◎ 鄭陸紅，張慧瓊，陳 茹，黃柳霞

（1.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)公共實驗室，廣東 廣州 511442；3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站，廣東 廣州 511442）

氯霉素類藥物是一類廣譜抑菌抗生素，常見的氯霉素類藥物主要包括氯霉素（Chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP）和氟苯尼考（Florfenicol，F(xiàn)F）及其代謝物氟苯尼考胺（Florfenicol Amine，F(xiàn)FA）等[1]。氟苯尼考是一種新型酰胺醇類抗生素，氟苯尼考胺是氟苯尼考的主要代謝產(chǎn)物，通常以氟苯尼考胺作為動物體內(nèi)氟苯尼考的殘留標示物[2-3]。 氯霉素對人體的造血系統(tǒng)損害極大，易引起再生障礙性貧血，也可導致致命的“灰嬰綜合征”[4]，我國和歐盟等國家都禁止其在食用的動物源性產(chǎn)品中使用。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部250號公告將氯霉素列入了《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》[5]，不允許在動物食品中有殘留。由于甲砜霉素和氟苯尼考抗菌譜與氯霉素相似，較氯霉素其毒性有所降低，抗菌活性和安全性優(yōu)于氯霉素，目前已廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床防治細菌性疾病，但仍然對胚胎有影響[6]。為保障食品安全，我國制定了甲砜霉素和氟苯尼考在動物源性食品中的最大殘留限量，GB 31650—2019規(guī)定了甲砜霉素和氟苯尼考可用于豬、牛、羊、家禽和魚，但特別規(guī)定“家禽（產(chǎn)蛋禁用）”，最高殘留限量分別為50 μg·kg-1和100～3 000 μg·kg-1[7]。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLCMS/MS）法為目前檢測氯霉素類藥物最常用的方法。國內(nèi)外報道的動物組織中氯霉素類藥物的殘留檢測方法很多[8-11]，但存在許多局限性，不能滿足當前動物性食品中霉素素類藥物殘留檢測效率的需要。部分方法檢測藥物殘留種類覆蓋不全，缺少對氟苯尼考的殘留標示物氟苯尼考胺的檢測，或針對的動物組織不全，適用范圍有限等[12-15]。目前采用HPLC-MS/MS同時對豬肉、雞肉和魚肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量分析的檢測方法報道較少。本研究在GB/T 22338—2008[16]和GB 31658.5—2021[17]標準方法的基礎(chǔ)上進行改進，采用氯霉素-D5作為內(nèi)標，堿化乙酸乙酯提取，正己烷去除油脂，通過MCX固相萃取柱凈化，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測豬肉、雞肉和魚肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留的方法。本方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、定量準確，適用于大批量豬肉、雞肉和魚肉樣品中氯霉素類藥物的定性、定量分析，為政府加強對違規(guī)使用獸藥問題的監(jiān)管提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯霉素-D5（CAS 202480-68-0），BePure公司；氯霉素（CAS 56-75-7，純度98.0%），F(xiàn)irst Standard公司；甲砜霉素（CAS 15318-45-3，純度99.31%）、氟苯尼考（CAS 73231-34-2，純度99.90%）和氟苯尼考胺（CAS 76639-93-5，純度99.5%），Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯、乙腈、正己烷，色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司；乙酸分析純，天津市康科德科技有限公司；氨水，色譜純，上海安譜科技股份有限公司；Oasis MCX固相萃取小柱（60 mg/3 mL），美國Waters 公司；豬肉、雞肉和魚肉樣品采購于某網(wǎng)購平臺。

AB Sciex Triple Quad 4500高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，AB Sciex公司；分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；均質(zhì)機、MS3 digital漩渦混合器，德國IKA公司；Multi Reax渦旋振蕩器，德國Heidolph公司；AutoEva-6氮吹儀，杭州奧盛儀器公司；ROTINA 380R 離心機，德國Hettich公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試料的制備

取適量新鮮或解凍的空白或供試組織，絞碎，并均質(zhì)。

1.2.2 提取

稱取試樣2.0 g于50 mL離心管中，準確加入100 μL 100 ng·mL-1氯霉素-D5溶液，渦旋混勻，靜置15 min， 加入乙酸乙酯-氨水（98+2，V/V）溶液10 mL，振蕩1 min，10 000 r·min-1離心3 min，轉(zhuǎn)移上清液于另外一只離心管中，殘渣重復提取2次，合并3次提取液。離心管中加入5%乙酸2 mL，振蕩混勻，于40 ℃ 水浴中濃縮至1.5 mL。轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，用5%乙酸2 mL洗滌氮吹管，洗滌液轉(zhuǎn)移至同一離心管，加正己烷5 mL脫脂，振蕩1 min，10 000 r·min-1離心5 min，棄上層，下層提取液重復脫脂一次，備用。

1.2.3 凈化

將提取液轉(zhuǎn)移至MCX固相萃取小柱（60 mg/3 mL，使用前依次用2 mL甲醇和2 mL水活化）中，棄去。用2 mL 5%乙酸溶液淋洗，用5 mL 10%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，于40 ℃水浴中氮吹干。用0.5 mL 30%乙腈水溶溶解殘渣，混勻后經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后供UHPLC-MS/MS分析。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速： 0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量2 μL；流動相：A為0.1%氨水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0.00～1.30 min， 95%A；1.30～5.00 min，95%A→10%A； 5.00～6.00 min，10%A；6.0～6.01 min，5%A； 6.01～7.00 min，95%A。

1.2.5 質(zhì)譜條件

電噴霧（ESI）離子源，正負離子切換掃描模式；氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素-D5采用負離子掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），氣簾氣30 psi，碰撞氣9 psi，離子化電壓-4 500 V，溫度550 ℃，噴霧氣50 psi，輔助加熱器50 psi；氟苯尼考胺采用正離子掃描方式，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），氣簾氣30 psi，碰撞氣9 psi，離子化電壓5 500 V，溫度550 ℃，噴霧氣50 psi，輔助加熱器50 psi；采集參數(shù)見表1。

表1 氯霉素類藥物信息及質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化條件表

1.2.6 標準工作曲線的配制

分別稱取適量氯霉素類藥物標準品于各自的容量瓶中，用乙腈配制成1 mg·L-1的標準儲備液。準確移取適量各標準儲備液于容量瓶中，用30%乙腈水溶液稀釋成1 000 μg·L-1的混合標準中間液。準確移取適量混合標準中間液用相應(yīng)的空樣品基質(zhì)提取液稀釋成濃度為0.5～100.0 μg·L-1的系列混合標準工作溶液，氯霉素-D5內(nèi)標濃度為20 μg·L-1。

1.3 結(jié)果處理

實驗結(jié)果采用MultiQuant軟件進行繪圖和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的選擇

氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素為弱極性物質(zhì)，在C18色譜柱上有較強的保留，色譜條件相對容易選擇；而氟苯尼考胺為堿性化合物，極性較強在C18柱上保留較弱。本方法比較了水-乙腈、0.1%氨水-乙腈和5 mmol·L-1乙酸銨溶液-乙腈作為流動相時各化合物的分離情況。選擇水-乙腈作流動相時，氟苯尼考胺的出峰時間較早，易受雜質(zhì)干擾，從而影響定量結(jié)果。而5 mmol·L-1乙酸銨溶液-乙腈作流動相時，氟苯尼考胺有拖尾現(xiàn)象，峰型不對稱。選擇0.1%氨水-乙腈作流動相時，調(diào)整流動相的pH值，氟苯尼考胺的保留時間為3.48 min，分離度和峰形效果較好。通過對比不同的流動相、色譜柱、初始比例以及流速，最終發(fā)現(xiàn)Waters BEH C18（100 mm×2.1 m，1.7 m）對氟苯尼考胺有一定的保留。為更好地分離待測物和樣品中的雜質(zhì)，本方法最終選用乙腈的初始比例為5%，0.1%氨水溶液和乙腈進行梯度分析，樣品總的運行時間為7 min，讓雜質(zhì)能夠完全流出，避免下一針樣品產(chǎn)生柱上污染，降低了氟苯尼考胺的基質(zhì)效應(yīng)，本方法在相對較短時間內(nèi)能較好地分離4種物質(zhì)，滿足對目標物的定性和定量要求。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

UHPLC-MS/MS采用的是電噴霧離子化（ESI）使化合物帶電，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考為酸性化合物，采用負模式電噴霧離子源；氟苯尼考胺含有氨基官能團，選擇用正模式電噴霧離子源，進行離子掃描。表1中為確認的質(zhì)譜采集參數(shù)；圖1為氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺和氯霉素-D5的標準品多反應(yīng)監(jiān)測模式離子描譜圖。

圖1 氯霉素藥物標準溶液總離子流圖

2.3 線性關(guān)系、檢出限和定量限

分別用3種空白基質(zhì)提取液配制標準工作曲線，以各待測物與氯霉素-D5的濃度比X為橫坐標，以各待測物與氯霉素-D5峰面積比Y為縱坐標，進行回歸分析，得到各待測物的回歸曲線方程及相關(guān)系數(shù) （表2）。由表2看出，4種化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，可用于準確定量。結(jié)合本方法的前處理過程，以3倍信噪比時的響應(yīng)值計算檢出限，本方法氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢出限均為 0.1 μg·kg-1，氟苯尼考胺的檢出限為0.5 μg·kg-1；以 10倍信噪比時的響應(yīng)值計算本方法的定量限，4種待測物的定量限均為1.0 μg·kg-1。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）的產(chǎn)生是由于待測物與基質(zhì)成分中的磷脂、膽固醇等內(nèi)源性物質(zhì)一同流出色譜柱，從而產(chǎn)生競爭抑制引起的[18]。在HPLC-MS/MS測定復雜樣品時，由于內(nèi)源性的物質(zhì)極性較大，會同待測物離子競相競爭液滴表面，導致待測物的離子化效率降低或增強，引起響應(yīng)的降低或增高，影響定量的精密度和準確度。分別用3種空白基質(zhì)提取液配制的標準工作曲線與用30%乙腈水溶液配制的標準工作曲線進行對比，以兩條曲線的斜率比值作為考察基質(zhì)效應(yīng)強弱的指標，公式為ME=（基質(zhì)匹配標準工作曲線的斜率/無基質(zhì)標準工作曲線的斜率-1）×100%。|ME|＜20%，為弱基質(zhì)效應(yīng)；|ME|為20%～50%，為中等基質(zhì)效應(yīng)，而|ME|＞50%，為強基質(zhì)效應(yīng)。氯霉素類藥物的基質(zhì)效應(yīng)見表2。從實驗結(jié)果可以看出，豬肉、雞肉和魚肉中氟苯尼考胺的|ME|在20%～50%，為中等基質(zhì)抑制效應(yīng)，而氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的|ME|均小于20%，為弱基質(zhì)效應(yīng)。

表2 氯霉素類藥物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限與基質(zhì)效應(yīng)表

2.5 回收率及精密度實驗

分別在豬肉、雞肉和魚肉3種不同基質(zhì)的陰性樣品中添加低、中、高3個濃度水平的氯霉素類藥物，每個加標水平平行測定6次，計算其回收率和相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。表3的分析結(jié)果表明，本方法精密度高（RSD＜10%），準確度好，回收率在81%～112%。

表3 氯霉素類藥物添加水平、回收率及RSD表（n=6）

3 結(jié)論

本方法采用堿化乙酸乙酯提取，正己烷去除油脂，通過MCX固相萃取柱凈化，減少基質(zhì)干擾；采用空白基質(zhì)提取液配制標準工作曲線以及同位素內(nèi)標法定量來降低基質(zhì)效應(yīng)，以滿足測定靈敏度和專屬性的要求；通過質(zhì)譜電噴霧正負離子切換多反應(yīng)監(jiān)測模式實現(xiàn)了一針進樣4種氯霉素類藥物的同時測定。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考在0.5～100.0 μg·L-1具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，檢出限均為 0.1 μg·kg-1，方法回收率為83%～112%，相對標準偏差小于10%；氟苯尼考胺在1～100 μg·L-1濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999，檢出限為0.5 μg·kg-1，方法回收率為81%～110%，相對標準偏差小于10%。本方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、定量準確，方法檢出限能夠滿足食品安全風險監(jiān)測的要求，適用于日常大批量豬肉、雞肉和魚肉樣品中氯霉素類藥物及其代謝物殘留的定性、定量分析。