王雪,康敏,王偲媛,曹衛(wèi)星,朱艷,劉兵

(南京農(nóng)業(yè)大學國家信息農(nóng)業(yè)工程技術中心/智慧農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物系統(tǒng)分析與決策重點實驗室/江蘇省信息農(nóng)業(yè)重點實驗室/現(xiàn)代作物生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210095)

水稻(OryzasativaL.)是我國重要的糧食作物,全國65%以上的人口以稻米為主食。水稻光合作用不僅直接影響其干物質(zhì)生產(chǎn)及產(chǎn)量形成,同時還是衡量農(nóng)田碳匯能力的重要指標之一[1]。根據(jù)光合-CO2響應曲線(A-Ci)獲得的光合參數(shù),可作為衡量水稻光化學效率的指標[2-3]。傳統(tǒng)的光合-CO2響應曲線測量方法(A-Ci)是基于氣體交換原理,采用穩(wěn)態(tài)測量的方式獲得,每一個測試點達到穩(wěn)態(tài)都需要1～3 min,因此測試一條完整的曲線一般需要耗時20～35 min[4-6],且一條曲線通常只包含十多個數(shù)據(jù)點。近年來,光合測量系統(tǒng)LI-6800中新提出了一種光合-CO2響應曲線快速測量方法,即快速A-Ci響應(RACiR)曲線。與A-Ci技術相比,RACiR技術采用了非穩(wěn)態(tài)測量的方式(即在短時間內(nèi)迅速改變氣體交換裝置內(nèi)參考室和樣本室的CO2濃度),最高以100 μmol·mol-1·min-1的速度來改變CO2濃度,實現(xiàn)光合-CO2響應曲線的測試,最短5 min就可獲得最大Rubisco羧化速率(Vmax)和最大電子傳遞速率(Jmax)等參數(shù),且1條曲線的數(shù)據(jù)密度是A-Ci技術的10倍之多[7]。因此,采用更快捷、更合適的測試方法以及數(shù)學模型來擬合水稻光合-CO2響應曲線,有助于提高水稻光合作用測試的效率及準確度,為研究未來氣候變化背景下CO2濃度升高對水稻光合作用的影響具有重要意義。

在光合作用的測量方式和數(shù)據(jù)擬合模型方面已有大量研究[6-8]。通過光合-CO2響應模型可以解析飽和CO2濃度(Cisat)、最大凈光合速率(Pnmax)、CO2補償點(Γ*)、光呼吸速率(Rd)和初始羧化效率(α)等重要光合參數(shù)[4,8]。目前最常用的光合-CO2響應模型有生化模型(FvCB)[9],在此基礎上衍生出不同A-Ci曲線擬合模型,如直角雙曲線模型[10]、Michaelis-Menten模型[11]、非直角雙曲線模型[12]、葉子飄模型[13]、指數(shù)函數(shù)模型[14]、指數(shù)修正模型等[15]。這些模型已應用于定量研究CO2濃度升高影響植物光合生理生態(tài)方面[16-17]。大部分模型是在FvCB模型基礎上,采用不同A-Ci曲線擬合方法,但其測量方式?jīng)]有根本變化。近年來,隨著測量儀器的更新?lián)Q代,新的測試方法如快速光合-CO2響應(RACiR)曲線被提出[18-19]。相比于傳統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)測量方法,RACiR技術是一種基于非穩(wěn)態(tài)測試方法的葉片尺度氣體交換測量方式,可在更短時間內(nèi)獲取基本的光合特征參數(shù)。該方法推出后在短時間內(nèi)獲得了較多的關注和應用。

本研究采用快速光合-CO2響應(RACiR)曲線技術與傳統(tǒng)的光合-CO2響應曲線(A-Ci)技術對水稻光合作用進行測試,采用8種光合-CO2響應模型對所測量的數(shù)據(jù)進行擬合分析,并對獲取的光合特征參數(shù)進行比較。通過比較2種測試方法和8種CO2響應模型在水稻光合-CO2響應曲線分析中的擬合效果及潛在問題,為水稻光合-CO2響應曲線選用合適的測試方式和擬合模型,同時為未來高通量光合表型獲取技術等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

分別于2020年和2021年在溫室和大田進行水稻光合作用測試,用于檢驗2種測試方法和不同的CO2響應模型是否適用于不同環(huán)境下的光合作用測試。

1.1.1 試驗1由北京力高泰科技有限公司的工程師提供數(shù)據(jù),該數(shù)據(jù)于2020年11月6日在湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學溫室(114.37°E,30.48°N)內(nèi)完成測試,供試水稻品種為‘豐兩優(yōu)香1號’。供試材料于9月中旬播種,育秧至3葉1心期移栽至約10 kg土的塑料桶中在溫室栽培,栽培管理措施均按照該品種的品種特性進行,以避免生物和非生物脅迫。

1.1.2 試驗22021年8月在江蘇省如皋市國家信息農(nóng)業(yè)工程技術中心試驗示范基地(120.33°E,32.23°N)進行測試,供試水稻品種為‘淮稻5號’。供試材料于5月中下旬播種,育秧至3葉1心期移栽。按照當?shù)厮痉N植標準進行除草和病蟲害管理,以避免生物和非生物脅迫。

1.2 CO2響應曲線測試

1.2.1 傳統(tǒng)光合-CO2響應(A-Ci)曲線測試測試時間為水稻開花期,在晴天08:30—11:30,采用便攜式光合儀LI-6800(LI-COR,Lincoln,USA)對各環(huán)境下的水稻劍葉凈光合速率(Pn)進行測試。選用光合儀內(nèi)置光源將光合有效輻射控制在1 500 μmol·m-2·s-1,溫度控制在(25±2)℃,CO2濃度設置為400、300、200、100、50、400、400、600、750、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000 μmol·mol-1。每個CO2濃度最低等待時間為2 min,最高等待時間為6 min,測定部位為主莖劍葉。

1.2.2 快速光合-CO2響應(RACiR)曲線測試RACiR曲線測試與A-Ci測試同步進行。測試時間為水稻開花期,選擇晴天08:30—11:30,采用便攜式光合儀LI-6800測量Pn。選用光合儀內(nèi)置光源將光合有效輻射控制在1 500 μmol·m-2·s-1,溫度控制在(25±2)℃,濕度控制在55%。先在自動程序界面中的AutoLog設置大于測試時間的自動記錄程序,數(shù)據(jù)記錄時間間隔2 s。同時在環(huán)境界面中應用Auto controls控制參比室CO2濃度(CO2_r):先在2 min內(nèi)從400 μmol·mol-1降至0 μmol·mol-1,再在15 min之內(nèi)從 0 μmol·mol-1升至1 500 μmol·mol-1,其余操作如空葉室校正等參照北京力高泰科技有限公司提供的 LI-6800 實驗手冊,測定部位為主莖劍葉。測試數(shù)據(jù)參照Stinziano等[7]的方法進行分析,公式如下:

AEC=m×[CO2]ret-b

(1)

Aleaf=Aapparent-AEC

(2)

式中:AEC為空葉室產(chǎn)生的CO2表觀凈同化速率的偏差值;Aleaf為經(jīng)過校準后的葉片CO2凈同化速率;Aapparent為CO2表觀凈同化速率;[CO2]ret為空葉室內(nèi)CO2以100 μmol·mol-1·min-1從500 μmol·mol-1到 0 μmol·mol-1線性降低;m為斜率絕對值;b為截距。利用模型計算得到最大羧化速率Vc,max以及最大電子傳遞速率Jmax。

1.3 CO2響應模型介紹

1.3.1 FvCB模型C3植物的凈光合速率受CO2濃度、溫度、光照強度、葉肉導度、Rubisco酶活性、RuBP濃度等因素的限制[8,20-21]。Farquhar等[9]于1980年提出了C3植物的光合生化模型(簡稱FvCB模型):

(3)

式中:Pn為植物的凈光合速率;Ac為Rubisco限制下的羧化速率;Aj為RuBP再生限制下的羧化速率;Ap為磷酸丙糖利用率(TPU)限制下的潛在羧化速率;Г*為葉綠體CO2光合補償點;Ci為胞間CO2濃度;Rd為線粒體暗呼吸速率。

1.3.2 直角雙曲線模型直角雙曲線模型由Baly[10]的推導公式而來,是植物凈光合速率對CO2響應的經(jīng)驗模型,計算公式如下:

(4)

式中:α為初始羧化效率(即Pn-Ci曲線在Ci=0時的斜率);Rp為光呼吸速率;Pnmax為最大凈光合速率。

1.3.3 葉子飄模型該模型由Ye[13]于2007年提出,在直角雙曲線模型的基礎上進行了修正。葉子飄模型可較好擬合低光照強度和光抑制下植物的凈光合速率:

(5)

式中:b為模型的修正系數(shù);c為CO2響應曲線的初始斜率與最大凈光合速率的比值(b、c單位均為 mol·μmol-1)。

1.3.4 非直角雙曲線模型非直角雙曲線模型由Thornley[12]于1976年提出,計算公式如下:

(6)

式中:θ表示Pn-Ci曲線的彎曲程度(0<θ≤1)。

1.3.5 Michaelis-Menten模型Michaelis-Menten模型(簡稱M-M模型)由Harley等[11]于2010年提出,計算公式如下:

(7)

式中:K表示米氏常數(shù)。

1.3.6 指數(shù)函數(shù)模型指數(shù)函數(shù)模型有多種表達式,公式(8)由Bassman等[14]提出的指數(shù)函數(shù)模型轉(zhuǎn)化而來,計算公式如下:

(8)

1.3.7 指數(shù)函數(shù)修正模型Chen等[15]于2011年提出了指數(shù)函數(shù)修正模型,計算公式如下:

Pn=de-gCi-fe-hCi

(9)

式中:d、f、h、g為模型的系數(shù)。

1.3.8 分段函數(shù)模型分段函數(shù)模型由段愛國等[22]于2009年提出,原模型基于二次多項式將弱光和強光分段擬合,計算公式如下:

(10)

式中:αd表示弱光階段的表觀量子效率;a、b、c均為模型的系數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

直角雙曲線模型、非直角雙曲線模型、指數(shù)函數(shù)模型、M-M模型擬合測試數(shù)據(jù)均在葉子飄開發(fā)的光合計算軟件中實現(xiàn)。利用OriginPro2021自定義指數(shù)函數(shù)修正模型和分段函數(shù)模型,再對測試數(shù)據(jù)進行擬合。FvCB模型擬合測試數(shù)據(jù)通過R語言中racir、plantecophys等程序包實現(xiàn)。

2 結果與分析

2.1 不同CO2響應曲線測試方法的測量特性

分析2種光合-CO2響應曲線技術的耗時,發(fā)現(xiàn)在測試過程中RACiR技術可以在短時間內(nèi)迅速調(diào)整CO2濃度,同時利用IRGA對這種迅速變化進行精確測量,從而在較短時間內(nèi)完成光合-CO2響應曲線的測量。但RACiR技術需要進行空葉室的校正測量,且所耗費時間與RACiR測量設定的時間需一致。另外RACiR測試的快慢也是相對而言,如果CO2濃度變化幅度較大,在考慮數(shù)據(jù)穩(wěn)定性的情況下,測1條完整的光合-CO2響應曲線也需要耗費15～20 min(表1)。理論上,在不考慮空葉室校正耗費的時間上,RACiR比A-Ci測試耗時要節(jié)約近50%的時間。

表1 A-Ci和RACiR完成1條完整光合-CO2響應曲線測試耗時Table 1 Time consumed for one measurement of A-Ci and RACiR tests

2.2 A-Ci和RACiR擬合參數(shù)的比較

測量光合-CO2響應曲線后,利用模型計算得到碳同化過程中有關生化限制的機制參數(shù),如最大羧化速率(Vc,max)以及最大電子傳遞效率(Jmax)等。RACiR測試方法開發(fā)的主要目的也是表型研究中求Vc,max和Jmax,其對暗呼吸速率Rd的參數(shù)計算不太穩(wěn)定。本研究結果表明,RACiR與A-Ci的測試結果具有較高的一致性。由于光合-CO2模型均由FvCB模型演化或者簡化而得,本研究首先運用FvCB模型對2種測試方法所測得的數(shù)據(jù)進行擬合分析(圖1、2),結果表明除暗呼吸速率(Rd)在RACiR和A-Ci之間有較大差異外,2種方法在考慮葉片自身差異所帶來的誤差下,所測的各特征參數(shù)差異均在可接受誤差范圍內(nèi)(圖3,表2)。

圖1 基于A-Ci采用FvCB模型模擬不同CO2濃度下的光合速率Fig.1 Simulated photosynthetic rates of A-Ci by FvCB model at different CO2 concentrations

圖2 基于RACiR采用FvCB模型模擬不同CO2濃度下的光合速率Fig.2 Simulated photosynthetic rates of RACiR by FvCB model at different CO2 concentrations

圖3 不同CO2濃度下A-Ci與RACiR光合速率實測值Fig.3 Measured photosynthetic rates of A-Ci and RACiR at different CO2 concentrations

表2 基于FvCB模型擬合A-Ci和RACiR曲線得到的水稻葉片光合特征參數(shù)Table 2 Photosynthetic characteristic parameters fitted by FvCB model from A-Ci and RACiR curve in leaves of rice

2.3 不同光合-CO2響應模型擬合效果的比較

由于試驗1與試驗2結果相似,本研究主要采用7種由FvCB簡化的光合-CO2響應模型來擬合試驗1中A-Ci和RACiR的測試數(shù)據(jù)(圖4),各模型擬合R2均大于0.98,說明擬合程度較好。在光合特征參數(shù)上,各模型則有不同的表現(xiàn),模型擬合出的初始斜率即初始羧化效率(α)為0.08～0.18,其中葉子飄模型、非直角雙曲線模型、指數(shù)函數(shù)模型、指數(shù)函數(shù)修正模型的計算結果均較為接近,而直角雙曲線模型所模擬的值則略高于其余模型。在最大凈光合速率(Pnmax)的模擬中,葉子飄模型、指數(shù)函數(shù)修正模型、分段函數(shù)模型的模擬值與實測值最為接近,其余模型都存在較大程度的高估,特別是直角雙曲線模型與M-M模型。在CO2飽和點即胞間CO2飽和點(Cisat)的模擬中,葉子飄模型、指數(shù)函數(shù)修正模型的模擬值與實測值最為接近,其余模型都存在較高程度的高估或者低估。而CO2補償點即胞間CO2補償點(Г*)的模擬中,只有分段函數(shù)模型的模擬值嚴重低估(表3、4)。光呼吸速率各模型的差異則較大,總體變化為-8～11 μmol·m-2·s-1。

圖4 基于A-Ci(A)和RACiR(B)采用7種模型模擬不同CO2濃度下的光合速率Fig.4 Simulated photosynthetic rates of A-Ci(A)and RACiR(B)by 7 models at different CO2 concentrations

表3 利用7種光合-CO2響應模型擬合試驗1的A-Ci曲線得出的特征參數(shù)Table 3 Characteristic parameters fitted by seven CO2 response models with A-Ci curve in Experiment 1

表4 利用7種光合-CO2響應模型擬合試驗1中RACiR曲線得出的特征參數(shù)Table 4 Characteristic parameters fitted by seven CO2 response models with RACiR curve in Experiment 1

3 討論

3.1 不同光合-CO2響應模型的比較與評價

為了更便捷地研究高等植物的光合生理生態(tài)以及評估全球CO2濃度升高對植物的影響,前人提出了許多光合-CO2響應模型及其改進版本。本研究比較了2種光合-CO2曲線測試方法,并利用目前應用較為廣泛的7種由FvCB模型簡化而來的光合-CO2曲線擬合模型進行相關參數(shù)的擬合。綜合比較7種模型的模擬值與實測值,發(fā)現(xiàn)葉子飄模型較為可靠,若單看某一光合特征參數(shù)的話,則各模型各有優(yōu)缺點。模型的擬合結果很大程度上依賴各模型的調(diào)參算法,部分模型需要不斷調(diào)整參數(shù)限定范圍才可以得出較為理想的參數(shù)值,調(diào)參過程較為繁瑣,且多數(shù)情況下僅通過R2值大小并不能判斷擬合的參數(shù)值是否符合實際。其中,對直角雙曲線模型、非直角雙曲線模型、M-M模型來說,如果利用Pnmax=CE×Cisat-Rp計算CO2飽和點,則CE的計算受到數(shù)據(jù)點數(shù)量和質(zhì)量的影響。如果在CO2濃度≤200 μmol·mol-1范圍內(nèi)的測試數(shù)據(jù)點較少,會使得計算出的CE與實際相差較大。指數(shù)函數(shù)模型在計算CO2飽和點時對假設條件也有要求,究竟是假設凈光合速率為0.99Pnmax還是0.9Pnmax時所對應的CO2濃度為CO2飽和點取決于實測值,并不是選擇0.99Pnmax和0.9Pnmax都能成功計算出CO2飽和點。由于在CO2濃度>200 μmol·mol-1時是基于二次多項式進行模擬的,因此分段函數(shù)模型在曲線最高點后不會有“平臺階段”(即CO2濃度達到一定水平后凈光合速率保持不變的階段),這本身與植物實際的光合生理不太相符。另外,M-M模型和直角雙曲線模型擬合出的參數(shù)值幾乎一樣,其他模型在計算光合參數(shù)時則表現(xiàn)出一定的差異。在計算CO2補償點時,最好能有較多的凈光合速率<0的數(shù)據(jù)點才比較準確。但傳統(tǒng)光合-CO2響應曲線(A-Ci)測試基本上只有1～2個點Pn<0,數(shù)據(jù)點的數(shù)量有限,可能會影響CO2補償點的計算。

3.2 RACiR與A-Ci光合-CO2響應曲線測試方法的比較

RACiR測試方法很大程度上提高了光合-CO2曲線的測試效率,同時在一定程度上降低了由于測試時間較長帶來的酶激活狀態(tài)的變化、葉綠體的移動及氣孔開度變化帶來的誤差。本研究結果表明,RACiR測試方法所獲得的各特征參數(shù)的可靠性與A-Ci相似,且其相對于傳統(tǒng)的測試方法可縮短50%左右的時間。但同時RACiR測試方法也存在一些弊端。其一,采用RACiR方法測試時不能同步測量熒光參數(shù)。熒光參數(shù)的測量需要在幾秒內(nèi)進行飽和脈沖,這與RACiR方法測試時需要在短時間內(nèi)迅速調(diào)整葉室內(nèi)CO2的濃度并記錄相沖突。其二,同一測試者無法同時操作多臺儀器進行RACiR的測試。這主要是因為RACiR測試過程中需要測試者時刻關注儀器的狀態(tài)變化并進行相應操作。其三,RACiR方法在測試過程中不能實時查看數(shù)據(jù)是否存在異常,主要是由于RACiR方法需要通過空葉室校正后才能得到最終需要的數(shù)據(jù),且測量數(shù)據(jù)的準確性依賴于空葉室校正的準確性。其四,RACiR方法容易因為操作問題而無法獲取CO2補償點的實測值。一般C3植物的CO2補償點在40～50 μmol·mol-1,如果低CO2濃度(低于200 μmol·mol-1)下出現(xiàn)數(shù)據(jù)異常,則不能得到胞間CO2補償點。

隨著近些年作物表型組學在育種中的作用不斷凸顯,高通量表型獲取需求也更加強烈[23],而測試時間較長一直是光合表型高通量獲取的難點。RACiR方法的高效性將為未來高通量的光合表型獲取提供有力的技術支撐。由于本研究僅僅是做比較分析,并未針對所發(fā)現(xiàn)的RACiR方法測試過程中存在的弊端做相應的改進工作,今后的研究更需要關注如何在提高光合測試效率的同時解決以上弊端。另外,雖然本研究中RACiR方法的測試時間相對于A-Ci測試方法縮短約50%,但若想發(fā)展成為高通量的測試技術仍需進一步提高測試效率。同時,由于RACiR所用的CO2濃度變化速率局限于100 μmol·mol-1·min-1,不能更快,因此RACiR也存在一定的局限。近年來也有學者提出新的非穩(wěn)態(tài)測量技術即動態(tài)吸收測量技術(DAT),其CO2濃度變化速率最快可達400 μmol·mol-1·min-1[24]。在植物脅迫和表型平臺的研究中為了獲得更高的測試效率也可以不進行完整的曲線測試,而對200～800 μmol·mol-1CO2進行測試,測試時間可以進一步下降50%。非穩(wěn)態(tài)的光合測量技術將為突破光合參數(shù)獲取時間限制提供重要技術手段,后續(xù)可進一步圍繞非穩(wěn)態(tài)的測量技術探究一種更高效便捷的測量方法。

本研究通過采用快速光合-CO2響應曲線(RACiR)可使水稻光合生理研究者在保證數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)光合-CO2響應曲線(A-Ci)相似的基礎上,在一定程度上提高光合-CO2響應曲線測試效率,且由于測試的數(shù)據(jù)量大,在光合模擬上也更容易獲得穩(wěn)定的特征參數(shù)。綜合比較7個由FvCB模型簡化而來的模型后,發(fā)現(xiàn)葉子飄模型擬合出的光合特征參數(shù)較為可靠,且其開發(fā)的光合計算系統(tǒng)擬合得到的參數(shù)也較為穩(wěn)定合理。本研究結果將為水稻光合作用-CO2響應的生理生態(tài)研究選用合適的測試方式和擬合模型以及未來高通量光合表型獲取技術提供理論依據(jù)。