）分析，并預(yù)測出包括氯丙嗪、吉非替尼和多種化療藥物聯(lián)合用藥的治療方案，用于治療4期膀胱癌且不良反應(yīng)最小[19]。因此，氯丙嗪對膀胱癌的作用仍然值得進(jìn)一步探索。本研究探索了氯丙嗪對膀胱癌的抗腫瘤作用及其機(jī)制，為晚期膀胱癌患者的治療提供了依據(jù)。

本研究證明了氯丙嗪對膀胱癌BT-B細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用，并且對細(xì)胞遷移功能有抑制作用，以上結(jié)果說明了氯丙嗪對膀胱癌有抗腫瘤作用。同時(shí)本研究對其抑癌機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氯丙嗪可顯著降低YAP1和RAP1A的蛋白水平和mRNA表達(dá)水平，說明YAP1和RAP1A可作為氯丙嗪的下游靶點(diǎn)分子，氯丙嗪可能通過YAP1和RAP1A起到抑癌作用。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，YAP1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的熒光表達(dá)均變?nèi)?，與蛋白免疫印跡結(jié)果相符合，但無細(xì)胞亞定位的改變。YAP1的經(jīng)典調(diào)控通路是上游分子哺乳動物STE20樣激酶1/2（MST1/2）和大腫瘤抑制激酶1/2（LATS1/2）使YAP1發(fā)生磷酸化而失活，YAP1停留在胞漿中，不能入核激活下游靶基因[20]。因此，氯丙嗪下調(diào)YAP1的表達(dá)可能是通過非經(jīng)典途徑調(diào)控，具體機(jī)制有待探究。YAP1作為一個(gè)癌基因參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。研究證明YAP1和mTOR協(xié)同作用可促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖并抑制細(xì)胞凋亡[21]。維替泊芬通過靶向YAP1抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[22]。YAP1在膀胱癌的發(fā)生中起重要作用，而氯丙嗪可抑制YAP1的表達(dá)，這與氯丙嗪通過YAP1抑制乳腺癌細(xì)胞的干性特性和遷移功能研究結(jié)果符合[7]。進(jìn)一步說明了氯丙嗪對膀胱癌的抗腫瘤作用。此外，YAP1與膀胱癌EMT的發(fā)生密切相關(guān)。而RAP1A是細(xì)胞黏附相關(guān)分子，RAP1A可通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/p38絲裂原活化蛋白激酶/Notch受體1（ERK/p38/Notch）通路誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移[23]。RAP1A作為長鏈非編碼RNA——LINC00460的下游靶點(diǎn)分子，促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲[24]。因此，氯丙嗪對膀胱癌BT-B細(xì)胞遷移功能的抑制作用可能是通過作用于YAP1和RAP1A實(shí)現(xiàn)的。此外，本研究對膀胱癌中YAP1和RAP1A與EMT的關(guān)系進(jìn)行了探索。結(jié)果顯示，YAP1通過RAP1A促進(jìn)膀胱癌EMT的發(fā)生。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路與膀胱癌EMT的發(fā)生相關(guān)[25]，而YAP1和RAP1A通過PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞EMT的發(fā)生[26]。YAP1正向調(diào)控RAP1A，研究證明，轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白1（Sp1）可與YAP1啟動子多位點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)YAP1激活[27]，并且RAP1A的激活也與Sp1密切相關(guān)[26]。研究結(jié)果提示，YAP1調(diào)控RAP1A可能與Sp1相關(guān)，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。氯丙嗪是一種已在臨床上使用數(shù)年的精神類藥物，藥物安全性高，可規(guī)避新藥上市應(yīng)用帶來的研究瓶頸。本研究證明了氯丙嗪可通過YAP1調(diào)控RAP1A，抑制膀胱癌BT-B細(xì)胞的遷移，為降低膀胱癌患者的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率以及改善患者預(yù)后提供了理論依據(jù)。