杜 苗 苗， 金 媛， 昝 帥 君， 顧 晨， 張 宇 晴， 王 競(jìng)*

( 1.大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院， 遼寧 大連 116024；2.國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心， 遼寧 大連 116023 )

0 引 言

軟骨藻酸(domoic acid，DA)主要是由硅藻中的擬菱形藻屬產(chǎn)生的一種興奮性神經(jīng)毒素，是記憶缺失性貝類毒素(ASP)的主要成分，被列為危害人類健康的四大主要海洋生物毒素之一[1]．研究表明，DA可以在貝類、軟體動(dòng)物、魚類、蝦等濾食性生物體內(nèi)富集，并通過海洋食物鏈傳遞給高營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物[2]．誤食受DA污染的海產(chǎn)品會(huì)造成人類、海洋哺乳動(dòng)物以及鳥類神經(jīng)性中毒，引起神經(jīng)壞死和眾多病理性疾病，甚至死亡[3-5]．近年來，產(chǎn)毒擬菱形藻在全球海域暴發(fā)頻次和規(guī)模不斷擴(kuò)大[6-7]．環(huán)境監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，DA毒素廣泛分布于國(guó)內(nèi)外各大海域以及沉積物等環(huán)境介質(zhì)，嚴(yán)重威脅人類健康、生態(tài)安全和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展[8]．

迄今為止，關(guān)于DA的環(huán)境行為和歸趨尚不清晰，目前研究?jī)H局限于DA的光解行為[9-13]．然而，赤潮暴發(fā)過程中富營(yíng)養(yǎng)化的海水表層覆蓋大量的藻華和高等浮游植物，阻礙陽光透射，因此DA光降解作用被大大削弱．事實(shí)上，由于產(chǎn)毒擬菱形藻具有垂直向下遷移的特性，其沉降速率為117～173 m/d，DA不會(huì)積累在海水表層，大部分毒素隨著硅藻海洋雪沉入海底無光區(qū)[14-16]．據(jù)報(bào)道，圣巴巴拉盆地沉積物樣品中溶解態(tài)DA濃度高達(dá)4.19 mg/L[14，17]．因此，生物降解成為海洋環(huán)境中消除DA的重要途徑．鑒于下沉的海洋雪顆粒內(nèi)部以及沉積物-水界面可以形成厭氧微環(huán)境，這為DA的厭氧生物轉(zhuǎn)化提供了天然的場(chǎng)所[18-19]．然而，目前關(guān)于DA厭氧生物轉(zhuǎn)化的研究很少．此外，考慮到自然海洋環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的多樣性，DA的厭氧共代謝生物轉(zhuǎn)化變得復(fù)雜多樣．基于此，本研究以近海沉積物作為海洋微生物來源，以牛血清白蛋白為共代謝基質(zhì)，通過生物富集技術(shù)馴化出具有厭氧共代謝降解DA能力的菌群，命名為BH1．從DA厭氧生物轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)、DA生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鑒定、DA厭氧生物轉(zhuǎn)化途徑以及微生物群落結(jié)構(gòu)組成四個(gè)方面開展研究，為全面了解DA在海洋環(huán)境中的行為和歸趨奠定理論基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 近海沉積物樣品 實(shí)驗(yàn)用近海表層沉積物取自中國(guó)遼寧省大連市大連灣近海海域，樣品混勻備用．

1.1.2 厭氧菌群 實(shí)驗(yàn)所用菌群BH1分離自大連市大連灣近海沉積物．將4 g沉積物(濕重)加入共代謝培養(yǎng)基中混勻，靜置于厭氧箱(25±1) ℃厭氧避光連續(xù)培養(yǎng)，每隔14 d從降解體系中以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量轉(zhuǎn)接到新配制的厭氧培養(yǎng)基．經(jīng)過14個(gè)月的富集，獲得了穩(wěn)定且具有高效厭氧降解DA能力的菌群，命名為BH1．

共代謝培養(yǎng)基：厭氧人工海水中加入50 mg/L牛血清白蛋白和1 mg/L DA，調(diào)節(jié)pH 8.0．人工海水配方(g/L)：23.476 NaCl，10.635 MgCl2·6H2O，3.917 Na2SO4，1.102 CaCl2，0.664 KCl，0.192 NaHCO3，0.096 KBr，0.026 H3BO3，0.04 SrCl2·6H2O和0.003 NaF．人工海水用高純氮曝氣20 min去除氧氣，然后放置于高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min備用．50 g/L牛血清白蛋白儲(chǔ)備液用高溫滅菌、曝氮?dú)獾娜斯ずＫ渲苽溆茫?gòu)買自美國(guó)Enzo公司的1 mg DA標(biāo)準(zhǔn)品固體粉末(95%純度)用滅菌、曝氮?dú)獾某兯渲瞥?0 mg/L 的DA儲(chǔ)備液備用．分別將50 g/L牛血清白蛋白和10 mg/L的DA儲(chǔ)備液用0.22 μm濾膜滅菌后，移取適量體積配制成濃度為50 mg/L牛血清白蛋白和1 mg/L DA的共代謝培養(yǎng)基．培養(yǎng)開始時(shí)，用溶氧儀和氧化還原電位計(jì)分別測(cè)得培養(yǎng)基的溶解氧含量為0 mg/L，氧化還原電位小于-313 mV，以確保菌群培養(yǎng)在嚴(yán)格的厭氧條件下進(jìn)行．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

DA厭氧生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：在25 mL厭氧瓶里加入9 mL共代謝培養(yǎng)基，1 mL菌群BH1培養(yǎng)液，其中DA濃度為1 mg/L，牛血清白蛋白濃度為50 mg/L，反應(yīng)體積為10 mL．DA厭氧生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)在嚴(yán)格的厭氧、25 ℃、避光條件下進(jìn)行，用一次性滅菌的注射器取樣和接種，在厭氧箱內(nèi)操作．固定時(shí)間取樣，用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)DA剩余含量．此外，進(jìn)行了非生物和熱滅活空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，用以考察DA的非生物轉(zhuǎn)化．

1.3 分析方法

1.3.1 軟骨藻酸分析 采用高效液相色譜和二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)檢測(cè)DA濃度．色譜柱為Elite Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm粒徑)；流動(dòng)相采用乙腈(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸)與超純水(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸)混合液，體積比20∶80，流速0.9 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為242 nm．

1.3.2 軟骨藻酸生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析 使用自動(dòng)固相萃取儀(Dionex AutoTrace-280，Thermo Fisher，美國(guó))從產(chǎn)物混合液中萃取DA產(chǎn)物，并用Oasis HLB小柱(6 mL，500 mg，60 μm；Waters，美國(guó))進(jìn)行產(chǎn)物濃縮．取降解中期和末期的產(chǎn)物混合液，用2%甲酸酸化，渦旋混勻后用自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行產(chǎn)物萃?。唧w步驟是萃取小柱首先用2 mL甲醇(含2%甲酸)和2 mL超純水(含2%甲酸)活化；然后，60 mL 2%甲酸酸化后的產(chǎn)物混合液以5 mL/min流速流經(jīng)固相萃取小柱；全部上樣完成后，用1 mL超純水淋洗小柱進(jìn)行脫鹽；隨后將萃取小柱用氮?dú)飧稍? min；最后，用1 mL 90%甲醇水溶液淋洗4次．有機(jī)萃取液用氮吹儀吹至近干，重溶于100 μL超純水，4 ℃ 保存．DA及其生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的固相萃取率為96%±3%．

使用高分辨質(zhì)譜LTQ-Orbitrap XL與Accela HPLC系統(tǒng)(Thermo Scientific，美國(guó))在正離子模式下測(cè)定DA中間產(chǎn)物．色譜柱為Hypersil GOLD C18柱(150 mm×2.1 mm，5 μm粒徑，Thermo Scientific，美國(guó))，通過梯度方法進(jìn)行色譜分離．流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的超純水，流速為0.2 mL/min．液相洗脫梯度如下：在0～10 min內(nèi)流動(dòng)相B的線性梯度從95%下降到88%；在10～15 min內(nèi)流動(dòng)相B的線性梯度從88%下降到80%；在15～20 min內(nèi)流動(dòng)相B的線性梯度從80%下降到50%；在20～25 min內(nèi)流動(dòng)相B保持在50%；在0.1 min內(nèi)流動(dòng)相B梯度迅速?gòu)?0%上升到95%，隨后在95%梯度下保持5 min；進(jìn)樣量為10 μL．在本研究中，所有檢測(cè)到的DA產(chǎn)物均以其相對(duì)分子質(zhì)量命名．HPLC-LTQ-Orbitrap MS檢測(cè)限為1 μg/L．

使用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))，在正離子模式下進(jìn)行DA同分異構(gòu)體定量分析．色譜柱為Hypersil GOLD C18柱(150 mm×2.1 mm，5 μm粒徑)．洗脫液由乙腈(12%)和含0.5%甲酸的超純水(88%)組成，流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣體積為5 μL．DA及其同分異構(gòu)體在SRM模式下進(jìn)行鑒定和定量：母離子m/z為312，子離子m/z為266和161．HPLC-MS/MS檢測(cè)限為0.96 μg/L．

1.3.3 微生物群落分析 為了研究DA厭氧降解過程中微生物群落的組成變化，選取降解中期的微生物樣本進(jìn)行16S rRNA基因高通量測(cè)序．其中添加DA的厭氧共代謝降解體系為軟骨藻酸組；只添加菌群和共代謝基質(zhì)而不添加DA的體系為空白對(duì)照組．采用MP Biomedicals FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒對(duì)微生物菌群樣本的基因組DNA進(jìn)行提取．16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序由北京諾禾致源生物科技有限公司完成，測(cè)序區(qū)域?yàn)閂3-V4區(qū)．

2 結(jié)果與討論

2.1 軟骨藻酸厭氧生物轉(zhuǎn)化特性

本研究考察了DA厭氧生物轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)特性．如圖1所示，在以牛血清白蛋白為共代謝基質(zhì)條件下，經(jīng)過11 d的培養(yǎng)，菌群BH1對(duì)DA厭氧生物轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%．在非生物和熱滅活空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，DA含量未發(fā)生變化，這表明DA的厭氧降解是微生物介導(dǎo)的酶催化反應(yīng)．此外，在前期的DA生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DA不能作為唯一碳源和能源被微生物利用．以上結(jié)果表明，DA可以通過共代謝的方式厭氧轉(zhuǎn)化．基于Ct(DA)/C0(DA)取對(duì)數(shù)，按照準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型將DA厭氧生物轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，擬合度R2值為0.983(見圖2)．結(jié)果表明DA厭氧生物轉(zhuǎn)化符合準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)．DA厭氧生物轉(zhuǎn)化速率常數(shù)為0.099 2 d-1，半衰期為7.0 d．

圖1 菌群BH1厭氧生物轉(zhuǎn)化DA

圖2 準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)線性擬合

2.2 軟骨藻酸厭氧生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鑒定

本研究通過固相萃取技術(shù)濃縮和純化DA產(chǎn)物，并使用HPLC-HRMS/MS鑒定DA厭氧生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物．如圖3所示，DA厭氧生物轉(zhuǎn)化過程中有同分異構(gòu)體生成．DA在C18色譜柱上的保留時(shí)間為13.04 min，m/z=312.143 1(C15H22O6N，[M+H]+)．通過比較DA產(chǎn)物與DA標(biāo)準(zhǔn)品溶液中同分異構(gòu)體在色譜柱上的保留時(shí)間得出，iso-DA E是主要的DA異構(gòu)體產(chǎn)物，保留時(shí)間為11.68 min，m/z=312.143 3，這與之前研究結(jié)果一致[20]．如圖4所示，DA與iso-DA E的HRMS/MS離子碎片主要包括m/z=294.133 1/294.132 2(—H2O)，m/z=276.122 3/276.121 6(—2H2O)，m/z=266.138 2/266.137 5(—H2CO2)，m/z=248.127 7/248.127 0(—(H2CO2+H2O))和m/z=220.132 6/220.132 1(—2H2CO2)．以上結(jié)果表明，在DA厭氧生物轉(zhuǎn)化過程中，存在生物異構(gòu)化途徑．此外，HPLC-MS/MS定量分析結(jié)果表明，經(jīng)過11 d的厭氧降解，70%的DA及其同分異構(gòu)體被生物轉(zhuǎn)化(見圖3)．由此可知，除了異構(gòu)化途徑外，存在其他DA厭氧生物轉(zhuǎn)化途徑．

圖3 厭氧生物轉(zhuǎn)化過程中DA及其同分異構(gòu)體質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

為了探索DA厭氧生物轉(zhuǎn)化途徑，捕捉到一些DA中間產(chǎn)物(見圖4、5及表1)．脫羧產(chǎn)物P267，保留時(shí)間為14.00 min，m/z=268.153 9(C14H22O4N，[M+H]+)，HRMS/MS離子碎片主要包括m/z=250.142 8(—H2O)，m/z=232.132 5(—2H2O)和m/z=222.148 3(—CH2O2)．甲基酮產(chǎn)物P281，保留時(shí)間5.41 min，m/z=282.132 9(C14H20O5N，[M+H]+)，HRMS/MS離子碎片主要包括m/z=264.121 4(—H2O)，m/z=240.121 5(—C2H2O)，m/z=236.126 7(—CH2O2)和m/z=224.090 4(—C3H6O)．小分子產(chǎn)物P215，保留時(shí)間2.48 min，m/z=216.087 1(C9H14O5N，[M+H]+)．在菌群GLY厭氧生物轉(zhuǎn)化DA過程中，同樣捕捉到上述產(chǎn)物P267、P281和P215[20]．由此推測(cè)，菌群BH1厭氧生物轉(zhuǎn)化DA存在脫羧途徑．此外，在菌群BH1厭氧生物轉(zhuǎn)化DA過程中，首次捕捉到脯氨酸環(huán)脫氫產(chǎn)物P309(見圖5)．脫氫產(chǎn)物P309，保留時(shí)間為7.22 min，m/z=310.127 7(C15H20O6N，[M+H]+)，HRMS/MS離子碎片主要包括m/z=274.106 2(—2H2O)，m/z=264.121 9(—CH2O2)，m/z=246.111 1(—(CH2O2+H2O))和m/z=228.100 7(—(CH2O2+2H2O))(見圖4)．據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，DA的主要活性位點(diǎn)包括共軛雙鍵、羧基和脯氨酸環(huán)[9-10，12]．Jin等研究表明，在DA光降解過程中可以發(fā)生脯氨酸環(huán)脫氫反應(yīng)，生成相對(duì)分子質(zhì)量為309的脫氫產(chǎn)物[9]．然而，在DA生物轉(zhuǎn)化過程中，產(chǎn)物P309此前沒有被報(bào)道過．由此推測(cè)，菌群BH1厭氧生物轉(zhuǎn)化DA存在脯氨酸環(huán)脫氫途徑．

(a) DA-HRMS

圖5 DA中間產(chǎn)物HPLC圖

2.3 軟骨藻酸厭氧生物轉(zhuǎn)化途徑

基于已鑒定的DA產(chǎn)物，本研究推測(cè)了DA厭氧生物轉(zhuǎn)化途徑(見圖6)．

如圖6所示，DA厭氧生物轉(zhuǎn)化包括3個(gè)途徑．(1)生物異構(gòu)化．iso-DA E為主要異構(gòu)化產(chǎn)物．由于iso-DA E的毒性低于DA[21]，這可能對(duì)厭氧條件下DA脫毒起重要作用．(2)脯氨酸環(huán)脫氫．由于L-脯氨酸和DA在結(jié)構(gòu)上具有相似性[22]，因此推測(cè)DA厭氧生物轉(zhuǎn)化可能遵循類似的脯氨酸環(huán)脫氫機(jī)理[23]．在脯氨酸脫氫酶的催化下，DA脯氨酸環(huán)上發(fā)生脫氫反應(yīng)生成P309．(3)脫羧途徑．在DA厭氧生物轉(zhuǎn)化過程中，可能通過脫羧酶催化DA脂肪族側(cè)鏈生成脫羧產(chǎn)物P267；在脫氫酶作用下，P267發(fā)生脫氫反應(yīng)，生成甲基酮產(chǎn)物P281；P281進(jìn)一步發(fā)生羧化反應(yīng)和β氧化反應(yīng)，最終生成脫毒產(chǎn)物P215[20]．以上結(jié)果表明，厭氧生物轉(zhuǎn)化是DA的重要脫毒過程．

2.4 軟骨藻酸厭氧降解過程中微生物群落組成變化

本實(shí)驗(yàn)通過Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析了DA厭氧生物轉(zhuǎn)化過程中的微生物群落組成變化．

微生物菌群在門水平分類如圖7所示．空白對(duì)照組主要優(yōu)勢(shì)物種為厚壁菌門，相對(duì)豐度P為99.2%．軟骨藻酸組中主要優(yōu)勢(shì)門包括厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和互養(yǎng)菌門，相對(duì)豐度分別為71.1%、19.4%、3.8%和1.4%．據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，厚壁菌門和擬桿菌門是常見的水解菌．在厭氧發(fā)酵過程中含量豐富，能將蛋白質(zhì)等復(fù)雜的有機(jī)大分子降解為小分子的有機(jī)酸[24]．互養(yǎng)菌門是一類中溫嚴(yán)格厭氧氨基酸及丙酮酸降解菌[25]．變形菌門在厭氧消化中發(fā)揮著重要的代謝功能，許多種群與丁酸鹽、丙酸鹽、乙酸鹽等小分子化合物的利用有關(guān)[26]．由此推測(cè)，厭氧共代謝降解牛血清白蛋白-DA可能是由水解酸化菌驅(qū)動(dòng)的厭氧消化過程．以上結(jié)果表明，厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和互養(yǎng)菌門可能在DA的厭氧共代謝降解中發(fā)揮重要作用．

圖7 微生物菌群在門水平的物種分類

微生物菌群在屬水平分類如圖8所示．空白對(duì)照組主要優(yōu)勢(shì)物種為芽孢桿菌屬和海洋桿菌屬，相對(duì)豐度分別為85.1%和13.7%．軟骨藻酸組主要優(yōu)勢(shì)屬包括瘤胃解蛋白質(zhì)菌屬、脫硫弧菌屬、硫單胞菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬，相對(duì)豐度分別為61.5%、13.3%、3.0%和2.7%．瘤胃解蛋白質(zhì)菌屬具有厭氧降解蛋白胨和氨基酸的功能，主要發(fā)酵產(chǎn)物是乙酸鹽、丙酸鹽和異丁酸鹽[27]．脫硫弧菌屬能以脂肪酸為碳源及能源，將硫酸鹽還原為硫化氫[28]．由此推測(cè)，DA厭氧降解需要不同功能微生物共同作用，混合菌群可以彌補(bǔ)種群功能差異，具有熱力學(xué)優(yōu)勢(shì)．以上結(jié)果表明，優(yōu)勢(shì)物種瘤胃解蛋白質(zhì)菌屬和脫硫弧菌屬對(duì)DA具有良好的耐受性，可能是潛在的DA厭氧降解菌．在以甘氨酸為共代謝基質(zhì)條件下，菌群GLY可以厭氧共代謝生物轉(zhuǎn)化DA，其主要優(yōu)勢(shì)物種為芽孢桿菌屬，相對(duì)豐度為76%[20]．與菌群GLY相比，菌群BH1具有不同的群落組成，其中瘤胃解蛋白質(zhì)菌屬為優(yōu)勢(shì)物種．以上結(jié)果表明不同的共代謝基質(zhì)可以富集不同的微生物，從而存在不同的DA降解菌群．

圖8 微生物菌群在屬水平的物種分類

3 結(jié) 論

(1)以牛血清白蛋白為共代謝基質(zhì)富集的海洋菌群BH1具有厭氧共代謝生物轉(zhuǎn)化DA的能力，1 mg/L DA生物轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%．菌群BH1厭氧生物轉(zhuǎn)化DA符合準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，DA生物轉(zhuǎn)化速率常數(shù)為0.099 2 d-1，半衰期為7.0 d．

(2)通過HPLC-HRMS/MS技術(shù)分析DA生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并首次捕捉到脯氨酸環(huán)脫氫產(chǎn)物P309．基于鑒定的中間產(chǎn)物推測(cè)了DA厭氧生物轉(zhuǎn)化途徑，包括生物異構(gòu)化、脯氨酸環(huán)脫氫及脫羧途徑，表明厭氧生物轉(zhuǎn)化是DA重要脫毒過程．

(3)16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序分析結(jié)果表明，DA的加入導(dǎo)致微生物菌群物種組成發(fā)生明顯變化．其中優(yōu)勢(shì)菌屬瘤胃解蛋白質(zhì)菌屬和脫硫弧菌屬可能在厭氧共代謝生物轉(zhuǎn)化DA過程中發(fā)揮著重要的作用．