李東鋒,葛建雅,王浩彬,何宗亮,金通,于敏莉*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095;2. 南京市畜牧家禽科學(xué)研究所,江蘇 南京 210036; 3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)淮安研究院,江蘇 淮安 223005)

我國是水禽生產(chǎn)和消費(fèi)大國,鴨肉產(chǎn)量占世界70%。鴨肉中脂肪酸熔點(diǎn)低,不飽和脂肪酸多,含有豐富的B族維生素和煙酸,因其口感好、肉質(zhì)鮮美,倍受青睞。我國養(yǎng)鴨的歷史悠久,發(fā)展速度快,擁有優(yōu)良的地方品種資源[1]。家禽的產(chǎn)肉性能是衡量其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要指標(biāo),當(dāng)代家禽養(yǎng)殖業(yè)在追求縮短飼養(yǎng)周期的同時(shí),也為改善肉品質(zhì)做著不懈努力[2]。

北京鴨是我國優(yōu)良的本地品種,經(jīng)系統(tǒng)選育形成專門育肥的肉用型鴨種,其生產(chǎn)性能如生長速度、飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率等指標(biāo)均已達(dá)到世界先進(jìn)水平。但是其為大體型肉鴨品種,存在脂肪沉積速度快、皮脂率高、胸及腿肌率低等不足;且其品質(zhì)較差,僅適用于制作烤鴨或分割鴨,不能滿足人們對(duì)肉鴨品質(zhì)的不斷需求。連城白鴨是我國稀有的地方水禽種質(zhì)資源之一,以“白羽、烏喙和青腳”的性狀而著稱[1]。因該鴨體型小、生長速度慢,利用其為肉鴨生產(chǎn)成本高,不利于大規(guī)模推廣。因此,通過雜交選育小體型優(yōu)質(zhì)肉鴨新品種(系)在我國肉鴨市場具有十分廣闊的前景。為了滿足市場需求,充分挖掘連城白鴨的品種資源優(yōu)勢和全面改良連城白鴨的生長速度和飼料轉(zhuǎn)化率,以優(yōu)質(zhì)地方鴨種連城白鴨(母本)和快大型肉鴨北京鴨(父本)為育種素材應(yīng)用雜交、多代橫交技術(shù)和群體繼代選育方法,經(jīng)過5個(gè)世代的選育,F5資源群體的表觀性狀穩(wěn)定,生長速度提高,肉質(zhì)性狀良好。

肌纖維特性是影響肉品質(zhì)的重要因素,肌纖維直徑與肌肉嫩度負(fù)相關(guān),肌纖維密度與肌肉嫩度正相關(guān)[3]。在實(shí)際育種過程中,育種者大多致力于提高營養(yǎng)水平和肌肉產(chǎn)量來提高生產(chǎn)效率[4]。胚胎期是決定家禽生長發(fā)育的重要時(shí)期,遺傳物質(zhì)和營養(yǎng)環(huán)境共同決定子代生長發(fā)育的表型[5-6]。禽類的肌纖維類型和數(shù)量在胚胎期就已確定,出殼后肌肉的增加主要依賴于肌纖維的肥大和增長[7-8]。研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)物骨骼肌組織的發(fā)育受眾多信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控,且在品種間表現(xiàn)出明顯的差異[7]。目前,鴨骨骼肌發(fā)育在品種間差異及形成機(jī)制的研究較少,有待于進(jìn)一步探究。

已有研究表明DNA 甲基化可參與調(diào)控肌肉組織的發(fā)育過程[9],進(jìn)一步探究骨骼肌發(fā)育與DNA甲基化的關(guān)系,有利于了解骨骼肌發(fā)生過程中關(guān)鍵基因的修飾作用?；蚪MDNA甲基化對(duì)成肌細(xì)胞的程序建立有重要的作用,肌源干細(xì)胞中的低甲基化區(qū)域與增強(qiáng)子型染色質(zhì)相鄰,表明DNA甲基化參與了細(xì)胞特異性增強(qiáng)子的調(diào)控[9]。目前已明確了生肌決定因子(Myf5)超增強(qiáng)子的低甲基化和上游刺激因子1(Usf1)與Myf5超增強(qiáng)子結(jié)合均發(fā)生在肌源性干細(xì)胞的DNA去甲基化過程中[10]。以往研究表明,DNA甲基化對(duì)骨骼肌的發(fā)育有重要的調(diào)控作用,而DNA甲基化的差異是否影響不同品種鴨骨骼肌的發(fā)育和肌纖維特性的形成,仍未可知。

胚胎期骨骼肌發(fā)育對(duì)成體的產(chǎn)肉性能和肉品質(zhì)有巨大的潛在影響[11]。研究發(fā)現(xiàn),骨骼肌的發(fā)育受眾多信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控,且在品種間表現(xiàn)出明顯的差異。目前,有關(guān)鴨骨骼肌發(fā)育在品種間的差異及其形成機(jī)制的研究較少且結(jié)論尚不明確。本研究以北京鴨、連城白鴨和雜交F5資源群體胸肌和腿肌為研究對(duì)象,從肌纖維特性、成肌發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)模式以及基因組甲基化水平變化情況,探討不同品種鴨骨骼肌發(fā)育的差異,從而為優(yōu)質(zhì)肉鴨的生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

本試驗(yàn)所用鴨胚和成年鴨均來自南京市畜牧家禽科學(xué)研究所的種鴨群。在相同的日糧水平和飼養(yǎng)條件下,分別收集大小均勻的北京鴨、連城白鴨和雜交F5資源群體的種蛋各200枚進(jìn)行統(tǒng)一孵化。入孵后24 h設(shè)為1胚齡(embryonic day,E1),分別于14、21、28胚齡(E14、E21、E28)和7周齡(7W)進(jìn)行采樣。每個(gè)時(shí)期采集30個(gè)雄性個(gè)體的胸肌、腿肌,將鴨胚取出后稱重,剝下兩側(cè)的胸肌和腿肌稱重,再將一側(cè)肌肉組織立即放入4%多聚甲醛溶液中固定后用于制作石蠟切片,另一側(cè)肌肉置于液氮中速凍,用于提取DNA和RNA及后續(xù)指標(biāo)的檢測。

1.2 胸肌率和腿肌率的計(jì)算

根據(jù)肌肉組織和胚重計(jì)算胚胎期胸肌率和腿肌率。胚胎期,胸肌率=胸肌重/胚重×100%;腿肌率=腿肌重/胚重×100%;7W,鴨全凈膛率、胸肌重、胸肌率、腿肌重、腿肌率的測定方法參照《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計(jì)方法:NY/T 823—2004》進(jìn)行。胸肌率=胸肌重/全凈膛重×100%;腿肌率=腿肌重/全凈膛重×100%。

1.3 肌纖維組織學(xué)測定

將收集的骨骼肌樣品制作石蠟切片并進(jìn)行HE染色。每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野較好的區(qū)域進(jìn)行圖像采集,對(duì)北京鴨、連城白鴨和F5資源群體胚胎期骨骼肌組織進(jìn)行細(xì)胞核密度指標(biāo)的統(tǒng)計(jì),對(duì)E28、7W北京鴨和F5資源群體的骨骼肌組織進(jìn)行肌纖維密度(MFN)、肌纖維直徑(MFD)和肌纖維橫截面積(CSA)等指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析肌纖維密度、肌纖維直徑和橫切面積。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

采用Trizol試劑提取總RNA,用15 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別檢測RNA樣品質(zhì)量和濃度。取2 μg總RNA,反轉(zhuǎn)錄(RT)為cDNA。qPCR擴(kuò)增采用SYBR GreenⅠ法。反應(yīng)體系:2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1),cDNA模板 2 μL,50×Rox Reference Dye 0.4 μL,加ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 60 s,共35個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s。每次反應(yīng)均設(shè)空白樣品為陰性對(duì)照,設(shè)置3個(gè)重復(fù)。引物序列見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 DNA的dot blot檢測

酚/氯仿法提取肌肉組織基因組DNA,將DNA濃度調(diào)至300 ng·μL-1。在尼龍膜上標(biāo)記并按濃度梯度點(diǎn)樣,室溫干燥后,在紫外交聯(lián)儀上交聯(lián)10 min,紫外光參數(shù)設(shè)置為1 200 J·cm-2。將尼龍膜放入含5% BSA的TBST溶液中室溫封閉1 h,置于一抗[5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)抗體,1∶1 000]稀釋液中,4 ℃孵育過夜。加入含5% BSA的TBST稀釋的二抗(1∶5 000)稀釋液中室溫孵育2 h,將尼龍膜與ECL顯色液充分接觸 1 min 后,暗室顯影并拍照檢測。

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 北京鴨、連城白鴨和F5資源群體骨骼肌質(zhì)量分析

胚胎期,不同品種鴨胸肌、腿肌組織的質(zhì)量差異如圖1所示。在鴨胚胎發(fā)育過程中,北京鴨(P)胸、腿肌肉組織質(zhì)量都顯著高于連城白鴨(L)和F5資源群體(H)的肌肉重(P<0.05)(圖1)。E21后,F5資源群體的胸肌重均顯著高于連城白鴨(P<0.05),而兩者間的腿肌重則無顯著差異(P>0.05)。北京鴨和連城白鴨的胸肌率隨著胚齡的增加而降低,表明胸肌在胚胎后期發(fā)育相對(duì)緩慢;而F5資源群體在E21胸肌率上升隨后下降。在E21,F5資源群體胸肌率和腿肌率均顯著高于連城白鴨(P<0.05)。

圖1 14、21、28胚齡(E14、E21、E28)和7周齡(7W)北京鴨(P)、連城白鴨(L) 和F5資源群體(H)的胸肌重、腿肌重Fig.1 The weight of pectoral muscle and leg muscle of Peking ducks(P),Liancheng white ducks(L) and hybrid F5 populations(H)at 14,21,28 embryo old(E14,E21,E28)and 7 weeks old在各時(shí)間點(diǎn)不同品種間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。The different small letters indicate significant difference in different varieties at each time point(P<0.05). The same below.

在達(dá)到上市日齡(7W)時(shí),北京鴨和F5資源群體的胸肌重、腿肌重、胸肌率和腿肌率差異顯著(圖1)。而在7周齡時(shí),連城白鴨體重較輕,遠(yuǎn)未達(dá)到上市標(biāo)準(zhǔn),本試驗(yàn)未做相關(guān)指標(biāo)檢測。北京鴨的胸肌重和腿肌重均顯著高于F5資源群體;北京鴨胸肌比腿肌重,而F5資源群體腿肌比胸肌重(P<0.05)。北京鴨的胸肌率顯著高于F5資源群體的胸肌率,而腿肌率顯著低于F5資源群體(P<0.05)。

2.2 北京鴨、連城白鴨和F5資源群體的肌纖維特性比較

北京鴨、連城白鴨和F5資源群體胸肌、腿肌組織在胚胎期的肌纖維形態(tài)變化見圖2。胸肌、腿肌的細(xì)胞核密度變化趨勢一致,肌細(xì)胞核密度隨著胚齡的增加而逐漸降低;在E14時(shí),北京鴨胸肌細(xì)胞核密度顯著高于連城鴨和F5資源群體;腿肌的細(xì)胞核密度在E14時(shí)未表現(xiàn)出品種間的差異。在E28時(shí),北京鴨胸肌和腿肌細(xì)胞核密度均顯著高于連城白鴨和F5資源群體(P<0.05)。

圖2 北京鴨(P)、連城白鴨(L)和F5資源群體(H)胚胎期鴨骨骼肌肌纖維 切片圖(A、B)(HE染色)及肌纖維細(xì)胞核密度分析(C、D)Fig.2 Analysis of muscle fiber(A,B)(HE staining)and nuclear density analysis(C,D)of duck skeletal muscle in embryonic stages of Peking ducks(P),Liancheng white ducks(L)and hybrid F5 populations(H)

7周齡時(shí),北京鴨和F5資源群體的胸肌和腿肌肌纖維特性比較如圖3所示。單位面積內(nèi)胸肌肌纖維數(shù)量比腿肌肌纖維數(shù)量多,且單個(gè)胸肌肌纖維橫截面積(CSA)比腿肌肌纖維的小;單位面積內(nèi)北京鴨胸肌、腿肌肌纖維數(shù)量比F5資源群體的少,而北京鴨胸肌、腿肌肌纖維CSA比F5資源群體的大。比較E28和7W北京鴨和F5資源群體的胸肌和腿肌肌纖維CSA、肌纖維密度(MFN)和肌纖維直徑(MFD)的差異,結(jié)果顯示MFN隨著MFD的增加而降低,呈負(fù)相關(guān);CSA隨MFD的增加而變大,呈正相關(guān)。腿肌組織的CSA和MFD均大于胸肌組織,腿肌MFN則顯著小于胸肌MFN(P<0.05)。北京鴨胸肌組織的MFD和CSA高于F5資源群體,但僅在7W表現(xiàn)出品種間的顯著差異(P<0.05);7W時(shí)北京鴨胸肌MFN顯著低于F5資源群體(P<0.05)。北京鴨腿肌MFD和CSA在E28和7W均顯著高于F5資源群體(P<0.05);F5資源群體MFN顯著高于北京鴨(P<0.05)。

圖3 7周齡北京鴨和F5資源群體的胸肌和腿肌組織切片及肌纖維特性分析Fig.3 Cross sections of pectoral muscle and leg muscle of 7W Peking ducks and hybrid F5 populationsA. 切片HE染色圖Pictures of HE staining;B-D. 胸肌肌纖維面積、直徑和密度分析Analysis of cross-sectional area,diameter and density of pectoral muscle fiber. E-G. 腿肌肌纖維面積、直徑和密度分析Analysis of cross-sectional area,diameter and density of leg muscle fiber.

2.3 北京鴨、連城白鴨和F5資源群體肌肉發(fā)育相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

采用RT-qPCR檢測胚胎期北京鴨、連城白鴨和F5資源群體的胸肌和腿肌中Pax7、MRF和MyHCmRNA表達(dá)水平。結(jié)果(圖4)顯示:在3組鴨胸肌組織中,Pax7 mRNA表達(dá)水平在E14時(shí)差異不顯著(P>0.05);E28連城白鴨的胸肌Pax7表達(dá)水平顯著低于北京鴨和F5資源群體(P<0.05)。F5資源群體胸肌中Pax7表達(dá)水平隨胚齡的增加而顯著增加,在E28其表達(dá)水平接近北京鴨的表達(dá)水平。Myf5和MyoD的表達(dá)水平在3組鴨的胸肌組織中均在E21時(shí)達(dá)到高峰,且F5資源群體胸肌中Myf5和MyoD的表達(dá)水平顯著高于北京鴨和連城白鴨(P<0.05)。在E28,Mrf4連城白鴨胸肌中表達(dá)水平較高(P<0.05)。在E14,北京鴨胸肌中MyoG表達(dá)水平最高,隨后在胚胎發(fā)育過程中持續(xù)下降。MyHCmRNA表達(dá)水平在3個(gè)品種鴨的胸肌組織中先升高再降低,在E21時(shí)表達(dá)量最高,且F5資源群體胸肌MyHC表達(dá)水平顯著高于北京鴨和連城白鴨(P<0.05)。

圖4 胚胎期北京鴨(P)、連城白鴨(L)和F5資源群體(H)胸肌(PM)和腿肌(LM)組織中 成肌發(fā)育相關(guān)基因mRNA的表達(dá)Fig.4 mRNA expression of myogenetic genes in pectoral muscle(PM)and leg muscle(LM)of Peking ducks(P), Liancheng white ducks(L)and hybrid F5 populations(H)at embryonic stages

在胚胎期腿肌中,北京鴨腿肌中Pax7表達(dá)水平在E14和E21顯著高于F5資源群體(P<0.05)。Myf5在E21和E28北京鴨腿肌中的表達(dá)水平顯著高于連城白鴨和F5資源群體(P<0.05)。在E28,MyoD在連城白鴨中有較高的表達(dá)水平,顯著高于北京鴨和F5資源群體(P<0.05)。Mrf4的表達(dá)水平在E28表現(xiàn)出最大值,且連城白鴨腿肌Mrf4的表達(dá)水平顯著高于F5資源群體和北京鴨(P<0.05)。在E21,北京鴨腿肌MyoG達(dá)最高的表達(dá)水平,顯著高于其他2組(P<0.05)。北京鴨和連城白鴨腿肌中MyHC在E28時(shí)無顯著差異,但顯著高于F5資源群體(P<0.05)。

圖5 7周齡北京鴨(P)和F5資源群體(H)的胸肌(PM)和腿肌(LM)組織中成肌發(fā)育相關(guān)基因mRNA的表達(dá)Fig.5 mRNA expression of myogenesis genes in pectoral muscle(PM)and leg muscle(LM) of Peking ducks(P)and hybrid F5 populations(H)at 7 weeks old

如圖5所示:7周齡時(shí),北京鴨胸肌和腿肌組織中Pax7和MyoD的表達(dá)水平都顯著高于F5資源群體;北京鴨腿肌中Pax7表達(dá)水平比胸肌高,而F5資源群體胸肌中Pax7表達(dá)水平比腿肌高;MyoD在腿肌中的表達(dá)水平均高于胸肌(P<0.05)。北京鴨胸肌和腿肌中Myf5、Mrf4、MyoG和MyHC的表達(dá)水平均顯著低于F5資源群體;且2個(gè)品種胸肌中Myf5、MyoG和MyHCmRNA的表達(dá)水平都比腿肌高(P<0.05)。

2.4 北京鴨、連城白鴨和F5資源群體肌肉組織中5hmC水平檢測

從圖6可知:在E14時(shí),北京鴨、連城白鴨和F5資源群體胸肌中5hmC水平在品種間差異顯著,F5資源群體5hmC水平最低(P<0.05);在E21時(shí),胸肌中5hmC水平均達(dá)到高峰,且北京鴨和連城白鴨中5hmC水平顯著高于F5資源群體(P<0.05);在E28時(shí),連城白鴨胸肌中5hmC水平仍維持在較高水平,顯著高于北京鴨和F5資源群體(P<0.05)。在腿肌中,F5資源群體5hmC水平在E14和E28時(shí)顯著高于北京鴨和連城白鴨(P<0.05);在E21,連城白鴨腿肌中5hmC的水平最高,顯著高于北京鴨(P<0.05)。在E21,北京鴨、連城白鴨和F5資源群體的骨骼肌組織中全基因組5hmC均有較高水平,表明E21是鴨骨骼肌組織進(jìn)行全基因組去甲基化的重要時(shí)期。7周齡時(shí),北京鴨和F5資源群體胸肌中全基因組5hmC水平未表現(xiàn)出品種間的差異(P>0.05);北京鴨腿肌中5hmC水平顯著低于F5資源群體(P<0.05),這一差異與胚胎期E28時(shí)5hmC的水平相一致。

圖6 北京鴨(P)、連城白鴨(L)和F5資源群體(H)的胸肌(PM)和腿肌(LM)中5hmC水平分析Fig.6 Analysis of 5hmC level in pectoral muscle(PM)and leg muscle(LM)of Peking ducks(P), Liancheng white ducks(L)and hybrid F5 populations(H)DNA dot blot分析胚胎期(A、C)和7周齡(E)北京鴨、連城白鴨和F5資源群體的胸肌和腿肌組織基因組5hmC水平變化DNA dot blot analysis of 5hmC level in pectoral and leg muscle of Peking ducks,Liancheng white ducks and hybrid F5 populations. B、D、F表示胸肌、腿肌組織中5hmC相對(duì)光密度值的定量統(tǒng)計(jì)B,C,D mean quantitative statistics of 5hmC relative value of the optical density in pectoral and leg muscle.

2.5 北京鴨、連城白鴨和F5資源群體骨骼肌中DNA甲基化相關(guān)基因mRNA表達(dá)式

采用RT-qPCR檢測了DNA甲基化相關(guān)基因mRNA在骨骼肌中表達(dá)水平變化。結(jié)果如圖7所示:在E14,北京鴨胸肌中Dnmt1、Dnmt3b、Tet(1～3)mRNA表達(dá)水平顯著高于連城白鴨和F5資源群體(P<0.05);在E28時(shí),連城鴨胸肌組織中Dnmt1、Tet(1～3)基因的表達(dá)水平最高(P<0.05),說明發(fā)生基因組去甲基化過程(P<0.05)。在胚胎期腿肌中,E14北京鴨腿肌中Dnmt1、Dnmt3b、Tet1和Tet3 mRNA表達(dá)水平顯著高于連城白鴨和F5資源群體;在E28,Dnmt1、Dnmt3a和Tet1 mRNA在連城鴨腿肌組織中的表達(dá)水平最高;Tet2 mRNA在胚胎期F5資源群體腿肌組織中的表達(dá)水平最高(P<0.05)。在E21時(shí),Dnmt3bmRNA在連城白鴨胸肌、腿肌中的表達(dá)水平最高(P<0.05)。7周齡時(shí),Tet2 mRNA在北京鴨和F5資源群體的骨骼肌組織中的表達(dá)水平最高,胸肌中的表達(dá)水平高于腿肌(P<0.05)。Dnmt1、Dnmt3a、Tet1、Tet3在北京鴨肌肉組織中的表達(dá)水平比F5資源群體高,且在胸肌中的表達(dá)水平顯著高于腿肌(P<0.05)。Dnmt3b和Tet2 mRNA在F5資源群體胸肌中的表達(dá)水平顯著高于北京鴨(P<0.05)。

圖7 北京鴨、連城白鴨和F5資源群體胸肌(PM)和腿肌(LM)中甲基化調(diào)控相關(guān)基因的mRNA表達(dá)Fig.7 mRNA expression of methylation related genes in pectoral muscle(PM)and leg muscle(LM) of Peking ducks,Liancheng white ducks and hybrid F5 populations

3 討論

不同品種鴨骨骼肌組織的發(fā)育有著獨(dú)特的規(guī)律,胚胎期肌肉組織的生長發(fā)育情況與成年鴨的產(chǎn)肉能力和肉品質(zhì)密切相關(guān)。朱文齊等[8]在不同品種鴨胚胎期骨骼肌發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn),體型相差較大的鴨在胚胎期的胚重、胸肌重和腿肌重已有明顯差異。本研究中,在胚胎期和上市日齡,北京鴨各肌肉組織均重于連城白鴨和F5資源群體,且F5資源群體的胸肌重和腿肌重均比連城白鴨重,這表明北京鴨改良了連城白鴨的低產(chǎn)肉能力。

已有研究表明,在不同品種家禽骨骼肌的肌纖維特性存在很大差異[12]。在相同管理?xiàng)l件下,地方品種雞的肌纖維直徑較小,快大型雞肌纖維直徑較粗,并且遺傳背景的差異還能影響肌纖維的數(shù)量[13]。鴨胚胎胸肌率和腿肌率在不同時(shí)期和品種間的差異較大。通過對(duì)鴨胚胎期胸肌組織的形態(tài)學(xué)觀察,本研究表明E21是肌纖維增殖到融合轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵時(shí)期,這與顧麗紅[14]對(duì)北京鴨胚胎期胸肌發(fā)育的研究結(jié)論一致。張榮萍等[11]在鴨胚胎發(fā)育后期腿肌肌纖維特性的研究中,發(fā)現(xiàn)E21也是腿肌組織發(fā)育的高峰期。

有許多研究已表明肌纖維特性對(duì)肉嫩度有直接影響[14-15]。北京鴨在E11—E26時(shí)期胸肌肌纖維直徑先快速增加再放緩,肌纖維密度變化則相反[16]。本研究結(jié)果顯示,在E28時(shí),北京鴨肌肉的肌纖維密度高于F5資源群體。MFN在胚胎期早已決定成體動(dòng)物的產(chǎn)肉性能[17],張榮萍[18]的研究表明北京鴨的骨骼肌重和肌纖維密度均高于黑鶩鴨。徐蘇微等[12]研究表明家禽肌纖維橫截面積與年齡成正比,肉用型品種肌纖維面積比蛋用型大,快大型品種肌纖維直徑大于慢速型。在本試驗(yàn)中,北京鴨肌肉組織的肌纖維橫截面積(CSA)和肌纖維直徑(MFD)均大于F5資源群體,MFN小于F5資源群體,其中在腿肌組織中的差異更明顯,這表明肌纖維表型性狀在品種間有差異。

研究發(fā)現(xiàn)Pax3/Pax7 基因共同調(diào)控家禽胚胎期骨骼肌發(fā)育和再生[19]。本研究表明,Pax7在E21北京鴨、連城白鴨和F5資源群體骨骼肌中表達(dá)水平較高。7周齡北京鴨Pax7表達(dá)水平顯著高于F5資源群體,揭示Pax7表達(dá)水平在鴨肌肉發(fā)育過程中存在品種差異。生肌調(diào)節(jié)因子(MRF)在胚胎肌肉的形成和成體肌肉的生長有著重要的調(diào)控作用。F5資源群體胸肌中MyoD表達(dá)水平顯著高于連城白鴨;MyoD表達(dá)水平在連城白鴨腿肌中除E21之外的時(shí)間點(diǎn)均顯著高于F5資源群體。這與朱文奇等[8]檢測高郵鴨和金定鴨胚腿肌中MyoD表達(dá)水平在品種間差異較小的結(jié)論不同,可能是由于品種和檢測時(shí)間點(diǎn)不同造成的。Liu等[20]在火雞骨骼肌研究中發(fā)現(xiàn),不同品種、性別和發(fā)育階段胸肌組織中MyoG的表達(dá)量存在差異。本研究中,胸肌中MyoGmRNA在胚胎發(fā)育前期表達(dá)水平較高,后期表達(dá)水平較低,表明E21是胸肌發(fā)育的轉(zhuǎn)折點(diǎn)[21-22]。通過對(duì)鴨胚胸肌的形態(tài)學(xué)分析,初步表明E21是胸肌組織發(fā)育從增殖轉(zhuǎn)化為融合的關(guān)鍵時(shí)期,此時(shí)鴨胚胸肌發(fā)育最快[22]。Fujisawa-Sehara等[23]發(fā)現(xiàn)Mrf4在出生后和成體哺乳動(dòng)物的紅、白肌中維持較高的表達(dá)水平。在本試驗(yàn)中,7周齡北京鴨和F5資源群體胸肌和腿肌組織中Mrf4 mRNA均有較高的表達(dá)水平。

TET酶和5hmC修飾已成為基因表達(dá)的關(guān)鍵激活因素,導(dǎo)致DNA去甲基化和基因活化[24]。Koh等[25]的研究表明,TET通過調(diào)控譜系特異性基因在維持細(xì)胞多能性中起重要作用,而TET及其5hmC產(chǎn)物在成體干細(xì)胞和體細(xì)胞組織中具有相反作用[26]。Liu等[27]研究發(fā)現(xiàn)Tet2的表達(dá)是平滑肌細(xì)胞分化所必需的,同時(shí)Tet2激活的基因啟動(dòng)子區(qū)域富含5hmC標(biāo)記,導(dǎo)致強(qiáng)烈的基因激活。Tet2參與5hmC的產(chǎn)生和DNA去甲基化,在成肌細(xì)胞和肌管中顯著上調(diào)[28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在鴨胚和成年鴨的肌肉組織中,Tet2基因mRNA表達(dá)水平最高,且Tet2在F5資源群體的肌肉組織中表達(dá)水平顯著高于北京鴨。Dnmts家族對(duì)甲基標(biāo)記的起始和維持起著嚴(yán)格的調(diào)控作用[29],肌肉組織中Dnmt1的缺失降低了肌細(xì)胞的分化能力[30-31]。DNA甲基化通過對(duì)肌生成轉(zhuǎn)錄因子MyoD的調(diào)控來調(diào)節(jié)肌肉的發(fā)育[32]。本試驗(yàn)中,Dnmt1基因在肌肉組織中表達(dá)水平較低;在E21時(shí),Dnmt3a基因在骨骼肌組織中的表達(dá)水平相對(duì)較高,7周齡北京鴨腿肌中Dnmt3a表達(dá)水平相對(duì)較高。北京鴨、連城白鴨和F5資源群體的胸肌、腿肌中全基因組5hmC在E21均有較高表達(dá)水平,這表明E21是鴨骨骼肌組織進(jìn)行全基因組去甲基化的重要時(shí)期。這些結(jié)果表明,Tet2在骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮重要作用,推測DNA去甲基化在品種間的水平存在差異,這可能導(dǎo)致不同品種鴨的骨骼肌發(fā)育存在差異。

禽類肌纖維的數(shù)量早在出殼前就已決定,在成肌發(fā)生過程中,DNA甲基化修飾對(duì)肌細(xì)胞的成活起決定作用。本研究發(fā)現(xiàn)胚胎期北京鴨骨骼肌組織發(fā)育顯著快于連城白鴨和F5資源群體,表明骨骼肌的差異在胚胎期就有體現(xiàn);北京鴨、連城白鴨和F5資源群體中調(diào)控肌肉發(fā)育的相關(guān)基因在品種間表達(dá)水平不同;DNA甲基化水平在不同品種間存在顯著差異,這種差異可能是導(dǎo)致不同品種鴨肌肉發(fā)育存在差異的原因,具體的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。