閆漢語，張永萍，徐劍，劉耀，曹國瓊，汪祖華，宋信莉，郭玲（貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/國家苗藥工程技術(shù)研究中心/貴州省中藥民族藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心，貴陽 550025）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種伴有炎癥細(xì)胞浸潤與進(jìn)行性關(guān)節(jié)損傷的慢性自身免疫性疾病[1]。由于炎癥的反復(fù)發(fā)作以及關(guān)節(jié)軟骨、肌腱的持續(xù)破壞，最終會(huì)造成關(guān)節(jié)功能障礙，甚至殘廢，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命。雷公藤紅素（celastrol，CLT）是從我國傳統(tǒng)中草藥衛(wèi)矛科植物雷公藤中提取得到的五環(huán)三萜類化合物[2]，具有廣泛且明確的抗炎、免疫抑制、抗氧化及抗腫瘤活性[3]。CLT已被證實(shí)對(duì)RA有顯著的治療效果[4-5]，其可通過調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞胞外陷阱[6]和Th17/Tregs比例[7]、抑制破骨細(xì)胞的形成和功能[8]以及抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞的異常增殖和遷移[9]來治療RA。然而，CLT水溶性差、生物利用度低，且容易產(chǎn)生全身性毒副作用[10]，極大地限制了其臨床應(yīng)用。

有文獻(xiàn)報(bào)道，RA炎癥關(guān)節(jié)特殊的病理生理特征會(huì)增強(qiáng)炎癥部位的血管通透性和炎癥細(xì)胞的攝取作用，即ELVIS（extravasation through leaky vasculature and subsequent inflammatory cell-mediated sequestration）效應(yīng)[11]，其類似于腫瘤的強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)。也就是說，粒徑適宜的納米?？梢越柚鶵A炎癥部位通透性增大的血管向病變部位分布，并可在局部炎癥細(xì)胞的內(nèi)吞作用下滯留于病灶部位，從而實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向作用。人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是納米給藥系統(tǒng)的常用載體，具有無免疫原性、生物可降解、生物相容性良好等特點(diǎn)[12]。事實(shí)上，與穿透健康組織相比，白蛋白可更好地穿透RA的炎癥部位[13]，在炎癥組織中蓄積，調(diào)節(jié)其生理功能和代謝[14]。基于此，本研究擬使用安全無毒的HSA作為負(fù)載CLT的載體，采用超聲法制備雷公藤紅素白蛋白納米粒（celastrol-loaded albumin nanoparticles，CLTAN），通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化處方工藝，并考察該納米制劑的理化性質(zhì)及治療RA的療效，以期利用白蛋白的炎癥靶向能力和納米制劑的ELVIS效應(yīng)實(shí)現(xiàn)CLT在病灶部位的靶向蓄積，進(jìn)而為CLT的臨床推廣提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Nano ZS90型激光粒度分析儀（英國Malvern公司）、H-600型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）、1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、Axiovert 40C型倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）、SB-4200D型超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝超聲設(shè)備有限公司）、LQ-C2002型電子天平（上海瑤新電子科技有限公司）、TGL-16B型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、SY501P10型測(cè)厚儀（德清盛泰芯電子科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

CLT對(duì)照品（批號(hào)19041101，純度＞98.0%）購自成都普菲德生物科技有限公司；HSA（批號(hào)20201021）購自四川遠(yuǎn)大蜀陽藥業(yè)有限公司；大豆油（批號(hào)H21024303）購自鐵嶺北亞藥用油有限公司；聚山梨酯80（批號(hào)437597）購自北京百靈威科技有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒和大鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（貨號(hào)分別為CT075A、400-01B-50UG）均購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑（貨號(hào)7027）購自美國Chondrex公司；甲醇、乙酸為色譜純，無水乙醇、氯化鈉等試劑均為分析純及以上級(jí)別，水為純水或屈臣氏蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用的動(dòng)物為SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量為180～200 g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)合格證號(hào)為SCXK（湘）2019-0014。大鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境下，室內(nèi)溫度為（25±2）℃、相對(duì)濕度為（50±10）%，自由飲水及進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過后實(shí)施（批件號(hào)為20210070）。

2 方法與結(jié)果

2.1 CLT-AN的處方工藝

在2 mL混合溶劑[V（二氯甲烷）∶V（乙酸乙酯）＝7∶3）]中加入處方量的CLT和大豆油作為油相；取處方量的HSA，加純水溶解，得水相；將油、水兩相混合，冰浴條件下超聲粉碎，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即得CLT-AN溶液。

2.2 處方工藝的優(yōu)化及確定

在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，重點(diǎn)選取CLT投藥量、大豆油用量和超聲功率為考察因素，以納米粒的粒徑、分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）（測(cè)定方法均同“2.3.1”項(xiàng)下）及穩(wěn)定性[納米粒貯存在室溫條件下析出沉淀的時(shí)間，即Tstability（室溫）]為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化CLTAN的處方工藝。

2.2.1 CLT投藥量的考察 固定大豆油用量為45 mg、超聲功率為490 W、超聲時(shí)間為8 min，考察CLT投藥量分別為6、7、8、10、15 mg時(shí)對(duì)納米粒粒徑、PDI和穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見表1。如表1所示：隨著CLT投藥量的增加，CLT-AN的粒徑和PDI有增大的趨勢(shì)，納米體系變得不穩(wěn)定；當(dāng)CLT投藥量為6 mg或者7 mg時(shí)，納米粒的粒徑、PDI和穩(wěn)定性均較好。為保證后期藥效實(shí)驗(yàn)的給藥劑量，同時(shí)考慮CLT的用量成本，本研究最終確定CLT的投藥量為6.5 mg。

表1 CLT投藥量對(duì)納米粒性質(zhì)的影響

2.2.2 大豆油用量的考察 固定CLT投藥量為6.5 mg、超聲功率為490 W、超聲時(shí)間為8 min，考察大豆油用量分別為0、20、30、45、55 mg時(shí)對(duì)納米粒粒徑、PDI和穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見表2。如表2所示：當(dāng)油相中不加大豆油（0 mg）時(shí)，無法形成納米粒；隨著大豆油用量的增加，CLT-AN的粒徑減小，穩(wěn)定性提高。綜合考慮大豆油的用量成本及納米粒的載藥量，本研究最終確定大豆油用量為45 mg。

表2 大豆油用量對(duì)納米粒性質(zhì)的影響

2.2.3 超聲功率的考察 固定CLT投藥量為6.5 mg、大豆油用量為45 mg、超聲時(shí)間為8 min，考察超聲功率分別為330、400、490、520 W時(shí)對(duì)納米粒粒徑、PDI和穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見表3。如表3所示：隨著超聲功率的增大，納米粒的粒徑隨之減小，穩(wěn)定性隨之增加；但過高的超聲功率會(huì)導(dǎo)致納米粒PDI變大、穩(wěn)定性變差，故本研究最終確定超聲功率為490 W。

表3 超聲功率對(duì)納米粒性質(zhì)的影響

2.2.4 最佳處方工藝的確定 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定CLT-AN的處方工藝如下：在2 mL混合溶劑[V（二氯甲烷）∶V（乙酸乙酯）＝7∶3]中加入6.5 mg CLT和45 mg大豆油作為油相；取20%HSA 1 mL，加純水溶解至10 mL，得到2%HSA溶液，作為水相；兩相混合后，在冰浴中經(jīng)超聲波細(xì)胞粉碎儀超聲（功率490 W）處理8 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，即得CLT-AN溶液。

2.3 CLT-AN的表征

2.3.1 粒徑、PDI和Zeta電位的測(cè)定 取適量按最佳處方工藝制備的CLT-AN，用純水稀釋至1 mL，采用激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑、PDI和Zeta電位，每份樣品平行檢測(cè)3次。結(jié)果顯示，CLT-AN的粒徑為（96.8±1.1）nm，PDI為0.174±0.020，Zeta電位為（-18.6±1.7）mV。CLT-AN的粒徑分布呈單峰且峰形較窄，說明粒徑分布較均一。CLT-AN的粒徑和Zeta電位分布見圖1。

圖1 CLT-AN的粒徑和Zeta電位分布

2.3.2 形態(tài)學(xué)觀察 取適量按最佳處方工藝制備的CLT-AN滴至覆有支持膜的銅篩網(wǎng)上，用2%磷鎢酸染色10 s，用濾紙吸去多余的染液，等自然干燥后，在透射電鏡下觀察CLT-AN的輪廓和形態(tài)。結(jié)果顯示，所制CLT-AN呈類球形，形態(tài)較規(guī)則、圓整，大小較均一，詳見圖2。

圖2 CLT-AN的透射電鏡圖

2.4 CLT的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件色譜柱為Kromasil-C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-10%乙酸溶液（95∶5，V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長為425 nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10μL。

2.4.2 溶液的制備 取不含CLT的空白納米粒和CLTAN，分別加入5 mL甲醇，超聲（頻率400 W，功率53 kHz，下同）10 min破乳，然后以13 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液，即得空白對(duì)照溶液和供試品溶液。精密稱取CLT對(duì)照品，用甲醇溶解并定容至50 mL，即得對(duì)照品溶液。

2.4.3 方法學(xué)考察 專屬性考察結(jié)果顯示，CLT對(duì)照品及CLT-AN在相同保留時(shí)間處均有類似的色譜峰，而空白納米粒中的輔料在CLT的出峰位置沒有峰，表明輔料不會(huì)干擾CLT的測(cè)定，專屬性較好（圖略）。用峰面積（A）對(duì)CLT的質(zhì)量濃度（c）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為A＝12.431c+0.844 8（R2＝0.999 3），表明CLT在1～20 g/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。精密度考察結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液峰面積的RSD分別為0.98%、1.07%、0.55%（n＝5），表明儀器精密度良好。重復(fù)性考察結(jié)果顯示，供試品溶液中CLT含量的RSD為1.49%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，供試品溶液在室溫放置0、4、8、12、24 h時(shí)峰面積的RSD為1.28%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密量取適量已知含量的CLT-AN，共9份，分別按已知含量的80%、100%、120%加入CLT對(duì)照品（每個(gè)濃度3份）并依法測(cè)定，結(jié)果80%、100%、120%加樣量樣品的平均加樣回收率分別為98.51%、100.59%、98.76%，RSD分別為0.66%、0.51%、0.43%（n＝3），表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.5 包封率及載藥量測(cè)定

取0.2 mL按最佳處方工藝制備的新鮮CLT-AN，過G50葡聚糖凝膠柱分離CLT-AN和游離CLT。分離出的CLT-AN用甲醇超聲10 min破乳，然后以13 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取濾液10 μL，按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定CLT-AN中包載的CLT含量（We）。另取未過凝膠柱的樣品0.2 mL，直接用甲醇破乳，然后以13 000 r/min離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，同法測(cè)定體系中藥物總含量（Wt）。通過下式計(jì)算包封率：包封率（%）＝We/Wt×100%[15]。另取0.2 mL按最佳處方工藝制備的新鮮CLT-AN，凍干后稱定CLT-AN干粉的總質(zhì)量（Wd），通過下式計(jì)算載藥量：載藥量（%）＝We/Wd×100%[16]。各實(shí)驗(yàn)平行制備3份樣品，每份樣品測(cè)定3次。結(jié)果顯示，CLT-AN的包封率和載藥量分別為（94.61±0.46）%和（2.42±0.21）%。

2.6 體外穩(wěn)定性考察

將按最優(yōu)工藝制備的CLT-AN保存于室溫條件下，分別在0、1、3、5 d定時(shí)取樣測(cè)定其粒徑、PDI、Zeta電位和包封率，考察其穩(wěn)定性。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行測(cè)定3次。結(jié)果，隨著放置時(shí)間的延長，CLT-AN的粒徑、PDI、Zeta電位和包封率均無明顯變化，且未見沉淀或渾濁現(xiàn)象，說明CLT-AN在室溫條件下貯存5 d比較穩(wěn)定。結(jié)果見表4。

表4 室溫下CLT-AN的穩(wěn)定性考察結(jié)果（±s，n=3）

表4 室溫下CLT-AN的穩(wěn)定性考察結(jié)果（±s，n=3）

時(shí)間/d 0 1 3 5粒徑/nm 95.8±1.3 94.7±1.0 96.1±1.1 96.8±1.5 PDI 0.180±0.010 0.187±0.020 0.178±0.030 0.184±0.010 Zeta電位/mV-19.6±2.1-20.1±1.0-21.3±2.0-20.6±1.7包封率/%94.59±0.39 95.61±0.46 93.77±0.63 93.61±1.16

2.7 體外釋放行為考察

精密量取2.0 mL CLT溶液（取CLT對(duì)照品，以二甲基亞砜為溶劑制得）和按最優(yōu)工藝制備的CLT-AN溶液（CLT含量均為1.18 mg），裝入透析袋（截留分子量為8 000～10 000 Da）內(nèi)，兩端扎緊，以40 mL含1%聚山梨酯80的磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH＝7.4）為釋放外液，在37℃水浴恒溫振蕩器（100 r/min）內(nèi)釋放，每份樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。在0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h時(shí)分別取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)充同溫、同體積的釋放外液。按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定釋放樣品中CLT的藥物濃度，計(jì)算累積釋放量，并繪制釋放曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可知：游離CLT在24 h內(nèi)基本釋放完全；CLT-AN在12 h前屬于快速釋放期，12 h后屬于緩慢釋放期，72 h內(nèi)的累積釋放量達(dá)73.56%，具有明顯的緩釋特征。

圖3 CLT和CLT-AN的體外釋藥曲線（±s，n=3）

2.8 抗RA的藥效評(píng)價(jià)

2.8.1 模型建立及分組、給藥 于SD大鼠尾根部皮下注射100 μL完全弗氏佐劑（含結(jié)核分枝桿菌10 mg/mL）建立佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（adjuvant induced arthritis，AIA）大鼠模型[11]，造模當(dāng)天記為第0天。造模后第14天，大鼠四肢出現(xiàn)明顯腫脹，提示造模成功。將AIA模型大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、CLT組和CLT-AN組，每組6只。按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定游離CLT溶液濃度以及CLTAN溶液中CLT濃度后，CLT組和CLT-AN組大鼠分別尾靜脈注射給藥，給藥劑量按CLT計(jì)均為1 mg/kg[10]；模型組大鼠同法注射等體積PBS。隔天注射1次，連續(xù)給藥4次。另外選取6只健康大鼠作為正常組，同法注射等體積PBS。

2.8.2 CLT-AN對(duì)AIA模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹的影響 造模后第14天，參照文獻(xiàn)[11]，采用0～4級(jí)關(guān)節(jié)評(píng)分法對(duì)各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度進(jìn)行評(píng)分：0分，無紅斑和關(guān)節(jié)腫脹跡象；1分，踝關(guān)節(jié)或腳掌中部有紅斑或輕度腫脹；2分，踝關(guān)節(jié)至腳掌中部有紅斑和腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)和足跖關(guān)節(jié)有紅斑和中度腫脹；4分，踝關(guān)節(jié)至腳掌有紅斑和嚴(yán)重腫脹。關(guān)節(jié)腫脹度評(píng)分為四肢評(píng)分總和，用關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）表示。另外使用測(cè)厚儀測(cè)定各組大鼠后肢的腳掌厚度。AI和腳掌厚度的測(cè)量從造模后第14天開始，每隔1天測(cè)定1次，直至造模后第22天。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。結(jié)果見圖4、圖5。

由圖4可知，隨著給藥次數(shù)的增加，CLT-AN組大鼠的AI和腳掌厚度均出現(xiàn)大幅度下降。到造模后第22天，其AI和腳掌厚度均顯著低于CLT組和模型組（P＜0.05）。由圖5可知，模型組大鼠顯示出嚴(yán)重而全面的關(guān)節(jié)腫脹與關(guān)節(jié)變形；CLT組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度較模型組稍微減輕，但效果并不明顯；CLT-AN組大鼠關(guān)節(jié)與腳掌腫脹程度均較模型組顯著改善（P＜0.05），其關(guān)節(jié)與腳掌形貌趨近于正常組大鼠。

圖4 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度評(píng)分和腳掌厚度測(cè)定結(jié)果（±s，n=6）

圖5 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度圖

2.8.3 CLT-AN對(duì)AIA大鼠血清中炎癥因子水平的影響 造模后第22天，取各組大鼠血液，放置30 min后以7 000 r/min離心10 min，收集血清樣品，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測(cè)血清中炎癥因子TNF-α和IL-1β含量，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，相較于模型組和CLT組，CLT-AN組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量均顯著降低（P＜0.05）。

表5 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量測(cè)定結(jié)果（±s，n=6，pg/mL）

表5 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量測(cè)定結(jié)果（±s，n=6，pg/mL）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與CLT組比較，P＜0.05

IL-1β 247.06±23.24 515.64±38.18a 409.27±39.86b 268.32±6.11bc組別正常組模型組CLT組CLT-AN組TNF-α 310.50±45.96 849.33±33.00a 651.17±31.82b 393.00±44.31bc

2.8.4 CLT-AN對(duì)AIA模型大鼠關(guān)節(jié)組織病理狀態(tài)的影響 取血后處死大鼠，取其踝關(guān)節(jié)，常規(guī)固定、脫鈣后制備石蠟包埋切片（厚度為4 μm），脫蠟至水，行HE染色、中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織學(xué)變化，結(jié)果見圖6。圖6結(jié)果顯示：模型組大鼠關(guān)節(jié)面呈中重度缺損伴軟骨消失，大部分骨組織壞死，關(guān)節(jié)組織中有大量炎癥細(xì)胞浸潤；CLT組大鼠的病理情況較模型組略有改善，但炎癥細(xì)胞浸潤以及組織壞死仍十分明顯；CLTAN組大鼠雖仍有少量炎癥細(xì)胞浸潤，但可觀察到清晰、完整的關(guān)節(jié)腔，并且骨組織正常，未見骨萎縮及壞死。

圖6 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理狀態(tài)（HE染色）

3 討論

RA是一種不可逆轉(zhuǎn)的自身免疫性疾病，目前臨床主要采用非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、改善病情的抗風(fēng)濕藥以及生物制劑對(duì)其進(jìn)行治療[17]。但這些藥物療效不一，有的緩解RA癥狀后易復(fù)發(fā)，有的長期或者大量使用極易引起一系列毒副作用，如非甾體抗炎藥容易引起胃腸道出血，糖皮質(zhì)激素類藥物會(huì)造成股骨頭壞死[18]。因此，研究開發(fā)高效低毒的RA治療方法具有重要的臨床意義。CLT已被證實(shí)對(duì)RA具有良好的治療效果，但其溶解度較差（在pH 7.4緩沖液中的溶解度為11 μg/mL）[19]、生物利用度低（口服生物利用度為17.06%）[20]，且給藥后體內(nèi)非選擇性地廣泛分布可導(dǎo)致心臟、肝臟及神經(jīng)毒性[10]，嚴(yán)重限制了其開發(fā)利用。本研究將CLT包載于納米粒中，一方面是嘗試通過納米技術(shù)改善CLT理化性質(zhì)的缺陷，另一方面是想利用白蛋白的炎性靶向能力和納米制劑的ELVIS效應(yīng)，提高藥物在病灶部位的蓄積量，達(dá)到增強(qiáng)藥物療效和降低毒性的目的。

在本研究中，筆者通過超聲法制備了CLT-AN，該方法屬于新型白蛋白納米制備技術(shù)（nanoparticle-albumin bound technology，NabTM），是一種適合包載難溶性藥物的納米技術(shù)[21]。該技術(shù)以白蛋白作為載體材料和穩(wěn)定劑，通過高剪切力（超聲、高壓均質(zhì)等方法）產(chǎn)生局部高熱以及氣穴空化效應(yīng)，使白蛋白分子中原有的巰基在水不溶性藥物液滴周圍交聯(lián)形成新的二硫鍵，進(jìn)而將白蛋白交聯(lián)在一起形成納米粒。美國FDA批準(zhǔn)上市的白蛋白結(jié)合紫杉醇納米粒注射液（Abraxane）正是基于這種技術(shù)制備的[22]。基于NabTM包載難溶性藥物的基本要求有兩點(diǎn)：第一，藥物在與水不相溶的溶劑中有較高溶解度；第二，藥物具有較高的血漿蛋白結(jié)合率[22]。CLT難溶于水，能溶于乙酸乙酯、二氯甲烷和氯仿等有機(jī)溶劑，且與白蛋白結(jié)合率高（血漿蛋白結(jié)合率大于80%）[23-24]，提示其適合采用NabTM制備成載藥白蛋白納米粒，并能獲得較高的包封率。此外，白蛋白具有獨(dú)特的疏水袋狀結(jié)構(gòu)[22]，可通過疏水作用與CLT結(jié)合，這也為制備高包封率的載藥納米粒創(chuàng)造了有利條件。CLT的水難溶性和較強(qiáng)的血漿蛋白結(jié)合率、白蛋白獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)以及超聲法制備技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，是本研究制備得到較高包封率CLT-AN的主要原因。

粒徑是影響納米粒在關(guān)節(jié)部位蓄積的最重要因素之一：粒徑過大的納米粒無法穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙進(jìn)入關(guān)節(jié)腔；粒徑過小的納米載體雖能穿過內(nèi)皮層，但是也很容易重新回到血液中而無法實(shí)現(xiàn)大量蓄積；而粒徑100 nm左右的納米粒既能穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，又能在關(guān)節(jié)腔內(nèi)大量蓄積滯留[25]。因此，本研究首先通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選最優(yōu)處方工藝，希望得到粒徑在100 nm左右且穩(wěn)定性好的CLT-AN。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，投藥量、大豆油用量和超聲功率對(duì)納米粒的粒徑和穩(wěn)定性有很大影響：（1）投藥量過多，藥物在有機(jī)相中難以溶解完全，容易造成CLT-AN粒徑增大、穩(wěn)定性差以及藥物泄露等問題。（2）大豆油在水相中分散較慢，不具有揮發(fā)性，白蛋白可以逐漸在油滴周圍交聯(lián)形成包衣，使溶解在油相中的CLT不易向水相擴(kuò)散，有助于形成CLT-AN。當(dāng)大豆油用量較少時(shí)，所形成的油滴不足以承載處方中所有CLT，易導(dǎo)致納米體系粒徑較大、穩(wěn)定性差。（3）超聲法制備納米粒是通過超聲波產(chǎn)生的外加能量使體系中的粒子分散成型，若超聲功率太低則不能使納米粒分散成小粒徑粒子，隨著超聲功率的增大，納米粒粒徑隨之減小、穩(wěn)定性隨之增加。最終，本研究通過篩選出的最佳處方工藝制得了粒徑約100 nm、表面電荷約-18 mV的均一、穩(wěn)定且包封率高的CLT-AN。此外，本研究通過建立AIA大鼠模型對(duì)CLT-AN的藥效進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，與PBS和游離CLT相比，CLT-AN可以顯著遏制AIA模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹，降低其血清中炎癥因子（TNF-α、IL-1β）的水平，同時(shí)顯著改善其關(guān)節(jié)組織的病理狀況。

綜上所述，本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出了CLTAN的最佳處方工藝，按最佳工藝制備的CLT-AN的粒徑、PDI適宜，穩(wěn)定性良好，具有顯著的緩釋特征，且具有較好的抗RA作用。后續(xù)，筆者將對(duì)CLT-AN的體內(nèi)分布、體內(nèi)安全性等進(jìn)行全面研究，為其進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用提供更完整的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。