朱靜娜 莫慧慧 梁燕華

南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚美容與性病科, 深圳，518101

人體皮膚作為一個(gè)獨(dú)特多變的生態(tài)系統(tǒng)，寄生在上面的微生物群落復(fù)雜豐富，其成員總數(shù)至少是人體自身細(xì)胞數(shù)量的十倍[1]。微生物群落的變化，可以改變宿主與微生物的相互作用，并與皮膚病的發(fā)生有關(guān)[2]，正常微生物群落的能力降低可使慢性疾病成為永久性疾病[3]。從嬰兒期過渡到成年期，皮膚會(huì)產(chǎn)生一系列的生理變化，微生物群落也隨之發(fā)生重大變化。青春期，微生物區(qū)系以親脂性為主，這反映了性成熟和激素刺激的皮脂腺活性的增加[4]。另外，男性和女性的皮膚在激素代謝、皮脂合成、皮表酸堿度(pH值)、脂肪堆積、血清瘦素等方面存在著差異[5]，可導(dǎo)致微生物的菌群差異，進(jìn)一步對(duì)皮膚病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。有研究表明，銀屑病、濕疹、玫瑰糠疹(PR)、特應(yīng)性皮炎(AD)等炎癥性皮病與真菌定植數(shù)量和真菌定植率有關(guān)。

微生物和宿主之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)與皮膚病的發(fā)生有關(guān)，真菌在其中扮演的角色亦不可忽略。念珠菌、馬拉色菌、釀酒酵母菌等皮膚常駐菌能影響皮膚屏障、調(diào)節(jié)皮膚免疫平衡和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在AD發(fā)病中起重要作用[6]。本研究利用真菌熒光染色法鑒定健康皮膚不同體表部位的真菌陽性率和定植量，并檢測(cè)炎癥性皮膚病不同部位皮損處的真菌定植率和孢子數(shù)量，探討真菌感染與炎癥性皮膚病之間的關(guān)系，將為不同部位真菌感染的臨床治愈停藥指征提供實(shí)驗(yàn)室參考。

1 研究對(duì)象與研究方法

1.1 研究對(duì)象 從2019年1～12月，南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚美容與性病科共收集1345例皮屑樣本，其中健康人888名[男388名，女500名；年齡0～70歲，平均(34±12)歲]和457例炎癥性皮膚病患者(男241例和女216例)。其中，銀屑病40例[男22例，女18例；年齡17～75歲，平均(38±14)歲]，AD患者37例[男19例，女18例；年齡0～59歲，平均(11±15)歲]，濕疹337例[男179例，女158例；年齡0～80歲，平均(35±18)歲]；PR患者43例[男21例，女22例；年齡1～59歲，平均(30±14)歲]。見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 采集部位 頭皮、頸后、胸背部、面部、上肢、腹股溝、腘窩、肘窩、足底9個(gè)部位采集皮屑標(biāo)本。根據(jù)皮膚的生理特征，可分為三個(gè)部位：皮脂溢出部位、干燥部位和潮濕部位[7]。本研究中皮脂溢出部位指面部、頸后、上胸部和背部；干燥部位指雙上肢；潮濕部位指腹股溝、腘窩、肘窩。其中，由于頭皮取材方法(刀片刮取法)與其他部位取材方法(膠帶黏取法)不一樣，頭皮從皮脂溢出部位分離出來單獨(dú)比較；由于足部真菌菌落結(jié)構(gòu)的多樣性和不穩(wěn)定性，足底作為一個(gè)單獨(dú)的研究部位[7,8]。炎性皮膚病組中標(biāo)本采集部位均為皮損區(qū)。

1.2.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 所有受試者均征得其同意[2018JD175]。皮膚病的診斷符合銀屑病、AD、濕疹、PR的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有受試者在 12～24小時(shí)內(nèi)避免洗澡，7天內(nèi)避免使用潤(rùn)膚劑、抗生素或抗真菌肥皂。

1.2.3 取材方法 用寬2.5 cm的透明膠帶(中國浙江得力集團(tuán)有限公司)以相同的強(qiáng)度黏貼皮膚，重復(fù)3次，每次3 s；由于頭皮存在毛發(fā)覆蓋， 利用無菌手術(shù)刀片(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司)從3個(gè)相鄰的部位刮取頭皮屑，每個(gè)部位刮20次。將采集到的標(biāo)本置于載玻片上(中國，SAIL BRAND)，加入1滴熒光染色劑(南京漢瑞生物科技有限公司)，輕輕按壓蓋玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)，靜置約30 s，使樣品與染色液充分混合，然后放置于熒光顯微鏡下觀察(奧林帕斯，型號(hào)BX43F)，隨機(jī)選擇30個(gè)視野(40×)計(jì)數(shù)，在統(tǒng)計(jì)表上記錄并統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用秩和檢驗(yàn)(分析軟件R 3.5.3)，統(tǒng)計(jì)量使用U表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

1345名受試者中，包括888名健康受試者及457例患者(表1)，結(jié)果顯示健康受試者和患者的孢子數(shù)呈偏態(tài)分布。

表1 研究樣本信息 例(%)

2.1 健康皮膚不同年齡、不同部位的真菌載量的比較 健康受試者三個(gè)不同部位的孢子數(shù)量不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故認(rèn)為健康組不同部位的孢子數(shù)量不同(表2)。健康受試者四個(gè)年齡組的同一部位比較(表3)，頭皮、干燥部位、潮濕部位和足底的孢子數(shù)量沒有顯著差異，但皮脂溢出部位的孢子數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 健康受試者不同部位孢子數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

表3 健康皮膚不同年齡相應(yīng)部位的真菌載量的比較

2.2 健康皮膚和炎癥性皮損的真菌檢出率(表4) (1)健康志愿者頭皮和皮脂溢出部位的真菌檢出率均很高(90%以上)，足底真菌檢出率最低(44.29%)，潮濕部位和干燥部位的檢出率相近。(2)AD的潮濕區(qū)域真菌檢出率最高，而該區(qū)域也是該病的皮損好發(fā)部位。(3)濕疹不同部位真菌檢出率不同，皮脂溢出部位>潮濕部位>干燥部位>足底，分別為77.05%、68.97%、58.93%和26.92%。(4)銀屑病的頭皮處真菌檢出率為54.54%，皮脂溢出部位為66.67%，干燥部位為47.62%。(5)PR的皮脂溢出部位真菌檢出率為91.42%，干燥部位檢出率為57.89%。

2.3 健康皮膚與炎癥性皮損同一部位的真菌檢出率比較(表4) (1)健康組頭皮部位的真菌檢出率(95.05%)高于銀屑病組(54.54%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(2)健康組皮脂溢出部位的真菌檢出率為96.26%，高于其余的4個(gè)疾病組，而健康組與疾病組對(duì)比，除PR組外，其余疾病組與健康組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(3)健康組干燥部位的真菌檢出率為83.16%，高于4個(gè)疾病組，且疾病組與健康組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(4)健康組潮濕部位的真菌檢出率(83.67%)高于AD組(77.78%)和濕疹組(68.97%)，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(5)健康組足底的真菌檢出率(44.29%)高于濕疹組(26.92%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 健康皮膚和炎癥性皮損相應(yīng)部位的真菌檢出率比較

2.4 健康皮膚與炎癥性皮損同一部位的真菌載量比較(表5) 除健康組與AD組潮濕部位孢子數(shù)量無顯著差異外，健康組與4個(gè)疾病組的其余相應(yīng)部位的孢子數(shù)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且健康皮膚的孢子載量高于皮損部位。

表5 健康皮膚與炎癥性皮損相應(yīng)部位的孢子載量比較

3 討論

眾所周知，皮膚表面黏附著各種各樣的微生物，包括細(xì)菌、病毒、真菌、昆蟲等，它們與人類宿主之間的相互作用及其機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜。皮膚屏障被破壞或共生菌與病原體之間的平衡紊亂可導(dǎo)致或加重皮膚病，甚至出現(xiàn)全身性疾病[7]。其中，馬拉色菌是人類正常皮膚上最常見的定植真菌，占真菌菌群的 50%～80%[9]。

快速準(zhǔn)確的真菌檢測(cè)方法是判斷皮損真菌載量的首要因素。以往多采用真菌培養(yǎng)、分子方法學(xué)、氫氧化鉀(KOH)濕片法等，各有弊端。其中，真菌培養(yǎng)受不同種屬生長(zhǎng)速度和培養(yǎng)要求的影響，檢出率低[10]；分子生物學(xué)方法受樣品中真菌核酸載量、樣品污染、DNA提取等因素限制。KOH濕片法由于顯微鏡下不易識(shí)別真菌結(jié)構(gòu)、檢驗(yàn)員經(jīng)驗(yàn)限制而降低了檢測(cè)陽性率。真菌熒光染色法利用可特異性結(jié)合真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)和葡聚糖的熒光染料，菌絲或孢子會(huì)發(fā)出藍(lán)綠色熒光，使結(jié)構(gòu)易于識(shí)別[11]。真菌熒光染色法優(yōu)于傳統(tǒng)的KOH濕片法，不僅具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、陽性率高等優(yōu)點(diǎn)[12]，而且可以在顯微鏡下直接觀察真菌的數(shù)量，是檢測(cè)皮膚中真菌定植量和定植率的較好方法。

本研究顯示，健康受試者不同部位的孢子數(shù)量不同，以皮脂溢出部位的孢子數(shù)量最多，提示油脂部位的真菌定植密度最大，可能與部分真菌的嗜脂性(如馬拉色菌)有關(guān)。正常人群不同年齡段的皮脂溢出部位的真菌定植量有區(qū)別，以18～44歲年齡段的孢子居多，其余部位差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示年齡是皮脂溢出部位的真菌定植量的影響因素之一。如馬拉色菌，在人出生后即開始在皮膚表面定居，并持續(xù)到6～12個(gè)月，隨后定植減少并保持低水平，直到青春期的皮脂腺活動(dòng)增加，提供了馬拉色菌種群所需的脂質(zhì)[13]。

關(guān)于皮膚最常見的定植真菌-馬拉色菌的研究最多，但其定植密度與AD疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性尚有爭(zhēng)議。本研究發(fā)現(xiàn)，除健康對(duì)照組與AD患者潮濕部位的真菌檢出率、載菌量并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，AD組皮脂溢出部位及干燥部位的檢出率及載菌量均低于正常人。

AD是一種慢性炎癥性皮膚病，兒童期和青年期多表現(xiàn)為亞急性、慢性濕疹狀，好發(fā)于四肢屈側(cè)，尤其是肘窩和腘窩等潮濕部位[14]。AD患者由于皮膚干燥，容易受到病毒、細(xì)菌和真菌的感染，從而損害皮膚的屏障功能[15]。AD的表皮屏障功能受損，同時(shí)由于瘙癢而搔抓加劇皮膚屏障損害，激活A(yù)D患者的先天免疫和增強(qiáng)獲得性免疫[16,17]。然而，決定表皮屏障正常功能的關(guān)鍵是維持其酸性外表面和堿性內(nèi)表面之間的pH梯度，該梯度驅(qū)動(dòng)著生物膜的許多重要功能，如馬拉色菌這樣的共生生物的作用則會(huì)加劇這種屏障形成過程中的遺傳缺陷[18]。亦有研究表明，AD患者的皮脂含量與疾病的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[19]，而皮脂含量的降低無益于馬拉色菌的定居，這或許可解釋健康對(duì)照組的皮脂溢出部位、干燥部位孢子數(shù)量較AD患者的相應(yīng)皮損部位升高的原因。近年也有文獻(xiàn)提示，馬拉色菌可能對(duì)青春期后AD有保護(hù)作用[13]，故真菌與AD之間的確切作用有待商榷。

真菌感染可能在濕疹的發(fā)病中起作用。與AD組類似，健康對(duì)照組的皮脂溢出部位、干燥部位、足底的孢子數(shù)量均較AD患者的相應(yīng)皮損部位多，這可能與臨床上大部分形態(tài)不典型的“AD”被診斷為“濕疹”有關(guān)。

白念珠菌和糠秕馬拉色菌與銀屑病的發(fā)生有關(guān)[20]。本次研究顯示，銀屑病組頭皮、皮脂溢出部位及干燥部位的檢出率及載菌量均低于正常人。既往也有研究表明，銀屑病患者馬拉色菌定植水平低于正常對(duì)照組，但馬拉色菌定植水平與銀屑病皮損面積和嚴(yán)重性指數(shù)(PASI)無顯著相關(guān)性[21]。因此，真菌定植與銀屑病的關(guān)系仍需深入研究。

本研究中，PR的皮脂溢出部位及干燥部位的真菌定植密度比正常人皮膚的真菌定植密度降低。PR與細(xì)胞免疫有關(guān)，然而，真菌感染也可引起細(xì)胞免疫紊亂。廖家等[22]認(rèn)為PR的發(fā)病可能是微生物感染后，朗格漢斯細(xì)胞將微生物半抗原遞呈給鄰近的淋巴細(xì)胞使其致敏，當(dāng)這些致敏的淋巴細(xì)胞再次接觸此類抗原的時(shí)候，會(huì)立刻釋放一系列細(xì)胞因子吸引炎癥細(xì)胞，進(jìn)而引起遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，同時(shí)，產(chǎn)生CD8+效應(yīng)T細(xì)胞會(huì)直接攻擊抗原，從而致使皮膚炎癥反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)了PR的發(fā)生發(fā)展。真菌感染亦可引起細(xì)胞免疫失調(diào)，由此我們認(rèn)為真菌定植紊亂與PR之間存在某種關(guān)聯(lián)。

目前真菌在皮膚不同部位的分布數(shù)量和陽性率還沒有相應(yīng)的參考值，這也是本研究的探討目的之一。研究結(jié)果表明，正常皮膚的真菌載量和攜帶率均高于炎癥性皮損區(qū)域，表明真菌是炎癥性皮膚病的保護(hù)因素而不是有害因素。本研究結(jié)果還顯示，真菌定植的數(shù)量與皮脂腺的分布有關(guān)，不同年齡階段健康人皮脂溢出部位的孢子數(shù)量差異可能是由于皮脂腺數(shù)量的不同造成的。此外，與腸道菌群移植類似，鑒于健康受試者的真菌高攜帶率，移植健康皮膚菌群修復(fù)炎癥性皮損可望成為皮膚微生物治療研究領(lǐng)域的重要方向。

綜上所述，皮膚是一個(gè)活躍的免疫器官[23]，本研究發(fā)現(xiàn)健康人皮膚和炎癥性皮病中真菌的陽性率和載量不同。因此，微生物干預(yù)可能是一種更溫和、更有價(jià)值的手段，代替?zhèn)鹘y(tǒng)藥物預(yù)防或治療炎癥性皮膚病，從而提高患者的生活質(zhì)量及滿意度。