◎ 楊 勇，趙陽娟，劉 希，童 星

（1.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528000；2.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；3.佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528511）

醬油是一種美味的傳統(tǒng)調(diào)味品，兩千多年前古代中國(guó)人民就掌握了醬油的生產(chǎn)釀造方法，從此以后它與人們的生活息息相關(guān)。醬油發(fā)酵是一個(gè)多種類微生物（包括霉菌、酵母、細(xì)菌等）共同對(duì)大豆和小麥等原料進(jìn)行天然發(fā)酵的過程。經(jīng)過微生物及其所產(chǎn)酶系的長(zhǎng)期、共同作用，使得醬油具有獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。

微生物群落組成對(duì)于醬油的發(fā)酵過程和風(fēng)味物質(zhì)合成具有重要影響，傳統(tǒng)醬油發(fā)酵過程中微生物的多樣性賦予其獨(dú)特的酯香味和醬香味，然而醬油中食鹽、酒精等物質(zhì)含量較高，嚴(yán)重威脅微生物生長(zhǎng)，本文總結(jié)了近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)醬油抗逆微生物的分離鑒定成果，希望為醬油的創(chuàng)新研究工作提供思路，為擴(kuò)充醬油釀造微生物種質(zhì)資源庫和改善醬油風(fēng)味提供幫助。

1 醬醪中的主要微生物

從醬油生產(chǎn)中分離得到的微生物種類繁多，主要有霉菌、酵母菌以及細(xì)菌（主要是乳酸菌）3大類。醬油制曲階段主要是霉菌（最主要是米曲霉Aspergillus oryzae）起作用，它在醬油釀造中起到重要作用。酵母菌在醬油發(fā)酵過程中主要起增香作用，由此增加了醬油風(fēng)味。乳酸菌能產(chǎn)生大量的有機(jī)酸。有機(jī)酸的大量存在不僅對(duì)有害微生物的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，同時(shí)為魯氏接合酵母的生長(zhǎng)繁殖提供條件，而且這些有機(jī)酸既是醬油的風(fēng)味成分，又是其他酯香類物質(zhì)的前體，極大地豐富了醬油風(fēng)味[2]。

近年來，有國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過宏基因組學(xué)等分子生態(tài)學(xué)的方法研究了醬醪中微生物的結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)還有大量其他未被報(bào)道的微生物，尤其是大量的細(xì)菌參與醬油發(fā)酵。研究結(jié)果顯示，這些細(xì)菌的種群總量多、豐度大，但是它們?cè)卺u油生產(chǎn)中具有的特性和功能尚不十分清楚[3]。

我國(guó)目前的醬油生產(chǎn)商品化菌種資源相對(duì)匱乏，無法解決隨著生活水平的提高，人們對(duì)醬油產(chǎn)品個(gè)性化的需求和健康、天然的品質(zhì)要求也在逐漸增加這一矛盾[4]。而對(duì)于研究者而言，就應(yīng)該不斷去發(fā)現(xiàn)醬油生產(chǎn)過程中的微生物以及探究它們?cè)诎l(fā)酵過程中的功能角色。

2 依賴于傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法分離醬油抗逆微生物

綜合前期的研究發(fā)現(xiàn)，早期醬油抗逆微生物的分離鑒定研究重點(diǎn)在于霉菌和酵母，而對(duì)生產(chǎn)過程中存在的耐鹽細(xì)菌研究相對(duì)較少[5]。近年來，隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)醬油生產(chǎn)中微生物群落結(jié)構(gòu)研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)其中的微生物不僅生物量大而且種類豐富，然而它們?cè)卺u油高鹽逆境中具有的功能有待進(jìn)一步研究。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者不斷報(bào)道分離自醬油抗逆微生物以及它們的生物學(xué)功能，這對(duì)醬油生產(chǎn)微生物菌種庫的擴(kuò)充、對(duì)其他進(jìn)行類似研究的學(xué)者們是一種鼓勵(lì)。

2.1 抗逆細(xì)菌

表1對(duì)近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者從醬醪中分離鑒定的微生物進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。

表1 醬油發(fā)酵過程中分離鑒定的耐鹽微生物表

從表1各文獻(xiàn)中可以看出，不同產(chǎn)地、不同生產(chǎn)方法、不同發(fā)酵時(shí)間、甚至是不同批次的醬醪中分離得到的抗逆細(xì)菌是不盡相同的。各地學(xué)者分離鑒定到的抗逆細(xì)菌有Weissella（W. paramesenteroides）、Pediococcus（P. halophilus、P. acidilactici、P. pentosaceus）、Staphylococcus（Staph. kloosii、Staph. gallinarum、Staph.condimenti、Staph. cohnii、Staph. vitulus、Staphy. saprophyticus、Staph. epidermidis、Staph. xylosus）、Tetragenococcus（T. halophilus）、Enterococcus（E. faecium）、Bacillus（B. amyloliquefaciens、B.licheniformis、B. pumilus、B. subtilis、B. sonorensis、B. cereus、B. methylotrophicus）、Micrococcus、Aerococcus、Lactobacillus（L. fermentum、L. acidipiscis、L. farciminis、L. pentosus、L. plantarum）、Delftia（D.tsuruhatensis）和coryneform bacteria等。其中大多數(shù)分離到的抗逆微生物均未能考察其在醬油生產(chǎn)中的功能。YANG[7]、謝小保等[9]分別對(duì)中國(guó)醬油、WEI等[19]對(duì)中國(guó)醬油、TANASUPAWAT等[15]對(duì)泰國(guó)醬油中的耐鹽細(xì)菌做了系統(tǒng)性的分離鑒定工作。另外國(guó)內(nèi)的研究機(jī)構(gòu)江南大學(xué)近些年也不斷有相應(yīng)的研究成果 報(bào)道。

在醬油中被廣泛報(bào)道的細(xì)菌有乳酸菌、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬等。乳酸菌包括魏斯氏菌屬（Weissella）等[21]，它是一類能利用各類糖類化合物作為產(chǎn)物生成底物乳酸的細(xì)菌的總稱，醬油發(fā)酵中的乳酸菌通常還具有耐受高鹽（至少8%，見表1）這一普通乳酸菌不具備的性質(zhì)，通過在發(fā)酵環(huán)境中產(chǎn)生有機(jī)酸及分泌肽類物質(zhì)，如抑菌肽，將醬醪體系轉(zhuǎn)變?yōu)槠岬沫h(huán)境，能在一定程度上抑制雜菌的生長(zhǎng)，有利于一些酵母的生長(zhǎng)及代謝。

趙國(guó)忠等[13]將從老廠醬醪中分離到的一株耐鹽植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）添加到醬油發(fā)酵中，氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果顯示添加了這株植物乳桿菌后，發(fā)酵醬油中酮類、酚類和醇類等物質(zhì)增加顯著。另外，該醬油總酸、氨基態(tài)氮、可溶性無鹽固形物這3項(xiàng)指標(biāo)都有顯著提高，其中包括乳酸含量，而其他有機(jī)酸含量略有下降。同時(shí)結(jié)果表明該植物乳桿菌可促進(jìn)生成更多的單糖、氨基酸、乳酸等小分子化合物，從而增強(qiáng)醬油的風(fēng)味。此研究為今后醬油的品質(zhì)改良打下良好的理論基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中魏斯氏菌廣泛存在，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。胡傳旺[6]通過對(duì)高鹽稀態(tài)醬油中耐鹽細(xì)菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌在高鹽（18%）培養(yǎng)條件下均能水解原料，產(chǎn)生較多的鮮味氨基酸。李巧玉等[12]發(fā)現(xiàn)，12株從醬油中得到的魏斯氏菌在高鹽培養(yǎng)條件下，有1株可降解利用多種生物胺，有3株菌反而會(huì)產(chǎn)生生物胺，不過大多數(shù)菌株不產(chǎn)生物胺。另外結(jié)果顯示這12株魏斯氏菌在高鹽體系中均能生成多種有機(jī)酸和多種胞外多糖等功能性物質(zhì)，從而改善醬油的口感和營(yíng)養(yǎng)。

楊怡敏[22]發(fā)現(xiàn)乳酸足球菌（Pediococcus acidilactici） BBE 1120能夠積累瓜氨酸，而且正是因?yàn)楦啕}環(huán)境、碳源種類及濃度等因素引起該微生物積累瓜氨酸，其中高鹽是最主要因素。通過比較不同來源的乳酸足球菌菌株，發(fā)現(xiàn)這些乳酸足球菌在18%鹽濃度條件下，利用底物精氨酸生成產(chǎn)物瓜氨酸的轉(zhuǎn)化率是有差異的，對(duì)高鹽耐受性強(qiáng)的菌株的轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低。作者分別對(duì)不同菌株產(chǎn)生物胺的能力進(jìn)行了定性和定量分析，結(jié)果表明該菌不產(chǎn)測(cè)定的8種生物胺。此外通過分析發(fā)現(xiàn)，乳酸足球菌能夠在高鹽環(huán)境下降解8種生物胺。

胡傳旺[6]發(fā)現(xiàn)嗜鹽四聯(lián)球菌（T. halophilus）不僅會(huì)產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，而且還會(huì)產(chǎn)生較多的揮發(fā)性物質(zhì)。楊希飛[23]發(fā)現(xiàn)嗜鹽四聯(lián)球菌可代謝瓜氨酸（它是由精氨酸脫亞氨酶途徑產(chǎn)生）和氨基甲酸乙酯。接入嗜鹽四聯(lián)球菌對(duì)于醬油風(fēng)味的提升有意義，而且醬油中的各類風(fēng)味物質(zhì)（酸、醛、酮、酯、酚和吡嗪類等物質(zhì)）的含量也分別比對(duì)照提高不少。

另外葡萄球菌作為風(fēng)味細(xì)菌在發(fā)酵肉制品中應(yīng)用較多，其本身具有很強(qiáng)的耐高鹽能力，容易馴化。胡傳旺等[24]從醬油中分離得到一株葡萄球菌JY09，其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)較多。

芽孢桿菌的蛋白酶及淀粉酶一般酶活較高，有利于醬油中蛋白質(zhì)及淀粉的分解。PALANIYANDI等[25]從韓國(guó)醬油（Ganjang）中分離到了一株索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis），發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)胞外多糖的能力突出，可抑制一些病原微生物的生長(zhǎng)，可以作為益生菌，但該研究未對(duì)其在醬油發(fā)酵中的功能進(jìn)行考察。JIANG等[8]從天然曬露法釀制醬油中分離鑒定了一株耐鹽枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），發(fā)現(xiàn)其在醬油發(fā)酵過程中具有改善醬油香氣的作用，香氣成分中的酚、酮、酯均有不同程度的增加。

醬油風(fēng)味細(xì)菌的研究起步較晚，在生產(chǎn)中的應(yīng)用程度較淺。此外，尚有許多風(fēng)味細(xì)菌未被應(yīng)用或發(fā)現(xiàn)，這需要此領(lǐng)域內(nèi)的學(xué)者們進(jìn)行更加深入的研究。

2.2 抗逆酵母

Candida（C. parapsilosis、C. etchellsii、C. guilliermondii var. membranaefaciens、C. famata、C. pulcherrima、C. lusitaniae、C. orthopsilosis）、Debaromyces（D. hansenii var. fabryi）、Sterigmatomyces、Meyerozyma（M. guilliermondii）、Torulopsis、Saccharomyces、Trichosporon、Cryptococcus（C. albidus）、Microbotryum（M. violaceum）、Pichia（P. guilliermondii、P.sorbitophila）、Rhodotorula（R. mucilaginosa、R. glutinis）、Tetrapisispora（T. blattae）、Torulaspora（T.delbrueckii）、Wickerhamomyces（Wickerhamomyces. anomalus）等酵母得到了分離鑒定。其中，馮杰[14]將分離到的C. etchellsii添加到醬油的發(fā)酵生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)它對(duì)于醬油的質(zhì)量和風(fēng)味具有顯著的促進(jìn)作用。結(jié)果表明，氨基態(tài)氮和可溶性無鹽固形物含量分別達(dá)到（9.15±0.12）g·L-1和（269.60±3.15）g·L-1，相較于對(duì)照分別增加了23.1%和17.6%。樣品中最高的游離氨基酸含量和39種揮發(fā)性風(fēng)味化合物總量分別達(dá)到（58.21±1.77）g·L-1和（17.81±0.45）g·L-1，相較于對(duì)照分別提高了1.76%和178.7%。醬油中的典型風(fēng)味物質(zhì)，如4-乙基愈創(chuàng)木酚和HEMF等物質(zhì)均有所增加，更好地促進(jìn)了醬油風(fēng)味質(zhì)量的改善和提高。

YANG等[7]和ARYUMAN等[16]兩個(gè)不同的團(tuán)隊(duì)各自從醬油中分離到了季也蒙念珠菌（Meyerozyma guilliermondii）這類耐鹽酵母。YANG等還從醬油中檢測(cè)出10種特征香氣成分，包含醛、酮、醇、酸和酯等不同的化合物，這10種化合物中主要的、能夠?yàn)獒u油的特征風(fēng)味帶來積極影響的揮發(fā)性物質(zhì)分別為2-苯基乙醇和3-甲基-1-丁醇。而ARYUMAN等分離到的季也蒙念珠菌還能產(chǎn)生谷氨酰胺酶，而且酶活隨著鹽濃度的增大而增大，在18%高鹽濃度下達(dá)到最大，可見高鹽環(huán)境下該酵母可以使底物L(fēng)-谷氨酰胺生成產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸的水解反應(yīng)加速，對(duì)醬油產(chǎn)品鮮味的提升具有重要作用。因此兩個(gè)團(tuán)隊(duì)均認(rèn)為該類酵母具有進(jìn)一步添加到醬油生產(chǎn)中去提升醬油品質(zhì)的 價(jià)值。

3 結(jié)語

長(zhǎng)期以來人們對(duì)傳統(tǒng)食品發(fā)酵行業(yè)的基礎(chǔ)研究不夠重視，對(duì)醬油生產(chǎn)中的抗逆微生物分離、鑒定、選育方面的研究相對(duì)滯后，尤其是對(duì)其中的細(xì)菌的研究相對(duì)較少，這不利于研究醬油發(fā)酵體系中的微生物群落組成以及各自的角色功能。但隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)高品質(zhì)醬油的需求也越來越大。這也為醬油釀造行業(yè)帶來了新的發(fā)展契機(jī)。

消費(fèi)者對(duì)醬油品質(zhì)的追求促進(jìn)了高品質(zhì)醬油釀造工藝的發(fā)展，醬油抗逆微生物的研究及其應(yīng)用成為推動(dòng)工藝發(fā)展的重要途徑，也將成為研究的熱點(diǎn)之一。各種耐鹽細(xì)菌與主發(fā)酵菌種在長(zhǎng)期發(fā)酵中相互作用，代謝產(chǎn)生的各種物質(zhì)相互反應(yīng)，構(gòu)成了醬油復(fù)雜的風(fēng)味物質(zhì)體系，從而形成了醬油特有的風(fēng)味。隨著高通量測(cè)序、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用，深入研究醬油抗逆微生物、擴(kuò)大其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)、發(fā)掘其在釀造中的應(yīng)用潛力、實(shí)現(xiàn)多菌種混合發(fā)酵及優(yōu)化醬油風(fēng)味，將為生產(chǎn)安全健康、鮮咸適口、醬香醇厚的優(yōu)質(zhì)醬油提供有力保障。