徐婧玥

天津市第五中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 天津 300450

自2019年12月，由新型冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)迅速在全球暴發(fā)，是迄今為止全球最大的公共衛(wèi)生事件。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，截止2022年2月24日，全球新型冠狀病毒肺炎感染人數(shù)已達(dá)4.2億，死亡人數(shù)超過540萬(wàn)，嚴(yán)重威脅人類生命安全。隨著德爾塔(Delta)、奧密克戎(Omicron)等變異毒株及無(wú)癥狀感染者的出現(xiàn)，對(duì)疾病的早期診斷及疫情防控工作提出著巨大的挑戰(zhàn)。目前，COVID-19尚無(wú)特效治療藥物，接種新型冠狀病毒疫苗被認(rèn)為是控制感染最有效的方式，但其特異性抗體保護(hù)的持久性、人員接種疫苗后產(chǎn)生特異性抗體水平、再次感染中抗體的產(chǎn)生及中和抗體作用機(jī)制等問題，仍然存在著一定爭(zhēng)議。本文對(duì)SARS-CoV-2抗體檢測(cè)現(xiàn)狀及臨床應(yīng)用等情況進(jìn)行綜述，以期為COVID-19預(yù)防及診斷提供理論依據(jù)。

1 SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)

SARS-CoV-2為圓形或橢圓形，直徑60-140nm，為單股正鏈 RNA 包膜病毒。病毒基因組含有3萬(wàn)個(gè)堿基、29891個(gè)核苷酸，共編碼9860個(gè)氨基酸，組成29種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，主要包括核衣殼蛋白(nucleocapsid，N 蛋白)、膜蛋白(membrane protein，M蛋白)、包膜蛋白(envelope protein，E蛋白)和刺突糖蛋白(spike protein，S蛋白)等[1]。棘突糖蛋白由受體結(jié)合亞基S1和膜融合亞基S2兩個(gè)功能不同的亞基組成。該病毒與SARS冠狀病毒(SARS-CoV)類似，SARS-CoV-2的S1亞基可識(shí)別并與宿主細(xì)胞上的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme2，ACE2)結(jié)合，S2亞基上的融合肽可促進(jìn)病毒與宿主膜的融合，進(jìn)而感染呼吸道細(xì)胞并引起呼吸系統(tǒng)疾病[2]。S蛋白在病毒感染中具有重要的研究?jī)r(jià)值，Wrapp 等[3]的研究結(jié)果表明，ACE2與SARS-CoV-2 的S蛋白結(jié)合的親和力約為SARS-CoV的10～20倍，是SARS-CoV-2水平傳播能力較SARS-CoV強(qiáng)的重要原因。此外，已有的研究結(jié)果[4-6]提示SARS-CoV-2特異性中和抗體主要是通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合SARS-CoV-2 S蛋白的受體結(jié)合域(RBD)而發(fā)揮中和病毒效應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到有效阻斷病毒感染宿主細(xì)胞的目的[7]。

2 SARS-CoV-2特異性抗體產(chǎn)生

人類免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體通常是病原體入侵機(jī)體，機(jī)體在抗原物質(zhì)刺激下，由漿細(xì)胞產(chǎn)生一類能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白，其作用是通過特異性結(jié)合抗原，保護(hù)人體免受外部物質(zhì)或生物體的攻擊，如毒素、病毒等。根據(jù)抗體重鏈恒定區(qū)氨基酸的組成及排列順序不同共分為五種不同類型，分別為IgA、IgM、IgG、IgD和IgE，在循環(huán)中發(fā)揮保護(hù)作用的主要是IgM 和IgG類抗體。IgM通常于感染后1周左右產(chǎn)生，但半衰期僅為2～3d，其持續(xù)時(shí)間較短，是反映機(jī)體早期感染較好的標(biāo)志物；IgG常在7～14d產(chǎn)生，半衰期為23～28d，維持時(shí)間較長(zhǎng)，是感染中后期及既往感染的重要指標(biāo)[8]。人體在感染SARS-CoV-2后產(chǎn)生抗體的時(shí)間及變化規(guī)律各研究報(bào)道不盡相同。有文獻(xiàn)報(bào)道[9]感染SARS-CoV-2后大部分患者在2周左右病毒抗體檢測(cè)陽(yáng)性。QU等[10]對(duì)285例COVID-19患者研究結(jié)果提示第一周產(chǎn)生IgM抗體陽(yáng)性率僅為40%，在12～14d IgM陽(yáng)性率為95%；劉國(guó)才等[11]對(duì)483例確診病例、285例疑似病例進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，早在發(fā)病2d時(shí)即有1例患者可同時(shí)檢測(cè)到抗體IgM和IgG ；抗體陽(yáng)性率最低是在發(fā)病1 ～2周內(nèi)，其IgM和IgG陽(yáng)性率分別為18.4%、38.8%；在第7～8周可達(dá)到峰值，IgM和IgG陽(yáng)性率分別為33.9%、93.2%；抗體陽(yáng)性率在第8周后呈現(xiàn)出了下降趨勢(shì)。徐云云[12]研究顯示，COVID-19患者在病程的15～30d內(nèi)Ig M抗體陽(yáng)性率最高。羅效梅等[13]收集101例確診COVID-19患者血液樣本，采用膠體金免疫層析法檢測(cè)特異性抗體提示抗體水平陽(yáng)性率在發(fā)病8d最高，IgM抗體在28d后開始消失，IgG抗體隨著病程的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出了逐漸升高趨勢(shì)。李聞等[14]對(duì)COVID-19患者不同病程時(shí)期檢測(cè)IgM和IgG水平結(jié)果顯示，IgM抗體水平在病程早期和中期呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在病程后期呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)；而IgG抗體水平在整個(gè)病程中呈逐漸升高趨勢(shì)，與羅效梅等[13]報(bào)道一致；IgG抗體后期I值最高為(9.22±4.62)，與早期I值(0.94±0.7)相比呈現(xiàn)4倍以上升高，其變化規(guī)律與機(jī)體免疫應(yīng)答規(guī)律一致。不同研究結(jié)果出現(xiàn)差異的主要原因與不同類型抗體診斷試劑的敏感性存在差異密切相關(guān)，也可能與感染者潛伏期不同有關(guān)；進(jìn)一步對(duì)SARS-CoV-2特異性抗體產(chǎn)生變化規(guī)律進(jìn)行研究將為臨床診斷及治療提供重要參考。

3 特異性中和抗體(neutralizing antibodies，NAbs)

病原微生物入侵人體后，B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生與病原微生物表面抗原相結(jié)合的抗體以阻止其感染，這種抗體被稱為中和抗體。隨著疫苗和小分子藥物的研發(fā)，針對(duì)SARS-CoV-2的中和抗體已被證明是預(yù)防和治療COVID-19的有效手段。SARS-CoV-2通過病毒表面的S跨膜糖蛋白入侵宿主細(xì)胞，由于S蛋白在與宿主受體結(jié)合及介導(dǎo)膜融合方面起著關(guān)鍵作用，因此它被當(dāng)作中和抗體的主要靶點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道[15]S蛋白或RBD的不同區(qū)域可以誘導(dǎo)不同的抗體，根據(jù)S蛋白表位可以將不同靶蛋白分為五種類型即Ⅰ型-Ⅴ型。Ⅰ型中和抗體作用機(jī)制是中和抗體結(jié)合在RBD與ACE2之間的結(jié)合界面上，從而與ACE2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RBD，抑制SARS-CoV-2進(jìn)入細(xì)胞，主要包括C105、C102、CB6、B38、CV30等[16]；Ⅱ型中和抗體機(jī)制是中和抗體至少需要兩個(gè)以上的RBD結(jié)構(gòu)，結(jié)合在RBD底部的鉸鏈區(qū)，該區(qū)域在SARS-CoV和SARS-CoV-2之間相對(duì)保守；因此，Ⅱ型中和抗體通?？梢酝瑫r(shí)中和SARS-CoV和SARS-CoV-2。由于空間位阻，這些中和抗體需要更特異的結(jié)合條件，因此該種抗體類型較少，主要包括CR3022、EY6A、VHH-72等[17]。Ⅲ型中和抗體機(jī)制是這些中和抗體只通過重鏈與一個(gè)RBD結(jié)合，并與相鄰RBD或S1的N端結(jié)構(gòu)域上的糖基化位點(diǎn)相互作用以穩(wěn)定結(jié)合，以防止S蛋白與ACE2結(jié)合，從而防止病毒入侵宿主細(xì)胞，主要包括Fab2-4、BD23、S2M11、Fab2-43等[18]。Ⅳ型中和抗體作用機(jī)制是可以同時(shí)靶向兩個(gè)不同的區(qū)域：一個(gè)位于受體結(jié)合基序(the receptor-binding motif ,RBM)上，另一個(gè)位于RBD的一側(cè)與RBM很少或沒有重疊，主要包括P2B-2F6、BD-368-2、S2H13等[19]。Ⅴ型中和抗體作用機(jī)制為與非RBD結(jié)構(gòu)域作用，即與N端結(jié)構(gòu)域或與膜融合蛋白S2結(jié)合，由于與這兩個(gè)區(qū)域結(jié)合的抗體不能直接阻斷RBD與ACE2的結(jié)合，這種抗體可能誘導(dǎo)ADCC或ADCP，防止膜融合所需的構(gòu)象變化，空間干擾病毒粒子上的ACE2，并通過其他機(jī)制發(fā)揮作用，主要包括4A8、FC05、FC06、FC07等[20]。不同的中和抗體作用機(jī)制不同，其中和病原體的效果也不盡相同。現(xiàn)階段我國(guó)流行的SARS-CoV-2主要變異體為奧密克戎，奧密克戎是在SARS-CoV-2基礎(chǔ)上刺突蛋白上有32個(gè)位點(diǎn)突變的新變異體[21]。Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2奧密克戎變異體的傳染性是原病毒的10倍以上，是SARS-CoV-2 德爾塔變異體的兩倍。由于奧密克戎具有傳染性強(qiáng)、突變位點(diǎn)多等情況，現(xiàn)階段疫苗有效性評(píng)估顯得尤為重要，Planas D等[23]在對(duì)感染SARS-CoV-2人群及接種疫苗人群血清學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，奧密克戎變異體對(duì)所有單克隆抗體的中和作用具有完全或部分抵抗性，加強(qiáng)輝瑞SARS-CoV-2疫苗接種和對(duì)有SARS-CoV-2感染史的個(gè)體接種，可對(duì)奧密克戎變異體產(chǎn)生中和反應(yīng)，但其抗體滴度比Delta低6～23倍。Nemet I[24]對(duì)感染奧密克戎變異體人群研究發(fā)現(xiàn)，接種2針劑輝瑞SARS-CoV-2疫苗對(duì)奧密克戎變異體未產(chǎn)生中和作用，接種3劑后對(duì)奧密克戎變異體的中和效果增加100倍。由此可見，中和抗體的檢測(cè)對(duì)疫苗的接種、有效性評(píng)估及藥物的研發(fā)具有重要的價(jià)值。

4 SARS-CoV-2抗體檢測(cè)技術(shù)

抗體自19世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)以來，其在感染性疾病的輔助診斷上得到了廣泛應(yīng)用。常見抗體檢測(cè)方法主要包括：酶聯(lián)免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbent assay，ELISA)、免疫印跡法(immunoblot test,IBT)、膠體金免疫層析法(colloidal goldimmunochromatography assay，GICA)、化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLIA)及電化學(xué)發(fā)光法(electroChemiluminescence immunoassay,ECLIA)等。COVID-19疫情在全球蔓延，準(zhǔn)確、快速篩查SARS-CoV-2感染人群并進(jìn)行隔離是阻止疫情傳播的有效手段。目前應(yīng)用的SARS-CoV-2抗體檢測(cè)技術(shù)主要有膠體金法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法。不同廠家由于包被抗原及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法不同，其SARS-CoV-2抗體檢測(cè)敏感性及特異性存在著一定的差異。王遠(yuǎn)芳等[25]分別采用北京熱景生物技術(shù)有限公司、廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)有限公司及成都華西精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)有限公司生產(chǎn)的GICA法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM、IgG及總抗體，結(jié)果顯示盡管上述三種檢測(cè)試劑方法學(xué)一致，但其診斷效能各不相同?？垢蓴_因素研究結(jié)果表明，類風(fēng)濕因子對(duì)三種試劑干擾較大，顯示其假陽(yáng)性率不一；采用膠體金法檢測(cè)總抗體或與IgG/IgM抗體聯(lián)合檢測(cè)可提高檢測(cè)結(jié)果的特異性。Wan Y[26]等分別對(duì)博奧賽斯生物科技有限公司、深圳新產(chǎn)業(yè)生物科技有限公司、深圳亞輝龍生物科技有限公司及廈門萬(wàn)泰凱瑞生物科技有限公司生產(chǎn)的化學(xué)發(fā)光法免疫分析法檢測(cè)SARS-CoV-2抗體研究中發(fā)現(xiàn)，不同試劑盒敏感性和特異性均有所不同，由廈門萬(wàn)泰凱瑞生物科技有限公司生產(chǎn)SARS-CoV-2抗體敏感性為92.00%，特異性為99.23%；深圳新產(chǎn)業(yè)生物科技有限公司生產(chǎn)的SARS-CoV-2 IgM抗體敏感性較低，僅為39.55%。Harley K等[27]對(duì)雅培化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM及IgG與羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)總SARS-CoV-2抗體分析性能評(píng)價(jià)中提示，雅培IgG和羅氏總抗體檢測(cè)方法之間的一致性較高，達(dá)98.7%，在感染14d后檢測(cè)一致性為100%；而雅培IgM與羅氏總抗體檢測(cè)一致性較低，為85.5%。應(yīng)用雅培和羅氏診斷試劑對(duì)1例免疫缺陷COVID-19患者血清抗體檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，在癥狀出現(xiàn)43d中雅培SARS-CoV-2 IgM、IgG與羅氏電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)總SARS-CoV-2 抗體均顯示陰性。一項(xiàng)基于核蛋白的ELISA檢測(cè)SARS-COV-2 IgG抗體試劑盒研發(fā)報(bào)道，其選取檢測(cè)COVID-19癥狀出現(xiàn)15d人群血清中SARS-CoV-2 IgG抗體特異性為97.9%，且與目前常見的引起普通感冒的SARS-CoV如HCoV-229E、-NL63、-OC43和-HKU1感染史個(gè)體的血清之間無(wú)交叉反應(yīng)。由于該試劑盒敏感性和特異性高，操作簡(jiǎn)便，可用于在COVID-19高流行區(qū)域內(nèi)大量疑似病例的特異診斷[28]。SARS-CoV-2抗體檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床，不同試劑生產(chǎn)廠商基于不同檢測(cè)原理的SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體診斷閾值不同，其診斷敏感性及特異性也存在著一定的差距，因此，在臨床應(yīng)用前應(yīng)對(duì)不同的試劑盒檢測(cè)性能進(jìn)行必要的評(píng)估，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確，最大程度減少漏診或誤診。

5 SARS-CoV-2抗體檢測(cè)臨床應(yīng)用

SARS-CoV-2核酸檢測(cè)因其敏感性較高，目前被作為實(shí)驗(yàn)室診斷COVID-19的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于該方法學(xué)本身存在著一定的局限性，受實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、檢測(cè)人員及采樣等環(huán)節(jié)影響，同時(shí)因檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣，使得大規(guī)模人群篩查存在一定的困難，同時(shí)也存在著一定的漏診風(fēng)險(xiǎn)。SARS-CoV-2特異性抗體檢測(cè)樣本類型多為血液樣本，具有樣本穩(wěn)定性好、檢測(cè)方法簡(jiǎn)便及可批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)已逐漸被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[29]已將新冠抗體檢測(cè)納入確診方案之一。隨著SARS-CoV-2疫苗普遍接種，國(guó)家衛(wèi)生健康委在《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第九版)》[30]中對(duì)SARS-CoV-2抗體的臨床應(yīng)用，依然明確要求對(duì)于未接種SARS-CoV-2疫苗者SARS-CoV-2特異性抗體IgG/IgM同時(shí)陽(yáng)性可作為診斷依據(jù)。此外，對(duì)于既往感染者及SARS-CoV-2疫苗接種者SARS-CoV-2特異性抗體水平評(píng)估也是目前研究的熱點(diǎn)。德國(guó)Hoffmann 等[31]對(duì)SRAS-CoV的S蛋白基因研究發(fā)現(xiàn)，在感染或疫苗接種過程中針對(duì) SARS-S產(chǎn)生的抗體反應(yīng)對(duì)COVID-19感染者起到一定的保護(hù)作用，并且該位點(diǎn)也是預(yù)防感染或抗體治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。陳沐等[32]對(duì)接種SARS-CoV-2滅活疫苗(Vero細(xì)胞)后的COVID-19病例臨床特征及抗體情況進(jìn)行分析指出，接種滅活疫苗后的COVID-19患者在接觸SARS-CoV-2后盡管可在短期產(chǎn)生大量IgG抗體，但依然發(fā)??；因此，應(yīng)對(duì)SARS-CoV-2疫苗接種后的IgG抗體及再次感染后產(chǎn)生的IgG抗體進(jìn)行亞類鑒定，并且對(duì)這部分患者的病毒基因進(jìn)行測(cè)序，這樣可有助于揭示疫苗接種后發(fā)生SARS-CoV-2感染的原因。梁詠梅等[33]對(duì)181名出院6個(gè)月COVID-19患者進(jìn)行SRAS-CoV-2特異性抗體檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，117名患者IgM抗體陰性、IgG抗體陽(yáng)性，166名患者可檢測(cè)到中和抗體；同時(shí)發(fā)現(xiàn)患者的臨床癥狀嚴(yán)重程度與其體內(nèi)分泌的中和抗體水平高低呈正相關(guān)。Zhao J[34]研究報(bào)道RNA檢測(cè)在發(fā)病后7d內(nèi)敏感性最高，為66.7%；從第8d起抗體檢測(cè)的敏感性超過了RNA檢測(cè)，在發(fā)病后第12d抗體敏感性達(dá)到了90%以上。在晚期患者(發(fā)病后第15～39d)的血清樣本中，總Ab、IgM和IgG的敏感性分別為100.0%、94.3%和79.8%。進(jìn)一步分析表明，在發(fā)病后第1～3d、第4～7d、第8～14d和第15～39d采集的呼吸道樣本中RNA檢測(cè)為陰性的分別為28.6%(2/7)、53.6%(15/28)、98.2%(56/57)和100%(30/30)。聯(lián)合使用RNA和抗體檢測(cè)，顯著提高了不同階段的COVID-19患者診斷的敏感性。血清抗體檢測(cè)在再感染病例臨床研究中顯示再感染過程中發(fā)現(xiàn)了高親和力的IgG和高滴度的中和抗體[35]。這表明第一次初次免疫應(yīng)答啟動(dòng)后，第二次病毒抗原刺激時(shí)可以產(chǎn)生更快、更強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。在原發(fā)感染期間大部分抗體是非中和性的，中和性抗體水平往往較低。然而原發(fā)感染后B細(xì)胞成熟并分化為長(zhǎng)壽漿細(xì)胞或記憶B細(xì)胞。在再感染過程中，這些記憶B細(xì)胞可以迅速分化為漿母細(xì)胞，產(chǎn)生比初次感染時(shí)更快的類轉(zhuǎn)換高親和力抗體。因此建議對(duì)于之前未接觸過SARS-CoV-2的個(gè)體，采用2劑疫苗及加強(qiáng)免疫接種方案能夠產(chǎn)生更有效的免疫保護(hù)。

綜上所述，基于不同原理及生產(chǎn)工藝的SARS-CoV-2特異性抗體檢測(cè)方法，其診斷敏感性及特異性存在差異；特異性抗體檢測(cè)在COVID-19診斷、嚴(yán)重程度評(píng)估、疫苗接種方案及藥用研發(fā)上都有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。