湯淑亞,李子桀,侯啟華,郭堅(jiān)華,蔣春號(hào)

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物農(nóng)藥與綠色植保實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210095)

番茄青枯病是由茄科勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一種細(xì)菌性土傳病害,該病害發(fā)生后難以控制,造成番茄大面積枯萎死亡,嚴(yán)重制約番茄生產(chǎn)的果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。目前傳統(tǒng)防治措施效果不穩(wěn)定、易污染環(huán)境、防效不理想等問題突出[3]。生物防治因其環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、安全等優(yōu)點(diǎn),受到生產(chǎn)者和研發(fā)者的青睞,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛使用。據(jù)報(bào)道,青枯病的生物防治措施主要包括植物源活性物質(zhì)和微生物菌劑的利用。其中已報(bào)道的微生物菌劑主要有無致病力青枯菌(R.solanacearum)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和芽胞桿菌屬(Bacillussp.)細(xì)菌[4-6]。其中芽胞桿菌因其對(duì)環(huán)境友好、定殖能力強(qiáng)、貯藏期長(zhǎng)等特質(zhì)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最多的生防細(xì)菌之一,因此,深入解析芽胞桿菌防治青枯病的作用機(jī)制對(duì)青枯病生物防治技術(shù)的廣泛應(yīng)用具有深遠(yuǎn)意義。研究表明,芽胞桿菌可通過產(chǎn)生抗菌蛋白、抗生素等拮抗物質(zhì),與青枯菌競(jìng)爭(zhēng)碳水化合物、無機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),或通過誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生系統(tǒng)抗性來防治青枯病[7-9]。

植物系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquire resistance,SAR)與誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance,ISR)是植物體內(nèi)2種不同的誘導(dǎo)抗性,前者由植物病原菌誘導(dǎo)獲得,后者由非致病根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)誘導(dǎo)產(chǎn)生[10]。植物系統(tǒng)抗性的產(chǎn)生是由于PGPR的刺激激活了植物防衛(wèi)反應(yīng),并通過某種途徑將這一反應(yīng)擴(kuò)散到植物體其他部位,從而抵御病原菌侵染[11]。研究發(fā)現(xiàn)如果植物預(yù)先與枯草芽胞桿菌(B.subtilis)、蠟質(zhì)芽胞桿菌(B.cereus)等根際促生菌接觸,則可誘導(dǎo)植物ISR的產(chǎn)生,從而抵御青枯病、根結(jié)線蟲病、晚疫病等病害的侵染[12]。乙烯是ISR誘導(dǎo)系統(tǒng)中的重要信號(hào)分子。Knoester等[13]發(fā)現(xiàn)乙烯信號(hào)突變型植株失去了被熒光假單胞桿菌(P.fluorescens)誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性的能力,證明ISR機(jī)制的建立與乙烯信號(hào)通路密切相關(guān)。乙烯響應(yīng)因子(ethylene responsive factor,ERF)是AP2/ERF超家族蛋白,研究表明ERF轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控乙烯反應(yīng)基因表達(dá),從而調(diào)節(jié)乙烯的生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)[14]。但ERF轉(zhuǎn)錄因子是否參與芽胞桿菌誘導(dǎo)的ISR尚不清楚。

蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156是本課題組前期從森林樹木根圍土壤中分離的一株植物根際促生細(xì)菌(PGPR)。菌株AR156通過誘發(fā)植物自身的抗病潛能增強(qiáng)植物的抗病性,從而高效防治多種病害[15]。前期通過對(duì)蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156防治植物病害的機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性研究,發(fā)現(xiàn)AR156關(guān)鍵作用機(jī)制是誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。賀蟬等[16]研究表明菌株AR156激活MAPK通路誘導(dǎo)擬南芥對(duì)丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000,PstDC3000)產(chǎn)生系統(tǒng)抗性;Jiang等[17]研究表明菌株AR156通過抑制miR472和激活CNLs介導(dǎo)的擬南芥基礎(chǔ)免疫,從而觸發(fā)對(duì)PstDC3000的系統(tǒng)抗性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)菌株AR156可誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)抗性,抵御番茄青枯病、根結(jié)線蟲病等病害的侵染,但其誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生對(duì)青枯病的抗性機(jī)制仍有待研究。

本研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù),對(duì)調(diào)控AR156誘導(dǎo)番茄對(duì)青枯菌系統(tǒng)抗性的關(guān)鍵基因進(jìn)行挖掘,并對(duì)鑒定出的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ERF1a的生物學(xué)功能及生化功能進(jìn)行研究,為蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156防治青枯病的生防機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物及微生物材料

番茄種子經(jīng)表面消毒、催芽后播種于穴盤中,待番茄苗生長(zhǎng)至四真葉期進(jìn)行移栽,每個(gè)盆缽種植1株,移栽后7 d左右進(jìn)行試驗(yàn)處理。培養(yǎng)條件:25 ℃,光周期為長(zhǎng)日照(光照/黑暗培養(yǎng)時(shí)間16 h/8 h)。

試驗(yàn)菌株及質(zhì)粒見表1。生防菌蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156在LB液體培養(yǎng)基(1 L配方:酵母浸粉5 g,胰蛋白胨10 g,NaCl 10 g,pH7.2)中37 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)24 h,所得菌液于4 ℃、6 000 r·min-1離心10 min,用水調(diào)至5×108CFU·mL-1,備用。青枯菌GMI1000在YGPA液體培養(yǎng)基[1 L配方:酵母浸粉5 g,蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,pH(7.0～7.2)]中28 ℃、250 r·min-1培養(yǎng)24 h,所得菌液于4 ℃、6 000 r·min-1離心 10 min,用水調(diào)至5×107CFU·mL-1,備用。

表1 試驗(yàn)菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in the study

1.2 番茄植株生物量的測(cè)定

選取移栽后長(zhǎng)勢(shì)一致的植株,分別向每盆番茄根部灌入25 mL AR156菌液,對(duì)照組以等體積的清水代替,每個(gè)處理24株,3次生物學(xué)重復(fù)。處理14 d后,用卷尺、游標(biāo)卡尺以及天平測(cè)量番茄株高、莖粗、地上部鮮重。

1.3 VIGS(virus-induced gene silencing)沉默接種及沉默效率檢測(cè)

利用https://vigs.solgenomics.net/網(wǎng)站進(jìn)行SlERF1a基因VIGS沉默片段的篩選與引物設(shè)計(jì),引物見表2。以番茄cDNA為模板,利用引物ERF1a-VIGS-F/R進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增后的片段經(jīng)過XbaⅠ、BamHⅠ雙酶切后連接到pTRV2載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pTRV2-SlERF1a。利用電轉(zhuǎn)化的方法,將陰性對(duì)照pTRV2、陽(yáng)性對(duì)照pTRV2-SlPDS1以及pTRV2-SlERF1a質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101中,利用篩選培養(yǎng)基及菌落PCR技術(shù)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,使用甘油保存法將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子保存于-80 ℃。

根癌農(nóng)桿菌菌株pTRV1、pTRV2、pTRV2-SlERF1a、pTRV2-SlPDS1在LB液體培養(yǎng)基(50 μg·ml-1Km,25 μg·mL-1Rif)中,28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)16 h。離心收集菌體,用懸浮液(10 mmol·L-1MgCl2,10 mmol·L-1MES,150 μmol·L-1AS)調(diào)整濃度為2×109CFU·mL-1。然后將重懸液pTRV1分別與pTRV2、pTRV2-SlPDS1、pTRV2-SlERF1a的重懸液按1∶1體積比混合均勻,混合后的菌液在常溫靜置3 h或28 ℃、200 r·min-1振蕩1 h。

用針頭在番茄子葉背面扎幾個(gè)小孔,用1 mL注射器將混合后的菌液沿著小孔注射入番茄葉片。在陽(yáng)性對(duì)照pTRV2-SlPDS1沉默植株出現(xiàn)白化表型后(注射后15 d左右),每個(gè)處理取3個(gè)重復(fù),分別提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到的cDNA片段以Actin作為內(nèi)參基因,采用半定量RT-PCR鑒定沉默植株中ERF1a基因的表達(dá)。

表2 引物序列Table 2 Primers sequence

1.4 番茄青枯病溫室防效試驗(yàn)

設(shè)置AR156處理組和清水對(duì)照組。選擇移栽7 d后的番茄植株,每株灌入25 mL AR156菌液,以等體積的清水作為對(duì)照,每個(gè)處理24株,3次生物學(xué)重復(fù)。預(yù)處理5 d后,向處理組和對(duì)照組番茄根部灌入30 mL GMI1000青枯菌液,觀察并統(tǒng)計(jì)各處理番茄的發(fā)病情況。

根據(jù)植株葉片萎蔫程度,將番茄青枯病病害[19]級(jí)別分為5級(jí)。0級(jí):植株正常;1級(jí):植株葉片萎蔫程度不超過25%;2級(jí):植株葉片萎蔫程度超過25%且不超過50%;3級(jí):植株葉片萎蔫程度超過50%且不超過75%;4級(jí):植株葉片萎蔫程度超過75%。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%。

病情指數(shù)=∑(病級(jí)數(shù)×該病級(jí)植株數(shù))/(最大病級(jí)數(shù)×植株總株數(shù))×100%。

防治效果=(對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100%。

1.5 RNA提取及RT-qPCR分析

按照AR156及清水預(yù)處理時(shí)間點(diǎn)或青枯菌GMI1000接種時(shí)間點(diǎn),收集番茄葉片,置于液氮速凍,每個(gè)處理使用5株植物的葉片,3次生物學(xué)重復(fù)。利用TRIzol法提取葉片總RNA,使用瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量,將合格的RNA樣品送往華大基因公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,通過生物信息學(xué)分析差異表達(dá)的基因。

將預(yù)處理0、3、5 d的番茄葉片總RNA使用HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以Actin作為內(nèi)參基因,使用qPCR-SlERF1a-F/R、qPCR-SlPR1-F/R、qPCR-SlPIN2-F/R、qPCR-SlActin-F/R引物對(duì)(表2)和SYBR GREEN PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR分析。反應(yīng)體系:2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10.0 μL,50×ROX reference Dye Ⅱ 0.4 μL,前、后引物各0.4 μL,cDNA(1/10)2.0 μL,ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT方法計(jì)算SlERF1a、SlPR1、SlPIN2基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 亞細(xì)胞定位分析

利用pENTR Directional TOPO Cloning Kits User Manual與Gateway_LR_Clonase_II_Enzyme_Mix試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒pEG104-SlERF1a-YFP,將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒pEG104-EV-YFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),使用注射器將農(nóng)桿菌菌液注入煙草葉片中,處理后的煙草黑暗培養(yǎng)48 h,取樣制作玻片,使用蔡司(Zeiss LSM710)激光共聚焦顯微鏡觀察SlERF1a亞細(xì)胞定位情況。具體參照張悅婧等[20]的方法進(jìn)行煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)。

1.7 轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)

為了研究SlERF1a的轉(zhuǎn)錄激活活性并確定激活域,將SlERF1a基因分為2部分:ERF1aΔC、ERF1aΔN。利用同源重組酶將SlERF1a全長(zhǎng)、ERF1aΔC、ERF1aΔN3個(gè)片段連接到pGBKT7酵母表達(dá)載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-SlERF1a、pGBKT7-SlERF1aΔC、pGBKT7-SlERF1aΔN。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒pGBKT7轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中,使用SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基,在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d。挑取酵母單菌落,用100 μL無菌水重懸,按照10-1、10-2、10-3濃度梯度進(jìn)行稀釋,取10 μL菌液點(diǎn)在SD-Trp與含有X-α-Gal的SD/-Trp/-Ade/-His培養(yǎng)基上,倒置培養(yǎng)3 d,拍照記錄。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)評(píng)估2種以上處理的顯著性,采用DPS 7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和標(biāo)準(zhǔn)誤,并對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

圖1 AR156對(duì)番茄的促生作用Fig.1 The growth-promoting effect of AR156 on tomatoA. AR156或清水預(yù)處理5 d后,番茄生長(zhǎng)表型對(duì)比。AR156處理:使用25 mL 5×108 CFU·mL-1AR156菌液灌根番茄;H2O處理:使用25 mL清水灌根番茄。B. AR156或清水預(yù)處理5 d后,番茄各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)對(duì)比。圖中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。下同。A. Comparison of tomato growth phenotypes after pretreatment with AR156 or water for 5 days. AR156 treatment:25 mL of AR156 bacterial solution with a concentration of 5×108 CFU·mL-1 was used to irrigate tomato roots;H2O treatment:25 mL of water was used to irrigate tomato roots. B. Comparison of various growth indicators of tomato after pretreatment with AR156 or water for 5 days. Different lowercase letters in the figure indicate statistically significant differences at 0.05 level. The same as follows.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株AR156對(duì)番茄的促生抗病作用

由圖1可見:與清水對(duì)照組相比,AR156處理組中番茄植株的株高、莖粗、地上部鮮重等生長(zhǎng)指標(biāo)均有不同程度的增加。AR156預(yù)處理對(duì)地上部鮮重的促進(jìn)作用最為顯著,與清水預(yù)處理相比,地上部鮮重增加29.21%,株高和莖粗分別增加21.25%和11.30%,表明AR156對(duì)番茄具有促生作用。

使用清水預(yù)處理5 d的番茄接種GMI1000,10 d后枝葉萎蔫明顯,而用AR156預(yù)處理5 d,再接種GMI1000的植株大部分枝葉仍處于挺立狀態(tài)(圖2-A),發(fā)病率和病情指數(shù)與對(duì)照相比都顯著降低,AR156防效約為56.33%(圖2-B,表3)。前期研究表明,AR156可誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)抗性,抵御PstDC300侵染[18]。為驗(yàn)證AR156可通過誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)抗性防治青枯病,在AR156預(yù)處理0、3、5 d后,提取番茄葉片RNA,利用RT-qPCR檢測(cè)番茄葉片中防御基因SlPR1和SlPIN2的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)在AR156預(yù)處理后,SlPR1、SlPIN2表達(dá)量均呈上升趨勢(shì),SlPR1基因表達(dá)量先上升后略下降,SlPIN2基因表達(dá)量先下降后上升(圖2-C和D),說明AR156可調(diào)控防御基因的表達(dá),誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生對(duì)青枯病系統(tǒng)抗性,從而降低青枯病發(fā)病率。

圖2 AR156誘導(dǎo)番茄對(duì)青枯病的系統(tǒng)抗性Fig.2 AR156 induces systemic resistance to bacterial wilt in tomatoA. AR156或清水預(yù)處理5 d后,番茄對(duì)青枯病抗病性表型。B. AR156或清水預(yù)處理5 d后,青枯病在番茄上的病情指數(shù)。C、D. AR156或清水預(yù)處理0、3、5 d后,番茄葉片中SlPR1和SlPIN2基因表達(dá)量變化。列上方的雙星號(hào)表示在0.01水平顯著差異,不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著,n.s.表示無顯著差異。 下同。A. Phenotypes of tomato resistance to bacterial wilt after pretreatment with AR156 or water for 5 days. B. Disease index of bacterial wilt on tomato after pretreatment with AR156 or water for 5 days. C,D. Changes of SlPR1 and SlPIN2 genes expression in tomato leaves after AR156 or water pretreatment for 0,3 and 5 days. Double asterisks above columns indicate statistically significant differences at 0.01 level,different lowercase letters indicate statistically significant differences at 0.05 level,n.s. means no significant difference. The same as follows.

2.2 菌株AR156影響番茄基因表達(dá)

表3 在野生型(WT)番茄中,AR156對(duì)番茄青枯病的 防治效果

為探索AR156誘導(dǎo)番茄對(duì)青枯病的系統(tǒng)抗性機(jī)制,取清水和AR156預(yù)處理2、3 d后的番茄葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,篩選獲得參與AR156誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性相關(guān)基因。結(jié)果顯示,AR156處理引起大量番茄植株基因表達(dá)水平變化(圖3-A)。在預(yù)處理2 d后,與對(duì)照相比,AR156引起222個(gè)基因差異表達(dá),其中有142個(gè)為上調(diào)基因,80個(gè)為下調(diào)基因;處理3 d后,有522個(gè)基因差異表達(dá),其中上調(diào)基因503個(gè),下調(diào)基因19個(gè)(圖3-B)。韋恩圖(圖3-C)顯示,有15個(gè)基因在2次處理中均差異表達(dá),其中乙烯響應(yīng)因子Solyc06g035700.1(SlERF1a),在AR156處理3 d后表達(dá)量顯著上調(diào)。

為驗(yàn)證SlERF1a基因在AR156誘抗過程中的表達(dá)量變化,提取清水或AR156預(yù)處理3 d后的番茄葉片RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用適量cDNA進(jìn)行RT-qPCR。結(jié)果(圖4-A)顯示,SlERF1a基因表達(dá)量在AR156預(yù)處理后顯著升高,說明SlERF1a在AR156誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性期間上調(diào)表達(dá),有可能參與AR156誘導(dǎo)的ISR。此外,本研究發(fā)現(xiàn)在AR156預(yù)處理5 d后,在接種或未接種青枯菌GMI1000的番茄植株中,相較于清水對(duì)照,SlERF1a基因表達(dá)量均顯著上升(圖4-B),且接種GMI1000后,相較于未接種植株,SlERF1a基因表達(dá)量上調(diào)顯著,因此猜想SlERF1a可能在蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生對(duì)青枯病系統(tǒng)抗性中發(fā)揮重要作用。

圖3 蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156處理番茄后誘導(dǎo)相關(guān)基因差異性表達(dá)Fig.3 Differential expression of related genes induced by Bacillus cereus AR156 in tomatoAR156或清水預(yù)處理2、3 d后,番茄差異基因表達(dá)分析熱圖(A)、燦圖(B)和韋恩圖(C)。紅色表示上調(diào),藍(lán)色表示下調(diào)。Heat map(A),volcano plot(B)and Venn diagram(C)of tomato differential gene expression analysis of tomato after pretreatment with AR156 or water for 2 and 3 days. Red means up-regulation,blue means down-regulation. dpi:Days post inoculation.

圖4 AR156對(duì)SlERF1a基因表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of AR156 on SlERF1a gene expression levelA. RT-qPCR檢測(cè)AR156預(yù)處理3 d后的番茄植株內(nèi)SlERF1a基因相對(duì)表達(dá)量。Detection of relative expression level of SlERF1a gene in tomato plants pretreated with AR156 for 3 days by RT-qPCR. B. AR156預(yù)處理5 d后的番茄植株,接種GMI1000 24 h后,檢測(cè)SlERF1a基因相對(duì)表達(dá)量。Tomato plants were pretreated with AR156 for 5 days,then inoculated with GMI1000,and detected the relative expression level of SlERF1a gene 24 hours later.

2.3 SlERF1a參與調(diào)控AR156誘導(dǎo)的ISR

本研究成功構(gòu)建了SlERF1a沉默植株(圖5-A)。通過提取注射TRV2-SlERF1a菌株的番茄植株RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行半定量PCR,發(fā)現(xiàn)與注射TRV2菌株的植株相比,該處理組植株SlERF1a的表達(dá)量明顯下降(圖5-B),說明SlERF1a已成功沉默,表明SlERF1a沉默植株可用于后續(xù)試驗(yàn)。

利用VIGS基因沉默技術(shù)將SlERF1a基因沉默后,沉默植株對(duì)青枯病的敏感性顯著增強(qiáng)(圖5-C,表4),說明SlERF1a正向調(diào)控番茄抗病性。為進(jìn)一步驗(yàn)證SlERF1a轉(zhuǎn)錄因子在蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生對(duì)青枯病系統(tǒng)抗性中的作用,統(tǒng)計(jì)并分析SlERF1a沉默前、后青枯病發(fā)病率、病情指數(shù)以及AR156對(duì)番茄青枯病的防效。在基因沉默后,AR156處理組與對(duì)照組相比發(fā)病率沒有顯著差異,且防效下降,說明在SlERF1a沉默植株中AR156抗病性下降,表明SlERF1a正向調(diào)控AR156觸發(fā)的系統(tǒng)抗性。同時(shí),AR156在SlERF1a沉默后仍保留部分防效,說明生防菌誘抗機(jī)制是多樣的,SlERF1a的表達(dá)上調(diào)只是AR156誘抗機(jī)制中的一種而非全部。綜上,轉(zhuǎn)錄因子SlERF1a可參與調(diào)控AR156誘導(dǎo)番茄對(duì)青枯病系統(tǒng)抗性。

圖5 SlERF1a基因沉默番茄植株構(gòu)建與抗病性鑒定Fig.5 Construction and disease resistance identification of SlERF1a gene-silenced tomato plantsA. SlERF1a基因沉默植株表型The phenotype of SlERF1a-silenced plant;B. SlERF1a基因沉默植株驗(yàn)證Validation of SlERF1a-silenced plants;C. AR156或清水預(yù)處理5 d后,青枯病在野生型番茄(WT)、SlERF1a基因沉默番茄RSV上的病情指數(shù)The disease index of bacterial wilt in wild-type tomatoes(WT)and SlERF1a silent tomatoes RSV after AR156 or water pretreatment for 5 days.

表4 在野生型番茄、SlERF1a基因沉默番茄(RSV)中AR156對(duì)番茄青枯病的防治效果Table 4 Control effect of AR156 on tomato bacterial wilt in WT tomatoes and SlERF1a silent tomatoes(RSV)

圖6 SlERF1a蛋白的亞細(xì)胞定位(A)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性分析(B)Fig.6 Subcellular localization(A)and transcriptional regulatory activity(B)of SlERF1a protein

2.4 SlERF1a定位于細(xì)胞核且具有轉(zhuǎn)錄激活活性

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在煙草中表達(dá)SlERF1a,通過激光共聚焦顯微鏡觀察SlERF1a的亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組熒光分布于整個(gè)葉片細(xì)胞,而pEG104-SlERF1a處理組熒光僅定位于細(xì)胞核中(圖6-A),說明SlERF1a是一個(gè)核蛋白。此外,轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pGBKT7-SlERF1a的酵母能夠在SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),且在含有X-α-Gal的SD/-Trp-His-Ade平板上變藍(lán)(圖6-B),說明SlERF1a轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性。為進(jìn)一步確定SlERF1a轉(zhuǎn)錄激活域,構(gòu)建了pGBKT7-SlERF1aΔC、pGBKT7-SlERF1aΔN重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)入酵母菌株中(圖7-A)。所有的酵母細(xì)胞在SD/-Trp培養(yǎng)基上均可正常生長(zhǎng),但只有pGBKT7-SlERF1a和pGBKT7-SlERF1aΔN酵母菌可以在SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),且在含有X-α-Gal的SD/-Trp-His-Ade平板上變藍(lán)(圖7-B)。表明SlERF1a的轉(zhuǎn)錄激活域位于C末端。

圖7 SlERF1a蛋白轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域分析Fig.7 Analysis of the transcriptional activation domain of SlERF1a proteinA. 用于SlERF1a轉(zhuǎn)錄激活域分析的結(jié)構(gòu)示意圖。條形上方的數(shù)字表示氨基酸殘基的位置。Schematic diagram of the structure used for SlERF1a transcriptional activation domain analysis. The numbers above the bars indicate the positions of amino acid residues.B. SlERF1a轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域檢測(cè)。SlERF1a transcriptional activation domain detection.

3 討論與結(jié)論

近年來,青枯病的生物防治在生防菌的開發(fā)、無致病力青枯病菌的篩選及轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建等方面的研究取得較大進(jìn)展[21]。其中,生防菌的合理利用是青枯病生物防治的重要內(nèi)容,不僅達(dá)到防治病害的目的,而且增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性,促進(jìn)植物生長(zhǎng)。用于防治青枯病的生防菌包括芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、鏈霉菌屬(Streptomycessp.)等有益微生物,其生防機(jī)制主要有利用寄生、競(jìng)爭(zhēng)、抗生、交叉保護(hù)等拮抗機(jī)制抑制青枯病菌生長(zhǎng),或者誘導(dǎo)植物對(duì)青枯病產(chǎn)生系統(tǒng)抗性,從而降低青枯病發(fā)病率[22]。目前,生防菌防治植物病害的機(jī)制各不相同。很多菌株防病的具體作用機(jī)制尚不明確,導(dǎo)致菌劑在進(jìn)入實(shí)際生產(chǎn)后由于缺乏系統(tǒng)的理論依據(jù),難以在田間發(fā)揮穩(wěn)定效果[23]。因此,為進(jìn)一步探索青枯病生防機(jī)制,本研究采用蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156為供試生防菌,驗(yàn)證得出AR156能促進(jìn)番茄生長(zhǎng),并誘導(dǎo)番茄對(duì)青枯菌GMI1000產(chǎn)生系統(tǒng)抗性,從而抵御青枯病侵染。

根際促生菌(PGPR)是一類生存于植物根系、對(duì)植物兼具促生及抗病效果的生防菌。研究表明,PGPR可通過調(diào)節(jié)植物防衛(wèi)機(jī)制來降低植物病害的發(fā)生,這種抗病性被稱為誘導(dǎo)系統(tǒng)抗病性(ISR)[24]。近期研究表明,解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽胞桿菌(B.subtilis)、蠟質(zhì)芽胞桿菌(B.cereus)等均可誘導(dǎo)番茄ISR的產(chǎn)生,抵御青枯病侵染[9,12]。蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156是一種根際促生細(xì)菌,可以在擬南芥和番茄上誘導(dǎo)對(duì)PstDC3000的系統(tǒng)性抗性[12,18]。根際促生菌誘導(dǎo)的植物抗病機(jī)制非常復(fù)雜,不同的PGPR-寄主植物-病原菌組合,誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性機(jī)制及其所依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也不同[25]。在以往研究中,大多數(shù)以模式植物擬南芥為植物材料研究AR156誘導(dǎo)抗病機(jī)制,對(duì)于AR156誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)抗性機(jī)制尚不明確。因此,為明晰AR156誘導(dǎo)番茄產(chǎn)生系統(tǒng)抗性機(jī)制,本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)R156預(yù)處理后番茄相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)1個(gè)ERF家族的SlERF1a轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量顯著上調(diào),而在接種青枯菌GMI1000后,其表達(dá)量上調(diào)更顯著,表明SlERF1a在AR156誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性過程中被顯著上調(diào),說明SlERF1a極有可能參與AR156誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)抗性過程。

AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子與植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)[26]。ERF亞家族轉(zhuǎn)錄因子ERF1[27]、ORA59[28]被證明均在茉莉酸(JA)和乙烯(ET)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。熒光假單胞菌(P.fluorescens)WCS417r通過JA/ET信號(hào)通路并以NPR1依賴的方式在擬南芥中觸發(fā)ISR[29],表明JA/ET信號(hào)通路在生防菌誘導(dǎo)的ISR中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。Nie等[30]發(fā)現(xiàn)在乙烯、茉莉酸信號(hào)通路缺失突變體擬南芥中,AR156對(duì)PstDC3000的抗性下降,說明這2條信號(hào)通路的激發(fā)均能在一定程度上抑制病原菌在植物體內(nèi)的增殖,共同調(diào)節(jié)AR156誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性。Jiang等[31]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子WRKY70和WRKY11可分別通過激活SA、JA/ET不同信號(hào)通路調(diào)控AR156誘導(dǎo)ISR從而減少病害發(fā)生。AR156在這2種轉(zhuǎn)錄因子WRKY11和WRKY70單突變體中抗病能力下降,能夠保留部分防效,但在雙突變體植株中則完全喪失防效,表明WRKY11和WRKY70在AR156誘導(dǎo)的ISR中發(fā)揮重要調(diào)控作用,且存在功能冗余。本研究發(fā)現(xiàn),在SlERF1a沉默番茄中,AR156處理與清水對(duì)照組青枯病發(fā)病率沒有顯著差異,說明SlERF1a沉默后AR156對(duì)青枯病的抗病性顯著下降,表明SlERF1a參與調(diào)控AR156觸發(fā)的系統(tǒng)性抗性,揭示AR156可通過上調(diào)SlERF1a編碼基因表達(dá)誘導(dǎo)番茄對(duì)青枯病的系統(tǒng)抗性機(jī)制。此外,SlERF1a作為ERF亞家族轉(zhuǎn)錄因子,有可能通過調(diào)節(jié)JA/ET信號(hào)傳導(dǎo)從而調(diào)控AR156誘導(dǎo)的ISR。而在SlERF1a沉默后,AR156對(duì)青枯病仍具有顯著防效,說明AR156誘導(dǎo)的ISR可能不完全依賴于SlERF1a。但我們也無法排除因VIGS沉默技術(shù)沉默基因不完全導(dǎo)致SlERF1a仍能發(fā)揮部分功能的可能性[32],因此后續(xù)可通過構(gòu)建SlERF1a過表達(dá)植株對(duì)表型進(jìn)一步驗(yàn)證。

前期研究表明,AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子可參與植物防御反應(yīng)以應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫和病原體,例如非生物脅迫(冷、熱、干旱、鹽度、滲透脅迫)和生物脅迫(草食性昆蟲和微生物病原體)[33-34]。許多研究證明,過表達(dá)AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因植物可提高對(duì)非生物和生物脅迫的耐受性。在SlERF1a沉默番茄中,無論是否進(jìn)行AR156處理,沉默植株的病情指數(shù)都顯著高于野生型植株,說明ERF1a正向調(diào)控番茄對(duì)青枯病的抗性。先前的研究表明,在應(yīng)對(duì)生物脅迫時(shí),ERF轉(zhuǎn)錄因子可通過調(diào)控防御相關(guān)基因的表達(dá)[35]、激活靶基因誘導(dǎo)植物激素反應(yīng)[36]、調(diào)控程序性細(xì)胞死亡[37]等途徑參與植物防御反應(yīng)。因此,為了進(jìn)一步研究SlERF1a轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物抗性中的作用,本研究對(duì)ERF1a轉(zhuǎn)錄活性、亞細(xì)胞定位等生化功能進(jìn)行初步分析,結(jié)果表明SlERF1a是具有轉(zhuǎn)錄激活活性的核蛋白,且轉(zhuǎn)錄激活域位于C端,說明其可能作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子參與植物抗病過程,但對(duì)于其如何調(diào)控下游基因表達(dá),是否參與調(diào)節(jié)JA/ET信號(hào)傳導(dǎo)還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)AR156誘導(dǎo)的番茄對(duì)青枯病系統(tǒng)抗性依賴于SlERF1a編碼基因的上調(diào)表達(dá),同時(shí)SlERF1a可作為轉(zhuǎn)錄因子正向調(diào)控植物的基礎(chǔ)抗性。但SlERF1a在AR156誘導(dǎo)番茄對(duì)青枯病系統(tǒng)抗性過程中發(fā)揮的具體作用仍有待后續(xù)進(jìn)一步系統(tǒng)研究。