謝建棟 綜述 熊 斌,2△ 審校

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧 272013;2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濟(jì)寧 272029)

根據(jù)最新的全球癌癥統(tǒng)計(jì)顯示[1]，全世界癌癥的發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升，女性乳腺癌已經(jīng)超過(guò)肺癌成為最常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型，死亡率位居第五。乳腺癌患者的死亡與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率密切相關(guān)，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)往往會(huì)使癌癥患者難以治愈，走向死亡。這種轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展由循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)所介導(dǎo)，這種由惡性腫瘤排出能夠侵入周?chē)M織并進(jìn)入淋巴及血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，會(huì)在全身其他組織和器官部位建立新的轉(zhuǎn)移，最終造成患者死亡[2]。因此，CTC在乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

1 CTC

1869年，澳大利亞Ashworth教授[3]通過(guò)觀(guān)察1例轉(zhuǎn)移性癌癥患者的外周血，首次發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)胞，其形態(tài)與原發(fā)腫瘤相似，故將其命名為CTC。目前，CTC定義為自發(fā)或因診療操作由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。CTC自腫瘤脫落后進(jìn)入血液，由于受到機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊，其半衰期在1～2.5h。然而，少數(shù)存活CTC可引起遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性疾病[4]。血液中的CTC相對(duì)于其他血細(xì)胞(如白細(xì)胞、紅細(xì)胞)來(lái)說(shuō)較少，106～107個(gè)白細(xì)胞中可能僅有1個(gè)CTC。CTC可以單獨(dú)或成簇地在血液系統(tǒng)中循環(huán)，CTC簇很少見(jiàn)，但它們比單個(gè)CTC具有更大的發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力[5]。CTC存在不同類(lèi)型，包括上皮細(xì)胞表型、間質(zhì)細(xì)胞表型和上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞混合表型，這是由于腫瘤細(xì)胞在進(jìn)入外周血循環(huán)的過(guò)程中會(huì)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。在EMT中，原本應(yīng)分化為上皮組織的細(xì)胞失去了原有分化方向，反而獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性和能力，具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力[6]。CTC可以與中性粒細(xì)胞結(jié)合，這種中性粒細(xì)胞和CTC之間的相互作用促進(jìn)了細(xì)胞周期的進(jìn)展，增加了CTC的轉(zhuǎn)移潛力，使患者的無(wú)進(jìn)展生存期(progress free survival,PFS)成倍的縮短[7]。

2 CTC檢測(cè)方法(富集和鑒定)

2.1 基于物理特性的富集

基于物理特性可以快速分離CTC而無(wú)須進(jìn)行復(fù)雜的標(biāo)記。代表檢測(cè)方法包括：利用密度差異的密度梯度離心法，利用細(xì)胞大小差異的膜濾過(guò)分離腫瘤細(xì)胞技術(shù)(ISET)，利用介電性質(zhì)差異的介電泳場(chǎng)流分離(DEP-FFF)，利用變形性差異的微流分離平臺(tái)[8]。基于物理特性的分離技術(shù)提供了高通量富集的可能，但由于CTC的大小和異質(zhì)性，目前的技術(shù)存在很大的局限性。

2.2 基于生物學(xué)特性的富集

基于生物學(xué)特性主要使用針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原(陽(yáng)性富集)或共同白細(xì)胞抗原CD45(陰性富集)抗體的免疫學(xué)方法。陽(yáng)性富集通常采用抗上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)的抗體。EpCAM是上皮源性癌癥的常見(jiàn)標(biāo)記蛋白，而白細(xì)胞不表達(dá)[9]。在目前基于EpCAM的技術(shù)，自動(dòng)化Cell Search?系統(tǒng)能夠可靠地檢測(cè)血液中的CTC，適用于臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的常規(guī)評(píng)估[10]。過(guò)去10年，使用EpCAM檢測(cè)癌癥患者血液中CTC的方法數(shù)量有所增加，例如 Magsweeper、MACS、Strep-Tactin、CTC-Chip和GO芯片。但面對(duì)EMT的CTC，由于EpCAM是陰性的，不能通過(guò)抗EpCAM抗體的檢測(cè)來(lái)分離，面臨著這一部分的CTC的丟失。陰性富集通常是通過(guò)靶定CD45去除白細(xì)胞，使CTC被富集沉淀。近年來(lái)用于分離CTC的EPISPOT(epithelial immunospot)技術(shù)就是采用的此種方法，雖可以獲取全部特征的CTC，但面臨著純度方面的問(wèn)題。

2.3 細(xì)胞鑒定

CTC分子檢測(cè)方法包括利用熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)基因組擴(kuò)增，免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)檢測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)記物，RT-PCR/qRT-PCR檢測(cè)特異性RNA和DNA序列，可以鑒定CTC。

3 CTC計(jì)數(shù)在乳腺癌中的臨床應(yīng)用

3.1 在轉(zhuǎn)移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)中的應(yīng)用

Cristofanilli等[11]對(duì)177名MBC患者采用Cell Search系統(tǒng)行CTC計(jì)數(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CTC≥5個(gè)/7.5ml血液相較于CTC<5個(gè)/7.5ml血液的PFS和總體生存期(Overall survival，OS)更短，證明了CTC在疾病期間具有預(yù)后價(jià)值。低水平CTC比高水平CTC的PFS和OS明顯增加，說(shuō)明在MBC治療進(jìn)程中任何時(shí)間CTC的升高提示病情可能惡化[12]。Larsson等[13]的一項(xiàng)前瞻性研究納入了156名首次診斷為MBC女性患者6個(gè)月的CTC和CTC簇的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。從所有研究時(shí)間點(diǎn)來(lái)看，CTC計(jì)數(shù)升高、≥5 CTC和CTC簇的檢測(cè)均可預(yù)測(cè)預(yù)后，隨著時(shí)間的推移，預(yù)后價(jià)值增加。這表明CTC水平的動(dòng)態(tài)變化與預(yù)后的相關(guān)性比僅基線(xiàn)計(jì)數(shù)更重要。此外，與簡(jiǎn)單的CTC計(jì)數(shù)相比，CTC簇的存在增加了更重要的預(yù)后價(jià)值。監(jiān)測(cè)接受全身治療的MBC患者血液中的CTC和CTC簇可能會(huì)提供有關(guān)終點(diǎn)臨床結(jié)局的重要預(yù)后信息。MBC患者死亡率與CTC簇?zé)o關(guān)，而是取決于CTC的數(shù)量。CTC 是疾病IV期患者分層的理想選擇。IV期惰性患者(<5CTC)的OS比IV期侵襲性患者(>5CTC，36.3個(gè)月vs 16個(gè)月) 更長(zhǎng)，與疾病亞型無(wú)關(guān)。因此，CTC計(jì)數(shù)可作為晚期疾病分期和疾病分層的重要工具。

3.2 在早期乳腺癌中的應(yīng)用

相較于MBC，CTC在早期乳腺癌中的臨床價(jià)值受到限制，主要由于CTC在非轉(zhuǎn)移性乳腺癌中尤為罕見(jiàn)，通常發(fā)現(xiàn)少于1個(gè)CTC/10mL血液，其中5個(gè)或更多CTC是罕見(jiàn)事件(1%～5.9%)。使用比MBC(每 7.5mL血液≥5個(gè)CTC)更低的閾值(每7.5mL血液≥1個(gè)CTC)在診斷時(shí)，約20%至25%的非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者可檢測(cè)到CTC[14]。與MBC類(lèi)似，CTC可以提供獨(dú)立的預(yù)后信息[15]。最近的國(guó)際薈萃分析(IMENEO研究)[14]基于來(lái)自16個(gè)中心接受新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy，NCT)治療的2000多名早期乳腺癌患者，結(jié)果顯示CTC計(jì)數(shù)是無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存、OS和局部復(fù)發(fā)的強(qiáng)有力且獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。重要的是，對(duì)生存的影響與檢測(cè)到的CTC的數(shù)量有關(guān)，隨著CTC數(shù)量1個(gè)到5個(gè)或更多，死亡風(fēng)險(xiǎn)比顯著增加。該研究表明CTC計(jì)數(shù)是NCT治療的早期乳腺癌患者的獨(dú)立和定量預(yù)后因素。Goodman等[16]的一項(xiàng)回顧性研究表明，早期乳腺癌患者手術(shù)后的CTC檢測(cè)可預(yù)測(cè)輔助放療的益處。這表明CTC計(jì)數(shù)可用于指導(dǎo)臨床醫(yī)生確定哪些患者將從放射治療中受益。Trapp等[17]研究發(fā)現(xiàn)化療兩年后CTC的存在與無(wú)病生存期(DFS)和OS降低有關(guān)。證實(shí)了CTC可以作為化療后乳腺癌常規(guī)隨訪(fǎng)期間的預(yù)后監(jiān)測(cè)標(biāo)志物。而在新輔助化療方面，Gwark等[18]研究發(fā)現(xiàn)NCT后有未達(dá)到病理完全緩解(pCR)和CTC≥5的患者顯示出具有較差的OS。Spring等[19]薈萃分析在NCT后實(shí)現(xiàn)pCR可顯著改善乳腺癌患者PFS和OS，特別是對(duì)于三陰性乳腺癌和HER-2陽(yáng)性的乳腺癌。Ni等[20]研究發(fā)現(xiàn)CTC計(jì)數(shù)隨NCT的應(yīng)用而減少，術(shù)前CTC陽(yáng)性而NCT后轉(zhuǎn)為陰性的CTC患者的pCR比率高于其他組。但O'Toole等[21]研究顯示在pCR的患者中，NCT后CTC仍然存在，這一發(fā)現(xiàn)表明CTC計(jì)數(shù)可能不適合替代病理學(xué)評(píng)估新輔助化療的效果。在一項(xiàng)前瞻性試驗(yàn)Treat-CTC[22]中，63名在新輔助化療和手術(shù)后患有非轉(zhuǎn)移性HER-2陰性乳腺癌且可檢測(cè)到CTC的患者被隨機(jī)分配至曲妥珠單抗(赫賽汀)或觀(guān)察組。試驗(yàn)的主要終點(diǎn)第18周CTC計(jì)數(shù)沒(méi)有差異，試驗(yàn)因無(wú)效而停止。這種陰性結(jié)果可能與CTC的HER-2狀態(tài)有關(guān)，因?yàn)樵谘芯恐胁灰驝TC必須是HER-2陽(yáng)性。事實(shí)上，大多數(shù)患者(76%)CTC呈陽(yáng)性。Treat-CTC試驗(yàn)的失敗與選擇不適當(dāng)?shù)闹委煾深A(yù)有關(guān)，不能夠說(shuō)明基于CTC變化的治療決策是無(wú)效的。

4 CTC分子分析在乳腺癌中的臨床應(yīng)用

隨著CTC檢測(cè)的進(jìn)步，除了計(jì)數(shù)之外，從患者血液中有效分離出的CTC可以進(jìn)行詳細(xì)的分子分析，包括檢測(cè)遺傳和表觀(guān)遺傳變化、表達(dá)譜和表型篩選。近年來(lái)，CTC的單細(xì)胞測(cè)序已得到廣泛研究，能夠揭示CTC的基因組和轉(zhuǎn)錄組。CTC表型是治療反應(yīng)的另一個(gè)重要預(yù)測(cè)因子。CirCe T-DM1研究[23]是第一個(gè)不使用CTC數(shù)量而是表型作為決策標(biāo)準(zhǔn)的臨床試驗(yàn)。共篩選了155名患者，14名(9.0%)患有HER-2陽(yáng)性CTC，11名患者接受了TDM-1治療。僅在一名患者中觀(guān)察到部分反應(yīng)。由于這些結(jié)果以及HER-2陽(yáng)性CTC的患病率非常低(占檢測(cè)到的CTC的1.6%)，結(jié)論認(rèn)為，所測(cè)試的治療方法沒(méi)有前景。Guan等[24]研究得出使用總CTC計(jì)數(shù)和間充質(zhì)CTC比例的聯(lián)合指標(biāo)在HER-2陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的預(yù)后評(píng)估和療效監(jiān)測(cè)中較單純地使用總CTC計(jì)數(shù)具有更高的敏感性。CTC表型表現(xiàn)出很大的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，這與治療反應(yīng)的變化有關(guān)。這種基于EMT標(biāo)志物的簡(jiǎn)單實(shí)用的CTC檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)治療反應(yīng)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并可能對(duì)MBC個(gè)性化治療做出很大貢獻(xiàn)。MBC患者大多數(shù)CTC為ER、PR陰性，而原發(fā)性腫瘤卻為陽(yáng)性。這可能反映了一種逃避內(nèi)分泌治療的機(jī)制。與此相反，在ER、PR陰性乳腺癌中，原發(fā)性腫瘤和CTC之間受體狀態(tài)的變化通常很小。Papadaki等[25]研究證實(shí)在那些患有MBC且對(duì)治療方案沒(méi)有反應(yīng)的患者中，化療后上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞混合表型人群增加了，此亞群是PFS降低的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，在HER-2陰性患者中，它也可預(yù)測(cè)OS降低。深入分析CTC的分子分型有助于理解腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制和耐藥機(jī)制[26]。理想情況下，CTC下游分子表征的改進(jìn)將最終導(dǎo)致針對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程的定制藥物的開(kāi)發(fā)。Wang等[27]測(cè)量了105名HER-2陰性的MBC患者的CTC的HER-2 表達(dá)，結(jié)果說(shuō)明了CTC在檢測(cè)HER-2不一致和預(yù)測(cè)對(duì)HER-2靶向治療的反應(yīng)方面的潛在效用。

5 小結(jié)與展望

CTC檢測(cè)目前主要應(yīng)用在乳腺癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)及腫瘤的個(gè)體化治療等方面。尤其是CTC的定量和定性檢測(cè)已被應(yīng)用于快速評(píng)估化療和靶向治療的療效、預(yù)測(cè)預(yù)后、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)治療耐藥和癌癥復(fù)發(fā)。在CTC的分子檢測(cè)和表征方面也取得了相關(guān)進(jìn)展，但是我們對(duì)CTC功能特性的知識(shí)仍然有限，應(yīng)用仍然主要局限于研究目的和臨床研究，仍然缺乏臨床有效性的證據(jù)，尤其是臨床實(shí)用性方面。在檢測(cè)技術(shù)方面，雖然目前的CTC分離技術(shù)和產(chǎn)品種類(lèi)繁多，很多開(kāi)發(fā)的新技術(shù)顯著提高了CTC檢測(cè)的靈敏度和計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，但仍面臨著眾多的CTC檢測(cè)技術(shù)無(wú)法進(jìn)行評(píng)估和相互比較的問(wèn)題，仍需尋找靈敏度和特異度更高的檢測(cè)方法，以及對(duì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相統(tǒng)一。這需要在分析前階段對(duì)樣本處理進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化程序，或建立CTC分子分析的可重復(fù)工作流程?？傊?，關(guān)于CTC在轉(zhuǎn)移過(guò)程中的生物學(xué)機(jī)制和臨床影響，以及更深層次的認(rèn)識(shí)和了解，還有待進(jìn)一步的研究。