胡藝偉,李少杭,劉楊,葛海燕

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240)

花青素是一種天然的類黃酮類水溶性色素,廣泛存在于植物中?；ㄇ嗨嘏c植物呈現(xiàn)出的繽紛色彩密不可分。花青素可以幫助植物抵御病原體的侵害,與植物的抗逆性有關(guān)[1]。此外,花青素具有較強的抗氧化性,有抑制炎癥、抵御癌癥等方面的保健功能[2-3]。茄(SolanummelongenaL.)為一年生或多年生蔬菜作物,是我國重要的蔬菜種類之一[4]。茄果皮含有豐富的花青素。開花時間影響植物的生長周期,茄開花與其生產(chǎn)密切相關(guān)。探究茄開花響應(yīng)調(diào)控路徑及提高茄果皮中花青素的含量,對茄生長發(fā)育和人類生活都具有重要意義。

花青素在植物體內(nèi)由苯丙氨酸經(jīng)過3個階段、多步反應(yīng)形成[5]。參與花青素合成的基因包括調(diào)控基因和結(jié)構(gòu)基因,兩者共同構(gòu)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄翻譯成為合成過程中的重要酶,如查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮三羥化酶(F3H)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)等[6],它們受到許多調(diào)控基因的影響。調(diào)控基因一般編碼轉(zhuǎn)錄因子,它們通過結(jié)合下游結(jié)構(gòu)基因啟動子中的順式作用元件來調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達。目前,已知的主要調(diào)控因子包括由R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子、WD40重復(fù)蛋白和bHLH轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合成的MBW蛋白復(fù)合體,以及其他各類轉(zhuǎn)錄因子,如HY5等[7]。調(diào)控因子相互作用共同調(diào)節(jié)下游結(jié)構(gòu)基因的表達,從而影響花青素的合成。在茄中SmMYB1(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)可與花青素合成關(guān)鍵酶基因SmCHS和SmDFR的啟動子結(jié)合,促進花青素合成[8];煙草瞬時轉(zhuǎn)化試驗證明SmMYB44、SmMYB86和SmMYB35參與調(diào)控花青素合成[9]。

Dof轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,屬于單鋅指蛋白家族[10],具有N-末端的DNA結(jié)合域和 C-末端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控域[11]。研究表明,擬南芥Dof轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控類黃酮的次生代謝,影響類黃酮的積累[12]。此外,也有研究表明Dof轉(zhuǎn)錄因子與植物代謝、種子發(fā)育等有關(guān)[13]。CDF(cycling Dof factors)蛋白是植物Dof家族中一類特有的轉(zhuǎn)錄因子,CDF類轉(zhuǎn)錄因子與許多植物的開花響應(yīng)過程密切相關(guān)。在擬南芥中,AtCDF1可以抑制成花因子基因FT(FLOWERING LOCUS T )的表達[14];過表達番茄SlCDF3的擬南芥植株也表現(xiàn)出延遲開花的表型[15]。然而,在茄中CDF類轉(zhuǎn)錄因子的功能研究還相對較少,猜測它們可能參與茄的開花進程及花青素合成調(diào)控。因此,本研究通過生物信息學(xué)分析、亞細胞定位、雙熒光素酶報告試驗和擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化等試驗,探究茄中Dof轉(zhuǎn)錄因子SmCDF2在花青素積累和開花中的作用,為茄分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為本課題組保存的茄優(yōu)良種質(zhì)資源‘藍山禾線茄’和野生型擬南芥(Col-0)?！{山禾線茄’為光敏感型,果皮在光照條件下呈現(xiàn)紫色,而套袋處理后呈白色。茄材料種植于上海市閔行區(qū)航天育種基地。擬南芥幼苗定植于基質(zhì)(草炭、蛭石、珍珠巖體積比7∶2∶1)中,置于24 ℃長日照(光照/黑暗時間為16 h/8 h)、光照強度100 μmol·m-2·s-1的培養(yǎng)箱中正常管理。大腸桿菌DH5α由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供,釀酒酵母AH109和根癌農(nóng)桿菌GV3101由上海唯地生物技術(shù)公司提供。

1.2 SmCDF2基因克隆

在茄基因庫網(wǎng)站(http://eggplant.kazusa.or.jp/)中獲取SmCDF2(Sme2.5_00298.1_g00013.1)的序列,利用Primer 5軟件設(shè)計引物并交由生工生物工程(上海)公司合成,引物序列見表1。采用植物RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取生長5個月的茄植株的根、葉、莖、花和果皮樣品的總RNA,采用瓊脂糖電泳和NanoDrop超微量分光光度計(Thermo Fisher)檢測 RNA質(zhì)量與濃度,并將RNA儲存在-80 ℃冰箱中備用。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa)將RNA(1 μg)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以此為模板擴增SmCDF2基因。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy網(wǎng)站(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測SmCDF2蛋白的相對分子質(zhì)量和理論等電點。用EMBL-EBI(https://pfam.xfam.org/search/sequence)對其結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測。利用BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在NCBI網(wǎng)站上檢索并下載各植物中與茄子SmCDF2同源的氨基酸序列,使用DNAMAN 6.0軟件進行多重氨基酸序列比對,利用MAGE 7.0軟件中的鄰近步長法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,步長設(shè)置為1 000。

1.4 SmCDF2的亞細胞定位

設(shè)計帶有相關(guān)同源臂的目的基因引物(表1),使用Prime STAR Mix試劑盒(TaKaRa)以cDNA為模板擴增,將目的片段用同源重組的方法連接到PHB-YFP載體上。將PHB-SmCDF2-YFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌株GV3101中,在28 ℃條件下于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株至適當(dāng)濃度,然后將菌株懸浮于MS緩沖液(含有10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES和200 μmol·L-1AS,pH5.8)中,稀釋至D600為0.6～0.8,最后將菌液置于黑暗條件下靜置2～3 h。選取生長期為1月齡的本氏煙草(Nicotianabenthamiana)葉片,用1 mL注射器(去針頭)從煙草葉背面進行注射。分別在黑暗和光照條件下培養(yǎng)24 h后使用TCS SP5-Ⅱ激光共聚焦顯微鏡檢測煙草葉片表皮細胞中的YFP信號。

1.5 酵母單雜交

使用pB42AD-SmCDF2-F/R引物擴增SmCDF2基因編碼區(qū)全長,利用諾唯贊公司同源克隆試劑盒構(gòu)建酵母表達載體pB42AD-SmCDF2,結(jié)構(gòu)基因SmCHS和SmF3H啟動子酵母載體pLacZ-SmCHS和pLacZ-SmF3H的構(gòu)建采用Jiang等[16]的方法,酵母轉(zhuǎn)化方法采用Clontech公司聚乙二醇/醋酸鋰(PEG/LiAc)轉(zhuǎn)化法(www.clontech.com)。質(zhì)粒pB42AD-SmCDF2分別與質(zhì)粒pLacZ-SmCHS和pLacZ-SmF3H共轉(zhuǎn)化酵母菌株EGY48后,將菌株涂于二缺板(SD-T/-U)上于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,隨后挑取陽性克隆于液體二缺培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(30 ℃、230 r·min-1),離心收集菌體,點于二缺定性方板(添加80 μmol·L-1X-gal)中培養(yǎng)2～3 d,記錄酵母菌斑顏色,菌斑變藍代表蛋白與啟動子存在互作關(guān)系。以空載pB42AD和pLacZ作為陰性對照。

1.6 雙熒光素酶報告試驗

熒光素酶檢測采用Li等[17]的方法,將結(jié)構(gòu)基因SmCHS和SmF3H的啟動子分別連接到pGreen0800-LUC質(zhì)粒中,再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101(pSoup)中。將以上2種菌液和含有PHB-SmCDF2-YFP的GV3101農(nóng)桿菌株分別接種于含有50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中,28 ℃、230 r·min-1過夜培養(yǎng)至D600值為1.0,6 000 r·min-1離心5 min,離心后將沉淀菌體用MS緩沖液懸浮至D600值為0.6～0.8。將含有proSmCHS∶∶LUC、proSmF3H∶∶LUC質(zhì)粒的菌株懸浮液和含有PHB-SmCDF2-YFP的菌株懸浮液以1∶2的比例混勻,黑暗條件下靜置2～3 h后,選取生長期為1月齡的本氏煙草葉片,用1 mL注射器(去針頭)從煙草葉背面進行注射。以PHB-YFP空載菌株混合含啟動子質(zhì)粒的菌株為對照,每個處理6個生物學(xué)重復(fù)。將注射后的植株在黑暗條件中培養(yǎng)24 h,然后移到自然條件下培養(yǎng)24 h,用雙熒光素酶報告試驗檢測試劑盒(Promega)檢測熒光素酶活性。

1.7 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

將已經(jīng)構(gòu)建的PHB-SmCDF2-YFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌株GV3101中,在28 ℃條件下將菌株于含有卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)。離心后,沉淀菌株用含有50 g·L-1蔗糖和0.2 g·L-1Silwet L-77的MS緩沖液懸浮至D600值為1.0～1.2,并在黑暗條件下靜置2～3 h,然后采用浸花法[18]侵染擬南芥。侵染結(jié)束后,將擬南芥植株置于黑暗條件下48 h,然后移至自然條件下生長。待收獲擬南芥種子后,統(tǒng)一播種并使用除草劑Basta(上海生工生物工程有限公司)噴灑篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株,提取擬南芥DNA,通過PCR檢測SmCDF2是否轉(zhuǎn)入擬南芥中。

1.8 實時熒光定量PCR和擬南芥總花青素含量檢測

設(shè)計SmCDF2的特異性定量引物,以茄材料不同部位的cDNA為模板進行RT-qPCR,SmActin(GU984779.1)為內(nèi)參,引物序列見表1。獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株后,設(shè)計AtFT、AtCHS、AtF3H的特異性定量引物,以轉(zhuǎn)基因植株cDNA為模板進行RT-qPCR,以野生型擬南芥植株作為對照,AtActin為內(nèi)參,具體參考Jiang等[16]的方法。采用Li等[9]的方法對轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥進行花青素含量檢測。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù);采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析;采用GraphPad 5.0軟件繪圖。

圖1 SmCDF2生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatics analysis of SmCDF2a. SmCDF2蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域;b. SmCDF2與其他植物同源氨基酸序列的多重序列比對,圖中紅線標(biāo)注的是鋅指結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸;c.茄子SmCDF2與其他植物同源氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹分析,紅色圓點標(biāo)注的是茄子SmCDF2,馬鈴薯、擬南芥、水稻和玉米中同源的CDF蛋白均用綠色菱形標(biāo)注,節(jié)點旁的數(shù)字代表支持分類的比例。a. Conserved domain of SmCDF2 protein sequence;b. Multiple sequence alignment of SmCDF2 with homologous protein sequences of other plants. The red line in the figure indicates the conserved amino acids of the zf-Dof domain;c. Phylogenetic tree analysis of homologous amino acid sequences of protein CDF in Solanum melongena and other plants. The SmCDF2 was labeled with a red dot and the homologous CDF proteins in Solanum tuberosum,Arabidopsis thaliana,Oryza sativa and Zea mays are marked with green diamond. The number next to the node represents the percentage supporting for the clade in 1 000 bootstrap replications.

圖2 SmCDF2在不同組織中的相對表達量Fig.2 Relative expression level of SmCDF2 gene in different tissues不同字母表示在不同組織中基因表達量差異顯著(P<0.05)。The different letters mean significant difference of gene expression level among different tissues(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 SmCDF2的生物信息學(xué)分析、組織特異性表達及亞細胞定位

SmCDF2基因的蛋白編碼區(qū)長度為1 578 bp,編碼525個氨基酸,經(jīng)ExPASy網(wǎng)站預(yù)測可知,其蛋白相對分子質(zhì)量為57.19×103,理論等電點為6.01。結(jié)合結(jié)構(gòu)域預(yù)測和多重序列比對結(jié)果,發(fā)現(xiàn)SmCDF2具有一個從序列N端180到236號氨基酸編碼的保守結(jié)構(gòu)域zf-Dof(圖1-a、b)。序列同源性比較顯示,茄SmCDF2蛋白序列與同科的蔬菜作物馬鈴薯、辣椒和番茄中的同源蛋白具有較高的同源性,分別為79.81%、79.25%和78.30%,但與煙草中的蛋白同源性只有57.86%;與其他科植物擬南芥、油菜和蘋果等及單子葉植物水稻和玉米間的平均同源性為45.88%。在遺傳進化距離上,茄與馬鈴薯的進化距離最近,與擬南芥和單子葉作物水稻和玉米的遺傳距離較遠(圖1-c)。

以茄的根、莖、葉、花和果皮的cDNA作為模板,通過RT-qPCR試驗進行組織表達特異性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SmCDF2在花中的表達量最高,其次為葉(圖2)。

為了明確目的基因的表達位置,將含有PHB-SmCDF2-YFP表達載體的懸浮液注射于幼嫩煙草葉片的表皮細胞,含有PHB-YFP載體的懸浮液作為對照,用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),注射了PHB-SmCDF2-YFP的葉片其細胞核發(fā)出黃色熒光,而在對照葉片的細胞質(zhì)膜上和核內(nèi)都檢測到了黃色的熒光(圖3),表明SmCDF2定位在細胞核中。

圖3 SmCDF2蛋白在本氏煙草葉片中的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of SmCDF2 protein in leaves of Nicotiana benthamiana

2.2 SmCDF2對花青素合成結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控作用

由于SmCDF2基因定位在細胞核中,并且在其他植物中已經(jīng)驗證了此家族的其他基因可以調(diào)控植物的代謝[13],猜測轉(zhuǎn)錄因子SmCDF2可能與花青素生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的啟動子結(jié)合。首先我們通過酵母單雜交試驗篩選SmCDF2可能結(jié)合的結(jié)構(gòu)基因啟動子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)SmCDF2與SmF3H啟動子共轉(zhuǎn)化酵母時,可使酵母菌斑變藍,而陰性對照pB42AD和pLacZ與相應(yīng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化時酵母菌斑并不能變藍(圖4-a),這說明在體外條件下,SmCDF2可直接結(jié)合在花青素結(jié)構(gòu)基因SmF3H的啟動子上。接著利用雙熒光素酶報告試驗檢測SmCDF2對各結(jié)構(gòu)基因的激活情況,結(jié)果(圖4-b、c)發(fā)現(xiàn),與對照相比,含有SmCHS和SmF3H基因啟動子的農(nóng)桿菌的熒光素酶相對活性極顯著升高,表明在植物體內(nèi)SmCDF2可顯著激活結(jié)構(gòu)基因SmCHS和SmF3H的表達。綜合以上結(jié)果,說明SmCDF2可通過直接結(jié)合啟動子的方式激活花青素結(jié)構(gòu)基因SmF3H的表達,同時間接激活SmCHS的表達。

2.3 SmCDF2對花青素生物合成的影響

為進一步驗證SmCDF2對花青素生物合成的影響,將攜帶PHB-SmCDF2-YFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染野生型擬南芥,篩選2株轉(zhuǎn)基因植株(SmCDF2-OE-A和SmCDF2-OE-B)。觀察其表型發(fā)現(xiàn),2株SmCDF2-OE在苗期便有不同程度的變紫現(xiàn)象(圖5-a);隨著擬南芥繼續(xù)生長,其莖和葉片也呈現(xiàn)明顯的紫色(圖5-b)。通過測定植株花青素含量,發(fā)現(xiàn)2株SmCDF2-OE的花青素含量都明顯高于野生型,其中SmCDF2-OE-A的花青素含量為野生型花青素含量的2.88倍,而SmCDF2-OE-B的花青素含量為野生型的2.50倍(圖5-c、d)。由圖6可見:與野生型擬南芥相比,2株SmCDF2-OE中的AtF3H基因和AtCHS基因的表達量都極顯著上升,其中SmCDF2-OE-A中的AtF3H和AtCHS表達量相比野生型分別提高97和 31倍,而SmCDF2-OE-B的AtF3H和AtCHS表達量相比野生型分別提高85和26倍。上述結(jié)果表明,SmCDF2參與調(diào)控植物體內(nèi)的花青素合成,促進花青素的積累。

圖4 SmCDF2與結(jié)構(gòu)基因SmF3H啟動子的酵母單雜試驗(a)和雙熒光素酶報告試驗中相關(guān)結(jié)構(gòu) 基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(b、c)Fig.4 Yeast one-hybrid assay of SmCDF2 and SmF3H promotor(a)and the transcriptional activity of promoters of structure genes in dual luciferase report assay(b,c)**P<0.01. The same as follows.

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥的花青素特征Fig.5 Anthocyanin characterization of transgenic A. thaliana(SmCDF2-OE)and wild type(WT)a.轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的表型;b.轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥葉片的表型;c.轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的花青素提取液;d.轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的花青素含量。a. Phenotype of transgenic A. thaliana(SmCDF2-OE)and WT;b. Leaf phenotype of transgenic A.thaliana and WT;c. Anthocyanin extracts of transgenic A.thaliana and WT;d. Anthocyanin contents of transgenic A.thaliana plants(mixed sample of SmCDF2-OE-A and SmCDF2-OE-B)and WT. ***P<0.005. The same as follows.

圖6 轉(zhuǎn)基因擬南芥(3月齡)和野生型擬南芥中 SmCDF2、AtCHS和AtF3H的表達量Fig.6 Expression levels of SmCDF2,AtCHS and AtF3H in 3-month-old transgenic A.thaliana plants and WT

2.4 SmCDF2對植物開花時間的影響

相同生長條件下,SmCDF2-OE的發(fā)芽時間晚于對照植株,抽薹時間則明顯晚于對照植株(圖7-a),SmCDF2-OE-A和SmCDF2-OE-B植株比對照抽薹分別推遲了21和18 d,當(dāng)對照植株處于結(jié)莢期,轉(zhuǎn)基因植株開始出現(xiàn)花苞,表明轉(zhuǎn)基因擬南芥SmCDF2-OE的開花時間遠遲于野生型。為進一步探究SmCDF2延遲開花的機制,以2株SmCDF2-OE的cDNA為模板進行RT-qPCR試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SmCDF2-OE-A和SmCDF2-OE-B擬南芥中調(diào)控開花的基因AtFT的表達量比對照顯著下降,分別下降89%和86%(圖7-b),表明SmCDF2能延遲植物的開花時間。

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥開花相關(guān)特性Fig.7 Flowering features of transgenic A.thaliana plants and WTa. 轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的開花表型 Flowering phenotype of transgenic A.thaliana plant and WT;b. 轉(zhuǎn)基因擬南芥(3月齡)中AtFT的表達量 Relative expression of AtFT in 3-month-old transgenic A.thaliana plants and WT.

3 討論

目前已知參與茄花青素生物合成的轉(zhuǎn)錄因子中,MBW復(fù)合體的研究已經(jīng)較為深入,此外還有許多其他家族的轉(zhuǎn)錄因子也參與花青素合成。Li等[19]在茄的光響應(yīng)表達模式分析中,發(fā)現(xiàn)SmCDF2基因的表達量隨光照時間的增加而出現(xiàn)明顯的上升趨勢。本試驗結(jié)果表明SmCDF2能上調(diào)SmF3H和SmCHS的表達;同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的花青素含量以及AtF3H和AtCHS基因表達量比野生型顯著升高,并且其開花時間相比野生型有顯著的延遲。經(jīng)過進一步探究,還發(fā)現(xiàn)過表達擬南芥中開花相關(guān)基因AtFT的表達量顯著降低。

SmCDF2屬于Dof類蛋白,位于C-末端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域不具有保守性,氨基酸序列較為多變,導(dǎo)致Dof蛋白家族不同成員和不同植物之間具有多樣的功能,表現(xiàn)為既具有轉(zhuǎn)錄抑制功能,也有轉(zhuǎn)錄激活功能。例如香蕉MaDOF23抑制一系列細胞壁降解和芳香物質(zhì)形成相關(guān)基因的表達,從而延緩香蕉成熟[20];但在茶樹中,CsDOF通過激活谷氨酰胺合成酶基因CsGS2(GLUTAMINESYNTHETASE2)的表達正調(diào)控谷氨酰胺的代謝[21]。此外,許多研究表明Dof蛋白參與許多植物生長發(fā)育過程。Kang等[22]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中Dof蛋白AtOBP3(OBF binding protein)的表達受到生長素的調(diào)節(jié),能促進植物的生長;擬南芥中AtCDF是響應(yīng)光周期調(diào)控開花的重要Dof轉(zhuǎn)錄因子,它受GI(GIGANTEA)、LKP(LOV KELCH protein)、FKF(F-box protein)等基因調(diào)控來改變植物的開花響應(yīng)狀態(tài)[23];不結(jié)球白菜中BrCDF1能影響FT的表達,參與不結(jié)球白菜的光周期開花途徑[24];而Song等[14]研究也指出,AtCDF1可以和FT的啟動子相結(jié)合,對開花進行調(diào)節(jié)。Dof轉(zhuǎn)錄因子在茄中調(diào)控開花的機制鮮見報道。本研究結(jié)果證實SmCDF2參與調(diào)控擬南芥的開花響應(yīng),且在過表達擬南芥植株中發(fā)現(xiàn),其通過影響開花關(guān)鍵基因AtFT來調(diào)控開花時間,這與上述研究的結(jié)果相似。研究茄的開花響應(yīng)對茄早晚熟品種及優(yōu)質(zhì)品種的選育具有重要意義,而深入研究Dof轉(zhuǎn)錄因子的功能為茄開花機制的研究提供了新的思路。

另一方面,植物中的Dof轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)次生代謝物的合成和累積,AtDof4.2基因的特異表達可以抑制花粉粒中黃酮類化合物的累積[12]。目前,參與植物花青素生物合成的基因主要為MBW復(fù)合體、LBD(lateral organ boundary domain)、ERF(ethylene response factor)和BBX(B-box family)等類型的基因[25-27],而Dof基因在植物花青素合成中的功能研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)Dof轉(zhuǎn)錄因子SmCDF2能參與茄花青素生物合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并促進花青素的生物合成。該結(jié)果為進一步研究Dof家族的眾多基因提供思路,同時也完善了茄花青素生物合成路徑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對茄高花青素含量品種選育提供理論基礎(chǔ)。此外,還為與SmCDF2相近的其他物種基因的研究提供相關(guān)參考。

由于SmCDF2的表達模式和光照密不可分,猜測SmCDF2可能參與復(fù)雜的光調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。另外,植物激素能通過影響植物體中的各類轉(zhuǎn)錄因子表達來影響植物的性狀,而Dof轉(zhuǎn)錄因子也可受到植物激素的調(diào)控[28]。通過后續(xù)試驗設(shè)計,我們可能確定一條由植物激素及SmCDF2參與的調(diào)控途徑,通過改變激素施加等外部條件,誘導(dǎo)茄體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子表達,從而影響茄的各種性狀。由激素調(diào)控功能多樣的Dof轉(zhuǎn)錄因子表達的研究能為植物帶來抗病抗逆、提高產(chǎn)量益處,是后續(xù)設(shè)計相關(guān)試驗可行性的依據(jù)。