林藝靈,劉眾杰,王子誠,楊毓賢,王令宇,張川,王晨,賈海鋒,盧素文,房經(jīng)貴,上官凌飛

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/江蘇省果樹品種改良與種苗繁育工程中心,江蘇 南京 210095)

葡萄(Vitisvinifera)在生長發(fā)育的過程中容易受到生物及非生物脅迫的影響,導(dǎo)致其果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)下降。同源異型盒(homeobox,HB)基因家族在動植物發(fā)育中具有許多調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子,廣泛存在于真核生物中。HB基因在植物組織器官發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境脅迫應(yīng)答等生理過程中起重要作用[1]。因此,對葡萄HB基因的全基因組鑒定,并對其序列特征、進(jìn)化特征和表達(dá)特性進(jìn)行分析,有利于進(jìn)一步研究HB基因的功能。

HB基因中有一段核苷酸序列較為保守,其編碼的約60個氨基酸序列經(jīng)折疊形成同源異型盒結(jié)構(gòu)域(HD)[2]。HB基因首次在果蠅的同源突變體中被鑒定出,隨后在人類和真菌中也被發(fā)現(xiàn)[3]。植物HB基因的研究起步較晚,1991年第1個植物HB基因在玉米中被克隆[4]。根據(jù)蛋白質(zhì)序列進(jìn)化分析,植物HB家族被分為14類:HD-ZIPⅠ、HD-ZIP Ⅱ、HD-ZIP Ⅲ、HD-ZIP Ⅳ、KNOX、BEL、PLINC、WOX、DDT、PHD、NDX、LD、PINTOX和SAWADEE,不同類別的成員具有不同結(jié)構(gòu)和功能[4]。其中,HD-ZIPⅠ類成員參與光信號轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)控植物某些發(fā)育過程及響應(yīng)非生物脅迫[5-6]。HD-ZIP Ⅱ類成員誘導(dǎo)植物的避蔭反應(yīng)并增強(qiáng)細(xì)胞生長,HD-ZIP Ⅲ類成員影響側(cè)器官極性發(fā)育和莖尖分生組織的形成,而HD-ZIP Ⅱ和HD-ZIP Ⅲ還能相互作用調(diào)節(jié)植物生長激素[7-9]。HD-ZIP Ⅳ成員會影響玉米的毛狀體發(fā)育和花藥形成[10]。PLINC蛋白在非生物脅迫響應(yīng)中起到重要作用[11]。KNOX類成員影響莖尖分生組織的維持,并與BEL相互作用調(diào)節(jié)激素穩(wěn)態(tài)[12-13]。WOX類成員能夠促進(jìn)根系伸長提高耐旱性,并植物胚胎發(fā)育中起到重要作用[14-15]。值得注意的是,葡萄WOX4能夠在冬、夏芽形成以及莖、側(cè)枝、花序和體細(xì)胞胚中發(fā)揮作用[16]。上述研究表明HB基因家族在植物生長發(fā)育過程中起到至關(guān)重要的作用。

目前,在植物基因組中許多HB基因的功能尚未明確。關(guān)于植物HB基因的研究主要集中在擬南芥和水稻上,雖然在葡萄中已有對HB基因家族的初步分析[17],但是關(guān)于進(jìn)化和表達(dá)分析較少,HB基因家族作為非生物脅迫下作物改良的潛在候選者,在作物改良方面具有非常大的潛力。本研究使用生物信息學(xué)方法鑒定葡萄HB基因家族,并且系統(tǒng)分析了其蛋白理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位及進(jìn)化表達(dá)特征,以及在不同芽休眠階段、果實(shí)生長及非生物脅迫下的時空表達(dá)特異性。進(jìn)一步分析HB基因可能存在的生物學(xué)功能,以期為HB基因不同成員在植物生長發(fā)育過程和逆境脅迫方面的功能鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

使用本實(shí)驗室構(gòu)建的‘陽光玫瑰’葡萄基因組數(shù)據(jù)(待發(fā)表),從TAIR(https://www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站下載擬南芥(Arabidopsisthaliana)HB基因家族序列。

1.2 葡萄HB基因家族成員的鑒定

以擬南芥HB基因序列為靶序列,利用BLASTp檢索出葡萄基因組中的HB候選序列,用隱馬爾可夫模型(HMM)進(jìn)一步證實(shí)葡萄HB基因結(jié)構(gòu)域(PF00046、PF02183),E值為e-5[18]。檢索后的序列利用CDD在線工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行檢索,篩選保留具有HB相關(guān)結(jié)構(gòu)域的序列,獲得葡萄HB基因家族成員。將獲得的VvHB基因家族蛋白序列提交至ExPASY(http://web.expasy. org/protparam/),預(yù)測其長度、相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)。采用TargetP-2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.3 葡萄HB基因在染色體上的分布

利用TBtools軟件從葡萄基因組注釋信息文件中提取HB基因家族位置信息[19],并用MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)繪制染色體定位圖[20]。

1.4 葡萄HB基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

通過ClustalW對葡萄和擬南芥HB基因家族成員進(jìn)行多序列比對,手動刪除同源性差異較大的序列。利用MEGA X軟件,以鄰近法(Neighbour-joining,NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹,自展法系數(shù)(Bootstrap)設(shè)置為1 000[21]。

1.5 葡萄HB基因結(jié)構(gòu)和所編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

葡萄HB基因家族內(nèi)含子和外顯子信息依據(jù)葡萄基因組注釋信息文件GFF。采用MEME在線網(wǎng)站(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)預(yù)測HB家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域,基序數(shù)量設(shè)置為15個,并利用TBtools軟件進(jìn)行可視化。

1.6 葡萄HB基因家族共線性和選擇壓力分析

使用MCScanX軟件對葡萄HB家族及葡萄和擬南芥進(jìn)行共線性預(yù)測,并將HB基因家族中具有顯著共線性的成員標(biāo)注出來。此外,利用TBtools軟件對具有共線性的HB基因家族成員進(jìn)行Ka/Ks(進(jìn)化選擇壓力)計算。

1.7 葡萄HB基因家族啟動子順式作用元件以及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測分析

利用PlantCARE在線網(wǎng)站對葡萄HB基因家族ATG上游2 000 bp的啟動子序列進(jìn)行預(yù)測,并下載文件簡化整理,進(jìn)行可視化。

利用String(https://www.string-db.org/cgi/network)網(wǎng)站,以葡萄HB基因家族氨基酸序列為查詢序列,設(shè)置置信度為0.700,構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測分析。

1.8 葡萄HB基因的表達(dá)特性分析

根據(jù)已有的葡萄轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)進(jìn)行葡萄HB基因家族在不同條件下表達(dá)情況分析,具體數(shù)據(jù)包括芽休眠(登錄號:SRP159132)、果實(shí)發(fā)育(GSE77218)、澇害脅迫(SRP070475)、干旱脅迫(SRP074162)、鹽脅迫(SRP070475)和銅脅迫[22]。不同版本基因ID號利用BLAST軟件比對后進(jìn)行轉(zhuǎn)換,根據(jù)ID號從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取HB基因在不同條件下的表達(dá)信息,使用TBtools繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄HB基因家族的鑒定及其所編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

由表1可見:初步鑒定出葡萄中共80個HB基因家族成員,根據(jù)其在染色體上的分布,將其命名為VvHB1—VvHB80。葡萄HB基因家族成員的氨基酸數(shù)量和相對分子質(zhì)量差異較大。氨基酸數(shù)量為66～1 772,其中蛋白長度最長的是VvHB47,最短的是VvHB37。相對分子質(zhì)量為(8.28～198.55)×103,最大的是VvHB47,最小的是VvHB37。等電點(diǎn)(pI)為4.60～10.03,有80%的成員pI小于7.00,說明其可能是一類酸性蛋白。所有成員均無信號肽,說明其不屬于分泌蛋白。將序列上傳至TargetP-2.0網(wǎng)站,發(fā)現(xiàn)有11個成員(VvHB9、VvHB16、VvHB39、VvHB42、VvHB45、VvHB48、VvHB50、VvHB57、VvHB60、VvHB70、VvHB75)定位在葉綠體上,有5個成員(VvHB12、VvHB20、VvHB33、VvHB65、VvHB73)定位在線粒體上。

表1 葡萄HB基因家族蛋白理化性質(zhì)分析Table 1 Physicochemical properties of HB gene family proteins in Vitis vinifera

續(xù)表1 Table 1 continued

續(xù)表1 Table 1 continued

2.2 葡萄HB基因家族染色體定位分析

根據(jù)葡萄HB基因家族在染色體上的位置信息,80個基因家族成員共定位在18條染色體上(Chr01—Chr04,Chr06—Chr19)(圖1)。其中18號染色體上分布的成員最多為10個,其余染色體上為2～7個成員。絕大部分成員分布在染色體的中上端或者下端。另外,8號染色體上的VvHB29和VvHB30這2個成員位置相近并且序列一致,推測是由于基因間的串聯(lián)重復(fù)引起的。

圖1 葡萄HB基因家族染色體定位分析Fig.1 Chromosome localization of HB gene family in V.vinifera

2.3 葡萄HB基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了解葡萄和擬南芥HB基因家族間的進(jìn)化關(guān)系,構(gòu)建了擬南芥、葡萄HB基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。參考擬南芥HB基因家族分類和葡萄HB基因家族自身蛋白結(jié)構(gòu)域,將其分為9個亞家族。其中HD-ZIPⅠ、HD-ZIP Ⅳ包含葡萄HB基因家族成員最多,為15個,說明HD-ZIP是HB基因家族的主要類別。最少的為PHD亞家族,只有2個成員。HB基因家族成員數(shù)比較分析發(fā)現(xiàn),HD-ZIPⅠ、HD-ZIP Ⅱ、HD-ZIP Ⅳ、BEL和KNOX亞家族數(shù)與擬南芥數(shù)相似,分別為15、7、15、12和9個;WOX亞家族數(shù)與擬南芥相比明顯較少為11個。HD-ZIP Ⅲ、DDT、PHD亞家族數(shù)目與擬南芥一致,分別為5、4、2個,證明這幾個亞家族在葡萄基因組中沒有大范圍變化。

圖2 擬南芥和葡萄HB基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of HB gene families in Arabidopsis thaliana and V.viniferaHD-ZIPⅠ:調(diào)節(jié)子葉發(fā)育和藍(lán)光信號傳導(dǎo);HD-ZIP Ⅱ:避蔭反應(yīng)、調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和分生組織功能;HD-ZIP Ⅳ:頂端分生組織的形成、調(diào)節(jié)花器官的正常發(fā)育;KNOX:分生組織的維持;BEL:調(diào)節(jié)激素穩(wěn)態(tài);PHD:調(diào)節(jié)非生物脅迫;HD-ZIP Ⅲ:葉片和胚胎的頂端分生組織形成;DDT:未知;WOX:早期胚胎分化、干細(xì)胞維持和器官形成。HD-ZIPⅠ:Regulation of cotyledon development and blue light signaling conduction;HD-ZIP Ⅱ:Shade avoidance response,regulation of embryo development and meristem function;HD-ZIP Ⅳ:Formation of apical meristem,regulation of normal development of floral organs;KNOX:Meristem maintenance;BEL:Regulation of hormone homeostasis;PHD:Regulation of abiotic stress;HD-ZIP Ⅲ:Apical meristem formation of leaf blade and embryo;DDT:Unknown;WOX:Early embryo differentiation,stem cell maintenance and organ formation.

2.4 葡萄HB基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

由圖3可知:HB基因結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,葡萄HB成員均包含外顯子,數(shù)量為1～20個。每個葡萄HB成員都有CDS區(qū)域,但有21個成員不含有UTR區(qū)域。HD-ZIP Ⅱ家族的外顯子數(shù)量為4～5個,且外顯子和內(nèi)含子的排列規(guī)律相同,為外顯子—內(nèi)含子—外顯子,說明這個亞家族相對而言比較保守。此外,由于基因長度差異較大,不同分支的內(nèi)含子和外顯子的分布位置和數(shù)目差異也較大,推測其功能也會有所差別。

使用CDD對HB基因家族蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測,每個成員都包含HD結(jié)構(gòu)域。80個成員含有30種結(jié)構(gòu)域,除HD結(jié)構(gòu)域外,同源異型盒相關(guān)亮氨酸(HALZ)結(jié)構(gòu)域數(shù)量最多,其被認(rèn)為是介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域。KNOX結(jié)構(gòu)域抑制靶基因表達(dá),START結(jié)構(gòu)域抑制細(xì)胞根毛形成。亮氨酸拉鏈(bZIP)結(jié)構(gòu)域是包含介導(dǎo)序列特異性DNA結(jié)合的堿性區(qū)域和二聚化所需的亮氨酸拉鏈區(qū)域的蛋白質(zhì)。bZIP轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)節(jié)病原體防御、光和脅迫信號以及種子成熟等過程。不同亞家族所包含的結(jié)構(gòu)域不同,說明HB基因家族功能的多樣性。

圖3 葡萄HB基因結(jié)構(gòu)及其所編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 HB gene structure and the conserved domains of the encoded proteins in V.vinifera

2.5 葡萄HB基因家族共線性和選擇壓力分析

通過MCScanX分析葡萄HB基因家族的共線性關(guān)系,結(jié)果(表2和圖4)表明葡萄HB基因家族存在 2對串聯(lián)重復(fù)基因(VvHB29、VvHB30與VvHB75、VvHB76)和23對共線性基因。在擬南芥和葡萄間存在82對共線性關(guān)系。Ka/Ks表示2個蛋白編碼基因的非同義替換率(Ka)和同義替換率(Ks)之間的比例,Ka/Ks反映物種進(jìn)化的驅(qū)動力,在探究物種起源方面具有重要意義。當(dāng)Ka/Ks>1,說明基因受正向選擇(positive selection);當(dāng)Ka/Ks=1,基因中性進(jìn)化(neutral evolution),沒有受到選擇壓力;當(dāng)Ka/Ks<1,基因受純化選擇(purify selection)。Ka/Ks計算結(jié)果表明,Ka/Ks的值遠(yuǎn)小于1,說明其在進(jìn)化過程中受純化選擇影響。

表2 葡萄HB基因家族共線性關(guān)系及非同義替換率(Ka)和同義替換率(Ks)Table 2 Collinearity of HB gene family and non-synonymous replacement rate(Ka)and synonymous replacement rate(Ks)in V.vinifera

圖4 葡萄HB基因共線性分析Fig.4 Collinearity analysis of HB gene in V.viniferaChr01—Chr19表示19條葡萄染色體,At1—At5表示5條擬南芥染色體。Chr01-Chr19 represent 19 chromosomes in V.vinifera,and At1-At5 represent 5 chromosomes in A.thaliana.

圖5 葡萄HB基因家族啟動子順式作用元件分布Fig.5 The cis-element distribution of HB gene family promoter in V.vinifera光響應(yīng)元件:3-AF1 binding site、4cl-CMA2b、AAAC-motif、ACE、AE-box、AT1-motif、ATC-motif、ATCT-motif、Box 4、Box Ⅱ、CAG-motif、chs-CMA1a、chs-CMA2a、chs-CMA2c、chs-Unit 1 m1、G-Box、GA-motif、Gap-box、GATA-motif、GATT-motif、GT1-motif、GTGGC-motif、I-box、L-box、LAMP-element、sbp-CMA1c、LS7、Sp1、TCCC-motif、TCT-motif、MRE;植物激素響應(yīng)元件:脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、赤霉素響應(yīng)元件(GARE-motif、P-box、TATC-box)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif、TGACG-motif)、水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element、SARE)、生長素響應(yīng)元件(TGA-element、AuxRR-core、AuxRE);壓力響應(yīng)元件:低溫響應(yīng)元件(LTR)、干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)(MBS)、生物脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)、機(jī)械傷害響應(yīng)元件(WUN-motif)、缺氧響應(yīng)元件(ARE、GC-motif);不同組織部位響應(yīng)元件:胚乳表達(dá)元件(GCN4_motif)、分生組織表達(dá)元件(CAT-box)、種子特異性調(diào)控(RY-element)、根特異性元件(motif I)。Light-responsive elements:3-AF1 binding site,4cl-CMA2b,AAAC-motif,ACE,AE-box,AT1-motif,ATC-motif,ATCT-motif,Box 4,Box Ⅱ,CAG-motif,chs-CMA1a,chs-CMA2a,chs-CMA2c,chs-Unit 1 m1,G-Box,GA-motif,Gap-box,GATA-motif,GATT-motif,GT1-motif,GTGGC-motif,I-box,L-box,LAMP-element,sbp-CMA1c,LS7,Sp1,TCCC-motif,TCT-motif,MRE;Plant hormone response elements:Abscisic acid response element(ABRE),gibberellin response element(GARE-motif,P-box,TATC-Box),methyl jasmonate response element(CGTCA-motif,TGACG-motif),salicylic acid response element(TCA-element,SARE),auxin response element(TGA-element,AUXRR-Core,AuxRE);Pressure response elements:Low temperature response element(LTR),drought-induced MYB binding site(MBS),biological stress response element(TC-rich repeats),mechanical damage response element(WUN-motif),hypoxia response element(ARE,GC-motif);Different tissue response elements:Endosperm expression element(GCN4_motif),meristem expression element(CAT-box),seed specific regulation(RY-Element),root specific element(motif I).

2.6 葡萄HB基因家族啟動子順式作用元件分析

為了進(jìn)一步了解葡萄HB基因家族的功能,對葡萄HB基因家族上游2 000 bp的啟動子序列進(jìn)行順式作用元件分析。將葡萄HB基因家族啟動子主要的順式作用元件分為光響應(yīng)、激素響應(yīng)、非生物和生物脅迫以及不同組織部位4大類(圖5)。其中,所有的葡萄HB基因家族均包含大量光響應(yīng)元件,說明HB基因家族可能參與光信號途徑調(diào)控植物光形態(tài)建成。在啟動子序列中都含有至少一個激素相關(guān)響應(yīng)元件,如ABRE、P-box、CGTCA、SARE、TGA等,它們分別參與脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸(SA)和生長素(IAA)的應(yīng)答,說明HB基因家族可能通過激素途徑緩解逆境脅迫。除VvHB65外,其他成員均可參與非生物與生物脅迫響應(yīng)。其中只有VvHB8、VvHB10含有創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的元件,提示其可能在葡萄受到創(chuàng)傷時發(fā)揮作用。此外,有56%的成員含有胚乳發(fā)育、分生組織等不同組織部位的響應(yīng)元件。說明葡萄HB基因家族成員廣泛參與葡萄生長發(fā)育與逆境脅迫等多個過程。

2.7 葡萄HB家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測分析

由圖6可見:在80個成員中,有20個成員表現(xiàn)出高置信度(>0.700)。該網(wǎng)絡(luò)由20個樞紐基因和 31個邊構(gòu)成。VvHB39能夠與VvHB18、VvHB71、VvHB76、VvHB7、VvHB13、VvHB32及VvHB50發(fā)生互作,表明KNOX與WOX和BEL亞族有很強(qiáng)的互作關(guān)系。此外,STM和WUS互作調(diào)控擬南芥芽分生組織,提示屬于KNOX亞家族的VvHB39、VvHB71能夠與WOX亞家族的VvHB18發(fā)生互作影響葡萄芽的生長發(fā)育[23]。另外,KNOX與BEL亞家族成員間互作關(guān)系最為密切。

圖6 葡萄HB蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測Fig.6 Prediction of HB protein interaction network in V.vinifera

2.8 葡萄HB基因家族在芽休眠、果實(shí)發(fā)育過程中以及不同非生物脅迫下的表達(dá)分析

葡萄芽休眠轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SRP159132)分析發(fā)現(xiàn),在80個葡萄HB基因中,有66個基因在芽休眠過程中差異表達(dá)。由圖7可見:2個基因(VvHB31、VvHB64)在芽休眠期間顯著表達(dá),有超過半數(shù)的基因(44個)在3月或者4月表達(dá)量達(dá)到最高,13個基因在1、2月表達(dá)量最高,其余9個基因在11、12月表達(dá)量最高。近83%的HB基因在芽休眠過程中顯著差異表達(dá),并且絕大部分基因在3、4月表達(dá)量達(dá)到最高,提示HB基因家族在抗低溫脅迫中發(fā)揮作用。

對葡萄果實(shí)發(fā)育不同階段的數(shù)據(jù)(GSE77218)進(jìn)行分析,結(jié)果(圖7)表明:有23個基因(VvHB11、VvHB15、VvHB19、VvHB23、VvHB24、VvHB26、VvHB27、VvHB32、VvHB34、VvHB4、VvHB41、VvHB43、VvHB48、VvHB5、VvHB53、VvHB58、VvHB63、VvHB65、VvHB69、VvHB7、VvHB77、VvHB8、VvHB9)在果實(shí)膨大期顯著表達(dá),在轉(zhuǎn)色和成熟期下調(diào)表達(dá);4個基因(VvHB60、VvHB61、VvHB73、VvHB76)在果實(shí)膨大期下調(diào)表達(dá),在轉(zhuǎn)色和成熟時期顯著表達(dá);VvHB30、VvHB54在果實(shí)發(fā)育和成熟階段下調(diào)表達(dá),而在轉(zhuǎn)色階段上調(diào)表達(dá)。此外,有4個基因(VvHB5、VvHB26、VvHB58、VvHB60)在整個果實(shí)生長發(fā)育階段都有差異表達(dá),說明它們可能在果實(shí)成熟過程中具有多種作用。已有研究報道BEL、WOX亞家族中多個HB基因參與調(diào)節(jié)果實(shí)大小、發(fā)育和成熟[24],提示HB基因家族在葡萄發(fā)育成熟階段可能發(fā)揮多種潛在作用。

由圖7可見:在干旱脅迫下,80個HB基因家族成員中共發(fā)現(xiàn)64個差異表達(dá)基因,其中有37個成員上調(diào)表達(dá),27個成員下調(diào)表達(dá)。在鹽脅迫下,有5個基因成員差異表達(dá),且全部上調(diào)表達(dá)。在澇害下,有29個基因成員差異表達(dá),17個上調(diào)表達(dá),12個下調(diào)表達(dá)。在銅脅迫下,有9個差異表達(dá)基因,其中5個上調(diào)表達(dá),4個下調(diào)表達(dá)?？傊?HB基因家族響應(yīng)干旱脅迫的數(shù)量明顯多于澇害脅迫、銅脅迫和鹽脅迫。有32個成員僅在干旱脅迫下有差異表達(dá),19個成員(VvHB27、VvHB2、VvHB7、VvHB12、VvHB15、VvHB16、VvHB23、VvHB20、VvHB24、VvHB36、VvHB40、VvHB42、VvHB45、VvHB47、VvHB50、VvHB52、VvHB53、VvHB69、VvHB80)上調(diào)表達(dá),13個成員(VvHB13、VvHB17、VvHB18、VvHB21、VvHB33、VvHB77、VvHB59、VvHB64、VvHB68、VvHB70、VvHB72、VvHB74、VvHB75)下調(diào)表達(dá)。此外,VvHB9和VvHB34能夠響應(yīng)多種非生物脅迫。VvHB9在不同非生物脅迫下均上調(diào)表達(dá),而VvHB34在鹽脅迫、澇害脅迫和銅脅迫中上調(diào)表達(dá),在干旱脅迫中下調(diào)表達(dá)。

3 討論

HB基因家族廣泛存在于植物中,參與植物各種發(fā)育過程、信號調(diào)控和逆境脅迫響應(yīng)。目前,HB基因家族在許多植物中被鑒定,其中擬南芥110個、水稻107個、楊樹148個、鷹嘴豆89個[25-26]。本研究從葡萄中鑒定出80個HB基因家族成員,相對于其他植物較少,說明葡萄HB可能在進(jìn)化過程中發(fā)生了基因缺失,基因丟失可能是進(jìn)化中強(qiáng)大的力量,表明單個同源盒基因的丟失與形態(tài)簡化有關(guān)[27]。利用葡萄HB蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,可將其分為9個亞族,與擬南芥相比缺少了PLINC、NDX、LD、PINTOX和 SAWADEE類成員。而其在水稻、油菜中也僅被分為10個和9個亞族,說明HB基因家族可能在不同物種的進(jìn)化過程中出現(xiàn)基因分化,從而行使新的功能[26,28]。HB基因家族的蛋白大小為66～1 772個氨基酸,相對分子質(zhì)量為(8.28～198.55)×103,等電點(diǎn)為4.60～10.03,說明其蛋白大小等特征差異較大,這與豆科植物中的研究結(jié)果類似[18]。80條葡萄HB成員不均勻分布在18條染色體上。內(nèi)含子和外顯子的缺失和獲得會導(dǎo)致功能上的差異,有助于基因功能的多樣化。通過基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),葡萄HB基因家族中有 68個成員的內(nèi)含子少于10個,有12個成員超過10個?？傮w而言同一類中的內(nèi)含子數(shù)目比較相似,表明它們中的大多數(shù)可能具有共同的進(jìn)化起源。HD-ZIPⅠ類成員內(nèi)含子為0～3個、HD-ZIP Ⅱ類成員內(nèi)含子為2～3個,HD-ZIP Ⅲ類成員的內(nèi)含子為17個,且明顯多于HD-ZIPⅠ、HD-ZIP Ⅱ、HD-ZIP Ⅳ類成員,這與桃中HD-ZIP家族的規(guī)律相似,說明其比較保守[29]。BEL、KNOX類內(nèi)含子為3～5個,WOX、DDT、PHD、HD-ZIP Ⅳ類內(nèi)含子數(shù)量不均。對葡萄HB的重復(fù)事件預(yù)測分析發(fā)現(xiàn),葡萄HB基因家族存在2對串聯(lián)重復(fù)基因和23對片段重復(fù)基因,說明HB基因家族成員的擴(kuò)增主要以片段重復(fù)為主。葡萄和擬南芥的共線性分析結(jié)果顯示,擬南芥和葡萄存在82對共線性基因?qū)?推測具有共線性關(guān)系的成員間具有相似的功能。

研究表明,HB基因家族參與植物多種生長發(fā)育過程。WOX13影響擬南芥果實(shí)發(fā)育,LeHB-1與番茄果實(shí)的發(fā)育和成熟有關(guān),HD-ZIP Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控桃乙烯生物合成[30-31]。WOX類成員Vv19、Vv69等68個HB基因在葡萄果實(shí)發(fā)育中表達(dá)差異顯著,也說明HB基因家族在葡萄果實(shí)發(fā)育成熟期具有顯著作用。對葡萄HB家族啟動子上游序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其廣泛存在激素響應(yīng)和非生物脅迫響應(yīng)的元件。在澇害脅迫下基因表達(dá)量高的往往包含多種激素相應(yīng)元件。ATHB2可以增加ABA的敏感性,ATHB6是ABA信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子,VvHB9、VvHB4分別與ATHB2、ATHB6親緣關(guān)系最近,推測其能夠通過調(diào)節(jié)ABA信號通路來響應(yīng)逆境脅迫[32-33]。37個含有LTR響應(yīng)元件的HB基因家族成員在芽休眠的不同階段差異表達(dá),推測其可能在芽休眠過程中起調(diào)控作用,但具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。越來越多的證據(jù)表明 HD-ZIP 家族蛋白在非生物脅迫下發(fā)揮作用。例如,辣椒HD-ZIP蛋白在鹽脅迫下表達(dá)顯著增強(qiáng),GhHB1 參與鹽脅迫應(yīng)答,過表達(dá)OsBIHD1 增強(qiáng)煙草對鹽脅迫的耐受性[34-36]。鹽脅迫下,葡萄HB基因家族上調(diào)表達(dá)的成員均為HD-ZIP家族蛋白,并且在干旱脅迫、銅脅迫和澇害脅迫中也有許多HD-ZIP家族蛋白上調(diào)表達(dá)。此外,屬于HD-ZIP Ⅱ亞族的VvHB9和VvHB34能夠響應(yīng)多種非生物脅迫,表明這些HD-ZIP家族成員在葡萄非生物脅迫下發(fā)揮重要作用?？傊?HB基因已經(jīng)被認(rèn)為是植物發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控因子,其在許多植物發(fā)育的不同階段的特定脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

通過分析葡萄HB基因在芽休眠、果實(shí)發(fā)育成熟過程和不同非生物脅迫下的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)一些較為重要的基因。有9個基因僅在芽休眠階段顯著差異表達(dá),在果實(shí)發(fā)育和不同非生物脅迫下均無差異表達(dá)。PpHB22可以激活PpDAM1以調(diào)節(jié)‘Suli’梨的芽休眠轉(zhuǎn)變[37],HB21、HB40和HB53可以增強(qiáng)NCED3表達(dá),從而抑制芽發(fā)育[38]。說明這些HB基因可能在葡萄芽休眠過程中發(fā)揮作用。值得注意的是,其中有7個基因(VvHB3、VvHB22、VvHB28、VvHB39、VvHB51、VvHB66、VvHB71)是KNOX和WOX亞家族的成員,暗示它們能夠發(fā)生互作調(diào)控葡萄芽休眠過程,這與擬南芥中STM和WUS互作調(diào)控莖尖分生組織的結(jié)果相似[23]。但是關(guān)于HB基因家族成員在非生物脅迫下的耐受機(jī)制以及KNOX和WOX亞家族成員的互作如何調(diào)控葡萄芽休眠,還有待進(jìn)一步研究。

致謝:本研究得到南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物信息中心高性能計算平臺的支持,在此表示感謝!