王蕊,高峰,Kenneth Omondi Ouma,倪照君,侍婷,高志紅

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹生物技術(shù)實驗室/園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

梅(Prunusmume)原產(chǎn)于中國,其果實具有較高的營養(yǎng)價值,經(jīng)濟(jì)栽培主要分布在東亞和東南亞的亞熱帶地區(qū),中國是目前梅種植面積最大的國家[1]。植物芽休眠對多年生落葉果樹抵抗冬季不利生長環(huán)境,并在次年春季正常萌芽和開花具有特別重要的意義[2]。而梅需冷量范圍較廣,對于研究果樹季節(jié)性休眠機(jī)制具有獨特優(yōu)勢[3]。

生長調(diào)控因子(growth regulating factors,GRF)編碼的蛋白是植物特有的,2000年在水稻中被首次發(fā)現(xiàn),并命名為OsGRF1[4]。2003年,Kim等[5]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GRF基因在調(diào)控植物生長和發(fā)育中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在擬南芥中異位過表達(dá)白菜BrGRF8,可使植株子葉增大[6],過表達(dá)AtGRF1和AtGRF2則使葉片顯著增大[5]。在擬南芥中超表達(dá)AtGRF7和AtGRF9會影響雌蕊的發(fā)育[7],過表達(dá)AtGRF1和AtGRF2 則導(dǎo)致晚花現(xiàn)象[5]。在油菜中超表達(dá)BnGRF2可提高種籽粒質(zhì)量和油脂含量[8]。菊花GRF參與開花和周期調(diào)控以及對鹽和低溫等脅迫響應(yīng)過程[9]。以上研究表明,植物GRF基因在生長、品質(zhì)形成和脅迫響應(yīng)方面都發(fā)揮了重要作用,是植物特有的一個重要調(diào)控因子。落葉果樹休眠及開花機(jī)制一直都是研究熱點,但目前PmGRF基因家族在功能相關(guān)方面的研究還存在空缺。本研究利用生物信息學(xué)手段對PmGRF家族進(jìn)行分析,主要包括基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析、共線性分析以及在休眠4個時期的表達(dá)模式等,以期進(jìn)一步了解PmGRF基因家族的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為梅品種‘桃形梅’,采自位于南京的國家果梅種質(zhì)資源圃。從2020年9月27日至2021年1月31日,每隔7 d采集一年生枝條上的花芽,用液氮速凍后立刻帶回實驗室置于-80 ℃冰箱保存,并按照當(dāng)年物候以及芽的發(fā)育狀況將樣品按照抑制性休眠、生理休眠、生態(tài)休眠和休眠解除4個階段歸類。其中,2020年9月27日至2020年11月1日為抑制性休眠階段,2020年11月2日至2020年12月1日為生理休眠階段,2020年12月2日至2021年1月3日為生態(tài)休眠階段,2020年1月4日至2021年1月31日為生態(tài)休眠階段。

1.2 PmGRF 家族基因的確定

從NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載梅GRF蛋白序列,從Pfam網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/)下載WRC(PF08879)和QLQ(PF08880)保守域的隱馬爾可夫模型(HMM)。利用Hmmer 3.0 軟件檢索梅蛋白組數(shù)據(jù)庫,去除登錄號相同的冗余序列,得到候選蛋白序列,利用SMATR網(wǎng)站(http://smart.embl.de/smart/batch.pl)驗證候選蛋白是否存在WRC和QLQ結(jié)構(gòu)域,若存在則屬于梅GRF 蛋白家族。

1.3 PmGRF 基因家族的生物信息學(xué)鑒定

用ProtParam在線網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)分析梅GRF基因家族成員的蛋白質(zhì)特性,例如相對分子質(zhì)量、等電點(pI)和疏水性(GRAVY)等。運用BUSCA在線網(wǎng)站(http://busca.biocomp.unibo.it/)預(yù)測梅GRF基因家族成員蛋白的亞細(xì)胞定位。從NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載PmGRF基因家族成員的內(nèi)含子、外顯子信息、梅8條染色體的長度以及每個PmGRF基因的染色體位置,利用在線軟件GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org/index.php)繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖,并使用MG2C在線網(wǎng)站(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)在每條染色體上繪制精確的基因分布位置。利用MEME網(wǎng)站(http://meme-suite.org/tools/meme)分析PmGRF基因家族蛋白的保守基序,保守基序的最大檢索值設(shè)置為15?；蜷g以及物種間的共線性圖譜繪制和Ka/Ks計算由MCScanX軟件(http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2)和KaKs計算器(http://code.google.com/p/kaks-calculator/wiki/KaKs_Calculator)完成。從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索每個PmGRF基因的啟動子序列后利用PlantCARE網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行啟動子順式作用元件分析。

使用ClustalW比對所有GRF序列,參數(shù)設(shè)置為默認(rèn),再用MEGA X構(gòu)建擬南芥、梅、杏、扁桃和桃GRF基因家族的綜合系統(tǒng)發(fā)育樹。從NCBI SRA數(shù)據(jù)庫下載RNA-seq數(shù)據(jù)后用TBtools繪制熱圖[10],分析PmGRF基因在莖、葉、根、芽和果實中的表達(dá)譜。

1.4 PmGRF基因熒光定量表達(dá)分析

采用多糖多酚植物RNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)提取RNA,使用SYBR PreMixExTaqTM(TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到4個休眠階段的cDNA,然后對15個PmGRF進(jìn)行RT-qPCR試驗,并用公式2-ΔΔCT計算各個基因的相對表達(dá)量。用于RT-qPCR的引物如表1所示。

表1 用于檢測PmGRF 基因表達(dá)的RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for detection of the PmGRF genes expression with RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 梅GRF基因家族成員的鑒定與基因、蛋白理化性質(zhì)分析

根據(jù)GRF基因中的QLQ(PF08880)和WRC(PF08879)保守結(jié)構(gòu)域,從梅基因組中檢索并去除冗余序列后最終共鑒定出15個梅GRF基因,命名為PmGRF01—PmGRF15。由表 2可知:GRF蛋白在理論等電點、相對分子質(zhì)量等方面均存在差異,其中PmGRF01編碼的氨基酸序列中含有連續(xù)的未知氨基酸,所以其理論等電點以及相對分子質(zhì)量無法確定。PmGRF基因編碼的氨基酸數(shù)為283(PmGRF06)～2 254(PmGRF15),相對分子質(zhì)量為31 560.8(PmGRF06)～252 420.6(PmGRF15),蛋白質(zhì)理論等電點(pI)為5.75(PmGRF02)～9.50(PmGRF05)。87%的PmGRF基因家族編碼蛋白的pI大于7,因此,說明梅GRF基因家族編碼的多數(shù)蛋白富含堿性氨基酸。蛋白質(zhì)疏水性(GRAVY)介于-1.064(PmGRF06)～-0.607(PmGRF09),疏水性負(fù)值越大表示越親水,正值越大表示越疏水,疏水值介于-0.5～0.5的為兩性氨基酸[11]。所有PmGRF編碼的蛋白GRAVY值小于0,表明其都是親水蛋白。亞細(xì)胞定位的結(jié)果顯示,全部的基因都位于細(xì)胞核中,所以PmGRF屬于典型的核蛋白。

表2 梅GRF基因及其編碼蛋白的基本信息和理化性質(zhì)Table 2 Basic information and physicochemical properties of GRF gene and coding proteins in Prunus mume

2.2 PmGRF基因家族的基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

由圖1可見:PmGRF基因的內(nèi)含子數(shù)差異較大,為2～15個,其中PmGRF15的內(nèi)含子數(shù)最多(15個)。有5個基因(PmGRF04、PmGRF05、PmGRF06、PmGRF08、PmGRF14)包含2個內(nèi)含子,有5個基因(PmGRF09、PmGRF10、PmGRF11、PmGRF12、PmGRF13)包含3個內(nèi)含子。

圖1 梅PmGRF基因結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Structure analysis of the PmGRF genes in P.mume

如圖2所示:除PmGRF06、PmGRF12外,其余PmGRF都具有motif 2,除PmGRF15外,其余PmGRF都具有motif 1,說明PmGRF家族的成員具有相似的基序類型。利用Pfam網(wǎng)站對motif 1和motif 2進(jìn)行注釋,發(fā)現(xiàn)motif 1屬于WRC結(jié)構(gòu)域,motif 2屬于QLQ結(jié)構(gòu)域。在Ⅶ亞家族中,PmGRF家族成員的保守基序近似,基因結(jié)構(gòu)也相似,這進(jìn)一步支持了系統(tǒng)發(fā)育樹的準(zhǔn)確性。

圖2 梅PmGRF基因編碼的蛋白motif分析Fig.2 The motif analysis of the proteins encoded by PmGRF genes in P.mume

2.3 PmGRF基因家族的染色體定位

由圖3可見:PmGRF01、PmGRF02分布在第1條染色體上,PmGRF03位于第3條染色體,PmGRF04位于第4條染色體,第5條染色體上分布的最多,有6個,即PmGRF05、PmGRF06、PmGRF07、PmGRF08、PmGRF09、PmGRF15。第7條染色體上分布著PmGRF10、PmGRF11,而PmGRF12、PmGRF13、PmGRF14位于第8條染色體上。

表3 PmGRF基因串聯(lián)重復(fù)序列的Ka/Ks值Table 3 The Ka/Ks values of tandemly repeated sequences of PmGRF gene

圖3 梅PmGRF基因在梅6條染色體的定位分布Fig.3 Location and distribution of PmGRF genes on 6 chromosomes of P.mume藍(lán)線代表梅的染色體。染色體編號位于每個染色體的頂部。左側(cè)的比例尺展示染色體長度。The blue line represents the chromosome of P.mume. The chromosome number is at the top of each chromosome. The scale bar on the left shows the chromosome length.

2.4 PmGRF基因家族的共線性分析

共線性分析結(jié)果(圖4)表明,3對基因(PmGRF01和PmGRF02,PmGRF09和PmGRF11,PmGRF04和PmGRF14)存在節(jié)段性重復(fù),為了進(jìn)一步分析AtGRF和PmGRF的進(jìn)化關(guān)系,繪制了擬南芥和梅的基因組共線性圖譜。圖譜結(jié)果表明,AtGRF04和PmGRF13以及AtGRF05和PmGRF04之間存在線性關(guān)系,表示們之間具有同源性,推斷可能有相似的功能。

圖4 PmGRF基因間共線性分析(a)以及梅和擬南芥GRF間共線性關(guān)系(b)Fig.4 The collinearity analysis between PmGRF genes(a)and collinearity between GRF genes of P.mume and Arabidopsis thaliana(b)

通過計算,結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)所有PmGRF基因重復(fù)序列的Ka值都小于Ks值,Ka/Ks值都遠(yuǎn)小于1,說明進(jìn)化過程中,基因受純化選擇,來降低堿基非同義替換帶來的氨基酸變化,從而減少蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能的改變。當(dāng)Ka/Ks>1時,說明該基因近期正在快速進(jìn)化,因此PmGRF基因進(jìn)化緩慢。

2.5 PmGRF家族基因啟動子的順式作用元件分析

如圖5所示:PmGRF的啟動子順式作用元件主要包括4類:生長發(fā)育相關(guān)作用元件、低溫干旱等脅迫相關(guān)作用元件、光響應(yīng)相關(guān)作用元件和參與激素反應(yīng)的順式調(diào)控元件。其中生長發(fā)育相關(guān)作用元件最多,光響應(yīng)相關(guān)作用元件和參與激素反應(yīng)的順式調(diào)控元件次之,低溫干旱等脅迫相關(guān)作用元件最少。不同基因含有不同類型的作用元件,如PmGRF03含有生長發(fā)育、脫落酸、茉莉酸甲酯、光響應(yīng)、干旱等脅迫相關(guān)作用元件,PmGRF09含有光響應(yīng)、生長素、水楊酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、干旱脅迫等相關(guān)作用元件,說明PmGRF對不同的激素或環(huán)境因素起作用。

2.6 GRF家族成員進(jìn)化樹分析

圖6為4個薔薇科植物梅、杏、桃、扁桃和擬南芥GRF家族的系統(tǒng)發(fā)育分析,參照擬南芥的GRF家族分組方式,這些蛋白被分為7個亞家族(Ⅰ—Ⅶ)。其中Ⅶ亞家族包含的PmGRF的成員最多,有4個。所選的4種薔薇科植物GRF家族中,梅與杏有較高的同源性,例如PmGRF13與PaCAB4287233.1、PmGRF09 與PaCAB4271658.1、PmGRF01與PaCAB4264059.1。而PmGRF與AtGRF家族同源性不高。其余薔薇科植物的GRF家族同源性都較高,如杏家族與扁桃家族、扁桃家族與桃家族,說明薔薇科植物的GRF具有高度保守的結(jié)構(gòu)。

2.7 PmGRF在梅不同組織和休眠時期的表達(dá)譜分析

如圖7所示:PmGRF12、PmGRF06和PmGRF09在芽中的表達(dá)豐度最高,可能與芽休眠有關(guān),而PmGRF11在果實中表達(dá)豐度最高,可能與果實生長發(fā)育相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明,PmGRF09、PmGRF07、PmGRF10、PmGRF15、PmGRF05、PmGRF14、PmGRF03和PmGRF11在生理休眠時期的轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到峰值,然后表達(dá)開始下調(diào),而PmGRF02在抑制性休眠時期的表達(dá)豐度就已達(dá)到峰值,但總體來說PmGRF家族基因在不同的休眠時期都有不同的表達(dá)譜,這說明PmGRF家族可能在休眠調(diào)控過程中發(fā)揮作用。

圖6 梅PmGRF與其他物種GRF的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Integrated phylogenetic tree of GRF of P.mume and other species

圖7 PmGRF在不同組織(a)和不同休眠階段(b)中的表達(dá)水平Fig.7 Expression levels of PmGRF in different tissues(a)and different dormancy stages(b)para.抑制性休眠Paradormancy;endo.生理休眠Endodormancy;eco.生態(tài)休眠Ecodormancy;release.休眠解除Dormancy release. 下同。The same as follows.紅色代表高表達(dá),藍(lán)色代表低表達(dá)。Red represents higher expression,blue represents lower expression.

圖8 PmGRF在4個休眠階段的RT-qPCR表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of PmGRF in four dormancy stages不同字母表示在0.05水平(Tukey檢驗)時顯著性差異。Different letters above the bars represent significant differences at 0.05 level by Tukey’s test.

2.8 PmGRF基因在不同休眠時期的表達(dá)模式分析

采用RT-qPCR分析15個PmGRF基因在不同休眠時期的表達(dá)量,結(jié)果(圖8)表明,RT-qPCR分析結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果基本一致。PmGRF的表達(dá)隨著休眠時期的推進(jìn)而呈現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢,分為3個趨勢,并且在不同的休眠時期出現(xiàn)峰值,趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本吻合。大多數(shù)PmGRF基因都呈先升高后下降趨勢,其中,PmGRF03、PmGRF04、PmGRF05、PmGRF07、PmGRF08、PmGRF09、PmGRF10、PmGRF11、PmGRF13、PmGRF14和PmGRF15在生理休眠表達(dá)水平達(dá)到峰值而后逐漸下降,而PmGRF12在生態(tài)休眠時期達(dá)到峰值。PmGRF06在整個休眠階段都呈上升趨勢,而PmGRF01和PmGRF02呈一直下降趨勢。值得注意的,大部分PmGRF基因的表達(dá)水平都在某個休眠階段有急劇上調(diào)的趨勢,這暗示PmGRF在梅休眠的整個過程中都可能起到非常重要的調(diào)節(jié)作用。

3 討論

植物特有的GRF基因具有多方面的生理功能,涉及植物開花、葉和根的發(fā)育以及逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[12-14],但是關(guān)于梅GRF基因家族的報道還很缺乏。本研究中,從梅基因組中鑒定到15個PmGRF基因,其數(shù)量高于葡萄(8個)[15]、番茄(13個)[16]、茶樹(11個)[17]、水稻(11個)[18]等植物,這可能是由于梅基因組出現(xiàn)廣泛復(fù)制。蛋白分析發(fā)現(xiàn),梅GRF基因編碼的氨基酸基本都是堿性氨基酸,且多數(shù)GRF蛋白均是親水蛋白。PmGRF 蛋白符合GRF的基本特征,即含有2個典型的結(jié)構(gòu)域(WRC和QLQ),且 2個結(jié)構(gòu)域均位于GRF的N端。QLQ含有大量芳香族/疏水性氨基酸,這對于QLQ作為蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用域發(fā)揮作用可能很重要[4]。而WRC結(jié)構(gòu)域可能包括NLS和鋅指結(jié)構(gòu)域,因此它可能結(jié)合DNA而發(fā)揮作用[19]。Ka/Ks=1 時基因進(jìn)化模式表現(xiàn)為中性選擇,當(dāng)Ka/Ks>1 時表現(xiàn)為正向選擇,當(dāng)Ka/Ks<1 時基因受純化選擇[20]。本研究中,所有PmGRF基因重復(fù)序列的Ka/Ks值均遠(yuǎn)小于1,說明進(jìn)化過程中PmGRF受純化選擇。本研究中,親緣關(guān)系較近的4種薔薇科果樹中,桃GRF家族成員較多(22個),其他物種的家族成員數(shù)量接近(15～16 個)。4 種薔薇科植物GRF家族進(jìn)化分析結(jié)果顯示梅與杏的GRF同源性較高,表明二者在進(jìn)化過程中親緣關(guān)系較近。

本研究中,啟動子區(qū)域順式元件分析表明生長發(fā)育相關(guān)元件最多,說明PmGRF與植物生長發(fā)育密切相關(guān)。另外PmGRF基因家族還含有激素響應(yīng)元件,包括脫落酸和赤霉素響應(yīng)元件,說明PmGRF的表達(dá)水平可能一定程度上受ABA和GA的誘導(dǎo),而GA/ABA比值與休眠解除和開花過程有密切關(guān)系[5]。在梨中,油菜素內(nèi)酯(BR)可能是通過平衡ABA與GA之間的含量來促進(jìn)破眠[21],因此這表明PmGRF可能與GA和ABA相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而在休眠和開花過程中發(fā)揮作用。在擬南芥中,AtGRF1 和AtGRF2 也控制開花時間[5]。最近的研究表明,AtGRF1 和AtGRF3 主要作用為調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、防御反應(yīng)以及相關(guān)的激素水平,從而幫助植物適應(yīng)脅迫條件[22]。Wu等[23]在茶樹轉(zhuǎn)錄組中鑒定得到6個GRF基因,發(fā)現(xiàn)其中3個成員在 ABA處理后表達(dá)水平升高,5個成員在 MeJA 處理后表達(dá)水平降低,1個成員被GA誘導(dǎo)顯著上調(diào),因此這進(jìn)一步表明PmGRF可能響應(yīng)ABA和GA進(jìn)而參與休眠的調(diào)控過程。在水稻中,GRF基因在芽、未成熟葉和花芽中高表達(dá)并通過調(diào)節(jié)生長組織中的細(xì)胞增殖參與植物生長和發(fā)育[18]。而CsGRF基因家族則被推測在茶樹生長組織尤其是芽葉中起重要作用[17]。本研究組織特異性表達(dá)譜分析表明PmGRF12、PmGRF06和PmGRF09在芽中的表達(dá)豐度最高,這從另一個角度說明PmGRF與芽休眠密切相關(guān)。另外,PmGRF04、PmGRF07、PmGRF08、PmGRF01、PmGRF14含有低溫響應(yīng)元件,預(yù)示著PmGRF有可能通過響應(yīng)低溫信號參與休眠過程。本研究中,PmGRF的表達(dá)隨著休眠時期的推進(jìn)而呈現(xiàn)出的表達(dá)趨勢不同,例如PmGRF04、PmGRF05、PmGRF10、PmGRF11、PmGRF13、PmGRF14、PmGRF15在生理休眠時期表達(dá)水平顯著增加,而當(dāng)休眠解除時逐漸下降,PmGRF12在生態(tài)休眠時期時達(dá)到峰值后逐漸下降,推測它們與維持休眠有關(guān)。而PmGRF06在整個休眠階段都呈上升的趨勢,推測其與解除休眠有關(guān)。每個PmGRF基因的表達(dá)水平在某個休眠階段都有急劇變化的趨勢,這暗示PmGRF在梅休眠的整個過程中可能起到非常重要的調(diào)節(jié)作用。本研究利用生物信息學(xué)對PmGRF基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定,并結(jié)合表達(dá)差異推測其在梅休眠過程中起作用。后續(xù)將繼續(xù)深入驗證部分基因的功能,為完善梅休眠機(jī)制提供參考。