閆涵 于昕喆 張春騰 李軍 鄭大勇

1華北理工大學藥學院 河北唐山 063210；2遼寧中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院

惡性腫瘤已成為嚴重威脅我國居民健康的主要公共衛(wèi)生問題，根據(jù)最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示惡性腫瘤死亡占居民全部死因的23.91%[1]。近年來，隨著我國人口老齡化日益加劇，吸煙、飲酒等不健康生活方式、食品安全、空氣污染等危險因素的累加，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率均呈持續(xù)上升趨勢。肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌及上消化系統(tǒng)腫瘤、女性乳腺癌是我國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤[1]，而腫瘤難以控制的主要原因表現(xiàn)在頻繁出現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移。

Twist1是一種高度保守的含堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(basic helix-loop-helix, bHLH)的轉(zhuǎn)錄因子，最初在果蠅胚胎中發(fā)現(xiàn)，Twist1基因突變的果蠅胚胎因無中胚層而無法正常成熟，并在胚胎生長結(jié)束時以“扭曲(Twist)”的外觀死亡，因而得名[2-3]。Twist1在胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用，Twist1的功能喪失可導致遺傳性的Saethre-Chotzen綜合征，表現(xiàn)為身材矮小、顱縫早閉等[3]。近年來，針對Twist1與腫瘤生物學行為進行了大量研究，特別是發(fā)現(xiàn)Twist1在腫瘤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用[4]。

1 Twist1的生物學功能及其介導信號通路

人Twist1基因定位在染色體7q21.2上，包含兩個外顯子和一個內(nèi)含子[3]，外顯子1含有一個編碼202個氨基酸的開放閱讀框，而外顯子2不編碼蛋白。Twist1是進化上高度保守的bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子，相對分子量約為21 kDa。在bHLH結(jié)構(gòu)域上包含一段堿性氨基酸，后面與兩個兩親性α-螺旋相鄰，這兩個α-螺旋由一個螺旋環(huán)隔開[3]。bHLH蛋白需作為二聚體識別并結(jié)合六個核苷酸序列CANNTG，即Ndel1 E-box順式調(diào)控元件，進而在細胞核中起到轉(zhuǎn)錄因子作用。此外，Twist1蛋白的堿性氨基酸區(qū)域Q109-T121是結(jié)合DNA的主要區(qū)域，有兩個核定位信號序列(nuclear localization signal sequences 1 and 2, NLS)，分別為37RKRR40和73KRGKK77。

Twist1作為轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)節(jié)其靶基因，還通過與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子相互作用調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子或共調(diào)節(jié)因子介導相關(guān)基因表達，比如參與調(diào)控FGF(fibroblast growth factor)和SHH(sonic hedgehog homolog)信號通路[5]。此外，Twsit1與細胞自噬相關(guān)標志物SQSTM1/p62結(jié)合，抑制Twist1降解[6]；TNFα激活NF-κB可上調(diào)Twist1的表達，抑制細胞凋亡；轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn)蛋白激酶D1(protein kinase D1, Prkd1)是Twist1的直接轉(zhuǎn)錄靶點，而Prkd1被Twist1激活后將調(diào)節(jié)多種細胞進程，包括細胞增殖和細胞轉(zhuǎn)移[7]。另外，Twist家族的另一個成員Twist2包含160個氨基酸，與Twist1具有68%的同源性。

2 Twist1與腫瘤

Twist1過表達參與了包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌等多種類型腫瘤的惡性進展[4]。Twist1可調(diào)控致癌基因誘導的細胞增殖和抑制細胞凋亡，增加腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性，以及提升腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)群體數(shù)量，并促進癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[8-9]。最新的研究更明確了Twist1在促進腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和轉(zhuǎn)移中的作用[8]。Twist1在轉(zhuǎn)移的各個步驟均起到關(guān)鍵作用，比如：EMT、局部侵襲、血管浸潤、循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運、溢出、繼發(fā)器官部位存活與增殖，以及形成顯著的轉(zhuǎn)移性病變。Twist1作為EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，可增強原發(fā)性腫瘤細胞的EMT發(fā)生。然而，在促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，Twist1對不同類型腫瘤的表達、功能和分子機制有所不同。

2.1Twist1與乳腺癌 乳腺癌(breast cancer, BC)是一種高度異質(zhì)性疾病，根據(jù)分子譜分析將BC分為五種亞型：管腔A型(Luminal A)、管腔B型(Luminal B)、HER2(human epidermal growth factor receptor 2)陽性、基底樣型和三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)。Twist1是在高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移臨床分期的乳腺癌中過表達，與乳腺癌EMT呈正相關(guān)。特別是Twist1在TNBC患者中顯著高表達，與腫瘤體積、淋巴結(jié)受累及較差的無遠處轉(zhuǎn)移生存率密切相關(guān)。同時，Twist1與p53突變、E-cadherin及Ki67呈正相關(guān)。相反，野生型p53可促進Twist1蛋白降解并抑制EMT，維持上皮表型[10]。

Twist1過表達與預后不良的基底樣乳腺癌相關(guān)，在雌激素受體陽性的管腔型乳腺癌細胞中，Twist1可下調(diào)FOXA1(forkhead box protein A1)表達，并減少了FOXA1抑制的細胞轉(zhuǎn)移[11]。使用流式細胞熒光分選技術(shù)對基底型乳腺癌MCF10AT1細胞進行乳腺癌CSC的分類研究，發(fā)現(xiàn)Twist1是激活乳腺癌CSC的上游調(diào)節(jié)因子[12]。同時，STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)的活化可增加Twist1的表達，研究發(fā)現(xiàn)STAT3直接結(jié)合Twist1啟動子上的第二個近端STAT3結(jié)合位點，并激活Twist1轉(zhuǎn)錄[13]；致癌蛋白MUC1-C(mucin 1 C-terminal subunit)可激活STAT3，MUC1-C和pSTAT3共同驅(qū)動Twist1轉(zhuǎn)錄[14]。MUC1-C/Twist1信號通路使其他EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如ZEB1和Snail的蛋白表達增加，促進細胞轉(zhuǎn)移。同時，MUC1-C/Twist1通路也增加CSC相關(guān)標志物如ALDH1和CD44的表達，促進自我更新和致瘤性。

2.2Twist1與肝細胞癌 肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一種快速生長的轉(zhuǎn)移性腫瘤。對原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性HCC的組織微陣列和免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，Twist1過表達與肝癌轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[15]。Cullin2蛋白是一種E3泛素化蛋白酶復合物的核心組成，是腫瘤抑制蛋白。在HCC細胞中，Twist1結(jié)合Cullin2啟動子激活其轉(zhuǎn)錄，選擇性上調(diào)Cullin2環(huán)狀RNA(circ-10720)的表達，并抑制Cullin2蛋白表達和上調(diào)波形蛋白(Vimentin)表達[16]。

血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)也是常見的轉(zhuǎn)移和預后不良因素。HCC組織中Twist1和VM的水平明顯高于正常肝組織。Twist1在HCC中上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和N-鈣黏蛋白(N-cadherin)表達，提示Twist1在HCC的VM形成中起重要作用。此外，MYBL1(MYB proto-oncogene-like 1)是一種新發(fā)現(xiàn)的致癌基因，MYBL1蛋白是強轉(zhuǎn)錄激活因子，在癌癥的發(fā)展中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MYBL1通過直接靶向Twist1啟動子轉(zhuǎn)錄而上調(diào)Twist1的表達[17]；長鏈非編碼RNA-重排調(diào)節(jié)因子(Long intergenic non-protein coding RNA-regulator of reprogramming, Linc-ROR)可促進HCC進展[18]。linc-ROR敲低可下調(diào)Twist1的表達，并顯著抑制EMT，使HCC細胞對多西他賽的敏感性增加。

2.3Twist1與前列腺癌 前列腺癌的死因主要是出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，而雄激素非依賴型轉(zhuǎn)移性前列腺癌對治療構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)。在胚胎發(fā)育過程中，Twist1在小鼠前列腺中表達，然后在出生后沉默。Malek等[19]發(fā)現(xiàn)Twist1表達在小鼠和人原發(fā)性前列腺癌中重新激活，并在轉(zhuǎn)移灶中富集，與生存密切相關(guān)。而雄激素非依賴性前列腺癌細胞中Twist1的下調(diào)增加了其對去勢抵抗治療的敏感性，并抑制其遷移和侵襲能力；以上研究提示Twist1重新激活控制上述前列腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移[20]；蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)激活后可誘導Twist1和雄激素受體(androgen receptor, AR)表達，在去勢治療抵抗中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。敲低和通過小分子抑制劑來抑制PKC信號轉(zhuǎn)導，阻斷NF-κB活性，并抑制Twist1和AR表達。

單胺氧化酶A(monoamine oxidase A, MAOA)通過將Twist1直接結(jié)合到白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)啟動子處的保守E-box元件上，增強IL-6轉(zhuǎn)錄，引發(fā)炎癥反應，并促進腫瘤發(fā)生[22]?；|(zhì)成纖維細胞中的MAOA通過旁分泌IL-6/STAT3信號轉(zhuǎn)導為前列腺癌細胞生長提供優(yōu)良的腫瘤微環(huán)境。

2.4Twist1與肺癌 肺癌近十年來發(fā)病率和死亡率增長較快，并且仍然難以治療。母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶(maternal embryonic leucine zipper kinase, MELK)是一種新的致癌基因，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員。MELK在肺癌中高表達，與肺腺癌的生存率呈負相關(guān)。敲低MELK可下調(diào)Twist1的表達，并抑制了肺腺癌細胞轉(zhuǎn)移[23]；c-ros癌基因1(ROS1)是一種非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的癌基因。攜帶ROS1基因突變的A549細胞可誘導EMT發(fā)生，上調(diào)了Twist1的表達，顯著增強A549細胞的運動和侵襲能力[24]。同時，Twist1還介導了NSCLC細胞的EGFR(epidermal growth factor receptor)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors, TKI)耐藥，主要作用機制是由于Twist1直接結(jié)合促凋亡BH3基因BCL2L11(BIM)內(nèi)含子區(qū)域和啟動子，抑制BIM的轉(zhuǎn)錄[25]。

肺肉瘤樣癌(pulmonary sarcomatoid carcinoma, PSC)是非小細胞肺癌的一種罕見亞型，目前尚無有效的治療方法。在PSC組織中發(fā)現(xiàn)，PSC表現(xiàn)出EMT和VM表型，以及Twist1表達增加[26]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β, TGFβ1)在PSC細胞中誘導EMT和VM形成，并上調(diào)Twist1的表達。然而，在Twist1敲低后，在TGFβ1處理的細胞中，EMT發(fā)生逆轉(zhuǎn)，VM標志物表達降低，PSC細胞的運動與侵襲能力下降。

2.5Twist1與胃癌 免疫組織化學和RT-PCR分析顯示胃癌(gastric carcinoma, GC)組織中Twist1表達水平較高[27]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Twist1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的胃癌細胞具有較強的運動和侵襲能力，并在接種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的裸鼠的腹腔和肝臟中可形成更多數(shù)量的腫瘤結(jié)節(jié)。此外，利用基因集富集分析發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)雌激素受體1(G protein coupled estrogen receptor 1, GPER1)的表達伴隨著EMT發(fā)生，并與GC中PI3K/AKT通路的激活呈正相關(guān)[28]。GPER1的敲低抑制了Twist1的表達，并下調(diào)了間質(zhì)標志物N-cadherin和Vimentin，上調(diào)了上皮標志物E-cadherin。另外，Twist1和p53水平呈負相關(guān)，進一步提示Twist1為GC細胞增殖和遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

2.6Twist1與結(jié)直腸癌 結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是世界上第三大常見的人類癌癥。在CRC患者中，較高的Twist1表達水平與遠處轉(zhuǎn)移之間存在統(tǒng)計學上的顯著相關(guān)性，有較差的預后[29]。Twist1過表達增強了有絲分裂畸變，并誘導結(jié)腸直腸癌細胞染色體不穩(wěn)定性(chromosome instability, CIN)[30]。同時，Twist1過表達增強了CIN和DNA損傷，從而提升了侵襲性癌細胞亞群數(shù)，并促進了癌細胞轉(zhuǎn)移。

2.7Twist1與胰腺癌 胰腺癌中有超過85%的是胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)，PDAC的侵襲性極強，只有不到7%的PDAC患者有5年生存率。腫瘤代謝重編程對于PDAC發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。大多數(shù)癌細胞依賴有氧糖酵解以支持細胞增殖和抵抗細胞凋亡，這種現(xiàn)象稱為“Warburg效應”。最新的研究發(fā)現(xiàn)Twist1是PDAC有氧糖酵解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Twist1的基因沉默可顯著抑制PDAC細胞的糖酵解表型，如葡萄糖攝取減少、乳酸產(chǎn)生和細胞外酸化率降低[31]。Twist1可直接促進一些糖酵解相關(guān)基因的表達，如SLC2A1、HK2、ENO1和PKM2。

TG相互作用因子1(TG-interacting factor 1, TGIF1)高表達降低了內(nèi)源性Twist1蛋白和mRNA的表達水平。TGIF1也阻斷了Twist1誘導的自轉(zhuǎn)錄表達。在體外和體內(nèi)實驗均檢測到內(nèi)源性TGIF1與Twist1啟動子的強結(jié)合，提示了TGIF1很可能作為Twist1基因的直接轉(zhuǎn)錄抑制因子，在PDAC中起腫瘤抑制作用[32]。

2.8Twist1與其他腫瘤 頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)發(fā)生在包括口腔、喉部和咽部的惡性鱗狀細胞病變，是世界上第六大常見癌癥。多數(shù)HNSCC患者在局部晚期或轉(zhuǎn)移階段確診，且5年生存率很低。在HNSCC組織中檢測到蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(protein arginine methyltransferase 5, PRMT5)的表達，而PRMT5敲低在體外和體內(nèi)實驗中均抑制了HNSCC細胞的惡性表型。PRMT5可靶向Twist1啟動子區(qū)域，隨后激活Twist1的轉(zhuǎn)錄，促進了HNSCC的惡性進展[33]。在侵襲性口腔鱗狀細胞癌中， Twist1和集落刺激因子(colony stimulating factor 1, CSF1)在轉(zhuǎn)移組織中的表達增高[34]。Twist1過表達可誘導CSF1的激活，而Twist1基因沉默則下調(diào)CSF1，降低細胞侵襲能力。

在高表達Twist1的食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)細胞中，細胞運動與遷移能力增強，同時上調(diào)了基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的表達[35]。此外，通過RNA-seq和Western blot法分析骨肉瘤組織發(fā)現(xiàn)前膠原C-蛋白酶增強蛋白(procollagen C-proteinase enhancer protein, PCOLCE)高表達，并與患者預后不良相關(guān)。Twist1也在骨肉瘤組織中過度表達，并且與PCOLCE呈正相關(guān)[36]。Twist1上調(diào)PCOLCE的表達，在促進骨肉瘤的轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。

腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是致命泌尿系統(tǒng)腫瘤。對RCC組織進行qPCR和免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)，前膠原-賴氨酸，2-酮戊二酸5-雙加氧酶(procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase, PLOD3)在RCC組織和RCC細胞中高表達，而PLOD3可調(diào)控Twist1的表達水平[37]。PLOD3敲低可降低Twist1表達，同時下調(diào)Twist1介導的β-catenin和AKT信號轉(zhuǎn)導，進而抑制RCC惡性進展。此外，在人宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)醛酮還原酶1家族成員C1(aldo-keto reductase 1 family member C1, AKR1C1)高表達，并與宮頸癌患者的臨床特征相關(guān)[38]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，AKR1C1可增加Twist1的表達和激活AKT通路，以調(diào)控宮頸癌細胞的增殖和侵襲。

綜上所述，Twist1與大多數(shù)類型腫瘤的惡性進展密切相關(guān)，參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移、VM與血管生成、腫瘤干細胞形成及耐藥，而靶向抑制Twist1可能是有效的惡性腫瘤治療策略。

3 靶向治療

靶向Twist1可以顯著抑制腫瘤生長、限制腫瘤轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)耐藥性，從而提高癌癥患者的生存率。然而，目前針對Twist1的靶向治療研究報道較少。Yochum等[39]使用Connectivity Map數(shù)據(jù)庫并利用化學生物信息學方法篩選了Twist1抑制劑，發(fā)現(xiàn)去氫駱駝蓬堿(Harmine)可抑制多重Twist1功能。Harmine從藥用植物駱駝蓬的種子中提取分離而得，被視為首創(chuàng)新藥(First-in-class)的Twist1抑制劑。Twist1及其二聚體E2A蛋白是Twist1介導的下游靶向信號通路所必需的，并且在翻譯后調(diào)節(jié)其他異源二聚體的穩(wěn)定性[39]。Harmine可優(yōu)先促進Twist1-E2A異源二聚體的降解。此外，使用NSCLC(包括EGFR、KRAS和MET突變)患者來源的癌細胞構(gòu)建異種移植小鼠模型，Harmine表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。同時，Harmine也可克服Twist1而介導EGFR TKI耐藥性。

4 結(jié)論

Twist1通過促進EMT增強癌癥侵襲與轉(zhuǎn)移，抵抗化療誘導的細胞凋亡，促進癌癥進展和耐藥。但是Twist1調(diào)控各種類型癌癥的發(fā)生和發(fā)展在分子機制上仍有差異，需進一步研究以確定Twist1參與不同腫瘤類型的作用機制，本文總結(jié)了近年來對Twist1參與多種類型腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的生物學功能的最新研究進展。隨著對Twist1研究的深入，有關(guān)Twist1的生物學作用及其在腫瘤進展中的轉(zhuǎn)導途徑將逐步確立，會更好的評估Twist1在腫瘤惡性進展中的作用及對不同類型腫瘤提供預后預測和靶向治療?？傊?，Twist1可作為腫瘤的生物標志物，用來評估腫瘤的惡性進展情況。同時，Twist1也作為頗有前景的腫瘤治療靶點，通過尋找適當?shù)男》肿右种苿┗蛘咄ㄟ^基因靶向治療等方式來抑制Twist1的表達，進而控制腫瘤發(fā)展。