王 思， 曲 玥 陽， 肖 桂 山

( 大連理工大學(xué) 化工學(xué)院, 遼寧 大連 116024 )

0 引 言

腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年升高．2020年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，全球大約有肺癌新發(fā)病例220萬，發(fā)病率為11.6%；死亡病例180萬，遠(yuǎn)超其他癌癥類型，以18%的死亡率位居所有惡性腫瘤之首[1]．肺癌早期癥狀較為隱蔽，臨床上多數(shù)患者出現(xiàn)癥狀就診時就已屬晚期．隨著病程的進(jìn)展，10%～15%的患者會出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移[2]，25.4%～65.0%的患者可發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，生存時間超過2年的肺癌患者腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率高達(dá)80%[3]，致使晚期肺癌5年整體生存率較低．因此，研究肺癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，探索新的治療藥物具有重要意義．

SLC44A5是膽堿轉(zhuǎn)運蛋白，膽堿是乙酰膽堿和磷酸膽堿的前體[4]，也是形成膜磷脂磷脂酰膽堿所必需的[5]，膽堿還可以支持細(xì)胞膜的合成，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]．SLC44A5可通過降低細(xì)胞內(nèi)膽堿水平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制細(xì)胞生長[7]，從這個意義上說，癌癥中膽堿轉(zhuǎn)運體的鑒定和表征可能為抗腫瘤策略的設(shè)計提供新的靶點．因此，在癌細(xì)胞中識別膽堿轉(zhuǎn)運蛋白是非常重要的．膽堿轉(zhuǎn)運系統(tǒng)分為3類轉(zhuǎn)運蛋白：高親和力膽堿轉(zhuǎn)運蛋白(CHT1/SLC5A7)，中等親和力膽堿轉(zhuǎn)運蛋白樣蛋白(CTL/SLC44A1-5)和低親和力的多特異性有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運蛋白(OCTs/SLC22A1-2)[8]．已有文獻(xiàn)報道CTL/SLC44A1-5廣泛存在于不同人體組織中[9]．大鼠和人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中SLC44A1的存在表明，這種轉(zhuǎn)運蛋白的功能失調(diào)可能對損傷后的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和修復(fù)以及神經(jīng)退行性疾病具有重要意義[10]．SLC44A2在心臟、結(jié)腸、肺、腎和肝臟中表達(dá)為兩種亞型，即SLC44A2-P1和SLC44A2-P2，這表明組織特異性差異可能會影響其在每個組織中的功能[11]．SLC44A3在腎臟、回腸和結(jié)腸中中度表達(dá)，SLC44A4在胃和腎臟中高表達(dá)．關(guān)于SLC44A5表達(dá)的研究可用數(shù)據(jù)少得多，其在脊髓中的表達(dá)明顯高于SLC44A1[12]．雖然CTL/SLC44A1-5的分布已有相關(guān)文獻(xiàn)報道，然而，對SLC44A3-5功能的相關(guān)研究較少．在已有報道中，Sugimoto等發(fā)現(xiàn)SLC44A5在進(jìn)入腎臟途徑前轉(zhuǎn)運膽堿而不轉(zhuǎn)運磷酸膽堿，說明SLC44A5有助于維持細(xì)胞膽堿水平[13]．Peng等發(fā)現(xiàn)SLC44A5在肝癌中促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡抑制侵襲[14]，然而其在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的功能尚待研究．因此本研究將初步探討下調(diào)SLC44A5對肺腺癌細(xì)胞系增殖能力和遷移能力的影響．

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺腺癌細(xì)胞系H1299和H1792均購自美國ATCC公司．MTT(M8181-1g)試劑、青鏈霉素混合液(100×)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(PC0020)、Tween 20均購自北京索萊寶生物科技有限公司．胎牛血清、1640培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA胰酶購自Gibco公司．ECL超敏發(fā)光液(P1010)、RIPA裂解液購自北京普利萊公司．蛋白免疫印跡實驗相關(guān)化學(xué)試劑購自天津大茂化學(xué)試劑廠．質(zhì)粒小提中量試劑盒(DP106)、TRNzol Universal總RNA提取試劑(DP424)購自天根生化科技(北京)有限公司．SLC44A5(APREST83577)抗體購自Sigma公司．鼠二抗(A25012)和羊二抗(A25022)購自Macklin公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞系H1299、H1792、H1299對照組及H1792對照組使用含10% FBS和1%雙抗的1640培養(yǎng)基，H1299 shSLC44A5和H1792 shSLC44A5使用含10% FBS、1%雙抗和2 μmol/L DOX的1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)中培養(yǎng)．

1.2.2 RT-qPCR分析 采用TRNzol Universal從H1299細(xì)胞中提取總RNA，用酶標(biāo)儀測定其濃度與質(zhì)量，按照PrimeScriptRRT Reagent Kit試劑盒說明將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再經(jīng)過擴(kuò)增后，上機(jī)檢測．GAPDH前引物：5′-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3′，后引物：5′-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3′；SLC44A5前引物：5′-TCAAGTTTGCAGTGATTCAGGC-3′，后引物：5′-TCCTTGGATCACCAAAGTCCTC-3′．

1.2.3 轉(zhuǎn) 染 在6孔板中接種細(xì)胞，待細(xì)胞融合度在60%～80%時將細(xì)胞培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基．將SiRNA干粉于12 000 r/min下離心2 min，使用depc水溶解，制備成最終濃度為20 μmol/L 的儲備液．按細(xì)胞種類，每孔按5～8 pmol 的用量，使用150 μL無血清培養(yǎng)基稀釋SiRNA儲備液；每孔按5～8 μL LipofectamineTM2000用量，使用150 μL無血清培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑．室溫孵育5 min．將稀釋好的SiRNA工作液和轉(zhuǎn)染試劑按1∶1混合．室溫孵育20 min．將混合液加入6孔板中．6 h后換成完全培養(yǎng)基．48 h 后提取RNA用于后續(xù)測定．

1.2.4 低表達(dá)細(xì)胞模型建立 設(shè)計SLC44A5 SiRNA，將篩選后的SLC44A5 SiRNA序列轉(zhuǎn)換成shRNA序列，整合到pLKO-Tet-On載體上，將構(gòu)建好的shSLC44A5質(zhì)粒和pLKO-Tet-On質(zhì)粒包裝成慢病毒，感染野生型H1299和H1792細(xì)胞，使用G418篩選至少3代得到SLC44A5低表達(dá)細(xì)胞系．

1.2.5 Western Blot檢測 用胰蛋白酶消化待提取的目標(biāo)細(xì)胞，按說明書比例加入RIPA裂解液、PMSF、蛋白酶抑制劑，置于冰上孵育10 min，12 000g離心15 min，上清液即為所提取細(xì)胞蛋白．使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，按比例加入4×上樣緩沖液后置于70 ℃金屬浴中煮10 min，然后保存于-20 ℃冰箱．每條泳道加入20 μg蛋白樣品，設(shè)置恒壓80 V跑完濃縮膠后恒壓調(diào)至130 V跑分離膠，隨后切取凝膠上目標(biāo)蛋白條帶轉(zhuǎn)移至甲醇活化過的PVDF膜上，300 mA約70 min恒流轉(zhuǎn)膜，用快速封閉液封閉0.5 h，用TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min，加入一抗(體積1∶1 000稀釋)置于冰箱4 ℃孵育過夜．次日用TBST洗3次膜，每次10 min；室溫下二抗孵育1 h，TBST洗3次膜，每次10 min；隨后將PVDF膜用ECL超敏發(fā)光液避光孵育1 min，置于凝膠成像儀(Bio-Rad，17001402，ChemiDOC MP Imaging System)中顯影．

1.2.6 MTT法檢測 待細(xì)胞生長到對數(shù)生長期時，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，按照每孔1 000個細(xì)胞鋪于96孔板，每種細(xì)胞設(shè)置7組，每組設(shè)置6個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中孵育，分別對應(yīng)檢測1、2、3、4、5、6、7 d的細(xì)胞增殖情況．每隔24 h孵育結(jié)束，在每孔中加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，放入培養(yǎng)箱孵育4 h后，吸去上清，在每孔加入150 μL DMSO，置于96孔板搖床振搖15 min，用酶標(biāo)儀(Tecan，Infinite 200 pro)檢測490 nm波長處的吸光度．

1.2.7 細(xì)胞劃痕實驗 將細(xì)胞接種到6孔板中，待其密度達(dá)到80%～90%時，使用200 μL黃色吸頭去除單層細(xì)胞，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次以去除細(xì)胞碎片，倒置顯微鏡(Olympus公司，U-RFL-T)拍照記錄劃痕距離．培養(yǎng)箱中孵育24 h后拍照觀察細(xì)胞遷移并測定距離．在每個孔中隨機(jī)選3個區(qū)域進(jìn)行分析，通過計算傷口愈合面積百分比來量化細(xì)胞遷移能力．

1.2.8 Transwell細(xì)胞遷移實驗 將細(xì)胞用不含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化，以2.5×104個/mL的密度重懸于不含有FBS的1640培養(yǎng)基中，從中取200 μL置于Transwell 小室(Corning Costar公司)的上隔室且在下隔室中加入含有10% FBS的1640培養(yǎng)基500 μL，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，用棉簽擦去膜上表面的細(xì)胞，將下表面的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，隨后用0.5%結(jié)晶紫溶液染色15 min，PBS清洗多余的結(jié)晶紫，置于倒置顯微鏡下拍照并計算遷移率．

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 使用軟件GraphPad Prism 8.0及Image J對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間差異比較采用t檢驗，以P<0.05 為有顯著性差異．

2 實驗結(jié)果

2.1 SLC44A5在人體內(nèi)表達(dá)情況

通過NCBI公共數(shù)據(jù)庫檢索SLC44A5在全身各器官中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1所示，可以觀察到，雖然SLC44A5在其他組織中表達(dá)量較低或者不表達(dá)，但在胎盤、全腦中相對高表達(dá)．

圖1 SLC44A5在各器官中的表達(dá)

2.2 SLC44A5低表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建

為了驗證SLC44A5與肺腺癌細(xì)胞生長能力和遷移能力之間的關(guān)系，本文按照載體構(gòu)建的方法來構(gòu)建SLC44A5低表達(dá)載體．首先設(shè)計了3組SLC44A5的SiRNA，SiRNA序列見表1．為了篩選SiRNA，將3組SiRNA序列轉(zhuǎn)染到野生型肺腺癌細(xì)胞H1299中．轉(zhuǎn)染48 h后，利用qPCR考察H1299細(xì)胞中SLC44A5的敲降效率R．結(jié)果如圖2(a)所示，Si1序列敲降效率較高，為77%，最終選取該序列為構(gòu)建shRNA敲降載體的候選序列．

表1 SLC44A5 SiRNA序列

隨后分別用濃度為31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000、8 000 μg/mL的G418作用于H1299細(xì)胞，通過MTT法得出72 h時G418對細(xì)胞的殺傷作用，結(jié)果如圖2(b)所示，濃度為2 000、4 000、8 000 μg/mL的G418細(xì)胞存活率V均為10%，組間無顯著差異，因此最終選擇2 000 μg/mL 為合適的G418濃度．

根據(jù)1.2.4實驗方法構(gòu)建SLC44A5低表達(dá)細(xì)胞模型，隨后利用Western Blot檢測4種細(xì)胞中SLC44A5蛋白的表達(dá)情況．結(jié)果如圖2(c)所示，與對照組相比，H1299 shSLC44A5和H1792 shSLC44A5中SLC44A5蛋白表達(dá)量降低了．以上結(jié)果說明，SLC44A5低表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建成功．

圖2 SLC44A5低表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建

2.3 SLC44A5低表達(dá)抑制肺腺癌細(xì)胞增殖能力

為了更直觀地觀察敲低SLC44A5對肺腺癌細(xì)胞的影響，本研究觀察了H1299對照組、H1299 shSLC44A5、H1792對照組、H1792 shSLC44A5的細(xì)胞形態(tài)變化．H1299和H1792為上皮樣細(xì)胞，呈多邊形形狀．結(jié)果如圖3(a)所示，發(fā)現(xiàn)SLC44A5低表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)并未發(fā)生明顯變化，但生長更為分散．

又利用MTT法檢測上述4種細(xì)胞生長7 d的細(xì)胞存活率來驗證SLC44A5是否對肺腺癌細(xì)胞增殖能力產(chǎn)生影響．結(jié)果如圖3(b)所示，與對照組相比，SLC44A5低表達(dá)可以抑制肺腺癌細(xì)胞的生長．

(a) 細(xì)胞形態(tài)

2.4 SLC44A5低表達(dá)抑制肺腺癌細(xì)胞遷移能力

通過細(xì)胞劃痕實驗和Transwell細(xì)胞遷移實驗來檢測SLC44A5對肺腺癌細(xì)胞遷移能力的影響．首先將H1299對照組、H1299 shSLC44A5、H1792對照組、H1792 shSLC44A5接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行細(xì)胞劃痕實驗，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行拍照，比較0 h和24 h后的傷口面積．結(jié)果如圖4(a)所示，SLC44A5低表達(dá)，傷口愈合面積顯著減少．

接著將上述4種細(xì)胞用無血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，接種于小室中(5 000/孔)進(jìn)行Transwell 細(xì)胞遷移實驗，24 h后進(jìn)行拍照對比，比較0 h和24 h后細(xì)胞穿過小室的數(shù)量．結(jié)果如圖4(b)所示，H1299和H1792在敲低SLC44A5的表達(dá)后，穿過小室的細(xì)胞數(shù)量有所減少．

(a) 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果(p為傷口愈合面積百分比)

上述兩個實驗現(xiàn)象都說明了降低SLC44A5的表達(dá)可以抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移．

3 結(jié)果討論

肺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，涉及細(xì)胞生物學(xué)過程中多個重要基因的調(diào)控．已有的研究表明SLC44A1-5家族的獨特膽堿轉(zhuǎn)運體存在于各種人類癌細(xì)胞中[15]，但膽堿轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)模式因癌細(xì)胞類型而異，且SLC44A5敲低的細(xì)胞可通過降低細(xì)胞中凋亡標(biāo)志物caspase-3和caspase-9的表達(dá)水平而表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡，并抑制了侵襲，表明SLC44A5可能是癌癥治療的分子靶點[14]．基于此，通過SLC44A5低表達(dá)細(xì)胞系H1299 shSLC44A5、H1792 shSLC44A5進(jìn)行一系列研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低SLC44A5的表達(dá)可抑制肺腺癌細(xì)胞的生長和遷移能力．因為SLC44A5在肺部表達(dá)量少，如果通過抑制SLC44A5表達(dá)的方式影響肺腺癌細(xì)胞遷移，對正常肺器官造成的影響較?。虼?，針對該靶點設(shè)計藥物，在保證療效的情況下副作用較低，有較好的成藥性．

4 結(jié) 語

本文實驗結(jié)果初步證明，SLC44A5對肺腺癌細(xì)胞的生長和遷移發(fā)揮了重要作用，可能成為臨床肺腺癌的治療靶點．當(dāng)然，SLC44A5在肺腺癌中的作用機(jī)制研究仍然處于探索階段，要想徹底解決肺腺癌的相關(guān)臨床問題，還需要繼續(xù)深入探索．