白竹林，趙大慶，陳靜靜，曾婧，白雪媛，王思明（長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院，長春 130117）

衰老是生物體正常的生理過程，其受體內外多種因素（環(huán)境因素、心理因素、遺傳因素等）的影響，涉及全身多個器官和系統(tǒng)。根據2020年全國人口普查結果，中國60歲及以上老人有26 402萬人，占總人口的18.70%，比十年前的數據增加了5.44%[1]，提示中國人口老齡化進程進一步深化。隨著老齡化問題的日益嚴重，越來越多的學者開始關注抗衰老研究。

目前，用于研究衰老的模型十分廣泛，從簡單的單細胞生物到復雜的哺乳動物均有所應用，如釀酒酵母、線蟲、果蠅、鼠等[2]。釀酒酵母是抗衰老研究中最簡單的生物模型，其衰老代謝反應機制與人體細胞非常相似[3]，生長周期短且易于培養(yǎng)，可進行高通量藥物活性篩選[4]?；谏鲜鰞?yōu)點，釀酒酵母已被廣泛用作研究衰老的模式生物。

中醫(yī)學認為，衰老是指隨著年齡的增長，人體陽氣下降，氣血不足，內臟功能下降，氣血陰陽失衡。中醫(yī)衰老學說包括腎虛衰老說、脾胃虛弱衰老說、氣虛血瘀衰老說等[5]。根據中醫(yī)古籍記載，人參-茯苓藥對是一種常用的配伍組合，在古代抗衰老方劑中，人參和茯苓配伍的比例排在第1位，二者配伍組合出現了146次[6—7]?！渡褶r本草經》記載“人參主補五臟，久服輕身延年”[8]。研究表明，茯苓具有安魂、養(yǎng)神、延年的作用[9]。目前關于人參、茯苓二者配伍抗衰老的相關研究較少，且作用機制尚不明確?；诖?，本研究以釀酒酵母為衰老模型生物，篩選人參-茯苓藥對抗衰老的最佳配伍比例、給藥濃度和給藥時間點，通過測定抗氧化酶活性，活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP），以及氧化應激與能量代謝相關基因mRNA表達水平，初探人參-茯苓藥對抗衰老作用機制，以期為人參-茯苓藥對治療由衰老導致的疾病提供實驗參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有innova40型全溫振蕩培養(yǎng)箱、Eppendorf AG型高速離心機（德國Eppendorf公司），AB135-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），infinite M200PRO型酶標儀（瑞士TECAN公司），SCIENTZ型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司），CFX型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）儀（美國Bio Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

人參、茯苓購自吉林省長春市宏檢大藥房（批號分別為20210326、20210415），經長春中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室王哲副教授鑒定為真品；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Hyclone公司（批號AC10257442）；YPD液體培養(yǎng)基、MTT、卡那霉素、酵母破壁酶、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒、過氧化物酶（peroxidase，POD）檢測試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司（批號分別為626J031、1015D052、325P0414、20201130、20210924、20211009）；BCA蛋白定量試劑盒、ROS檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒、MMP檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司（批號分別為070721211011、061821211119、073120201113、020421210406）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、ATP含量檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（批號分別為20210830、20190708）；總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司（批號W9113）；RNA逆轉錄試劑盒、TB Green?Premix Ex TaqTM試劑盒均購自日本Takara公司（批號分別為AK71647A、AJG1875A）；目標基因TUB1、SOD1、CTT1、GSH1、ATP1、MRS1、CDC19由長春庫美生物科技有限公司合成，引物序列和擴增產物長度見表1。

表1 PCR引物序列和擴增產物長度

1.3 菌種

本研究所用釀酒酵母BY4742購自武漢淼靈生物科技有限公司。

2 方法

2.1 人參-茯苓藥對提取物的制備

筆者查閱相關文獻發(fā)現，人參、茯苓在臨床上的常用配伍比例為1∶1、1∶2和1∶4（m/m，下同）[10-11]，故本研究設置人參、茯苓的配伍比例為1∶1、1∶2、2∶1、1∶4、4∶1。將人參、茯苓分別粉碎過60目篩后，按1∶1、1∶2、2∶1、1∶4、4∶1混勻備用，每份50 g。取混勻后的藥材粉末加10倍量水（mL/g，下同）煎煮2 h，過濾；濾渣加8倍量水煎煮1.5 h，過濾；合并2次濾液，以5 000 r/min離心10 min，取上清液，濃縮，烘干，即得不同配伍比例的人參-茯苓藥對提取物（得率分別為14.83%、11.03%、16.07%、7.74%、22.06%）。另外，同法制備人參、茯苓單味藥材提取物，得率分別為28.36%、2.46%。

2.2 釀酒酵母的培養(yǎng)及生長曲線繪制

將釀酒酵母以平板劃線方式在YPD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，于28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h活化。取活化后的單菌落置于5 mL YPD液體培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基中加入50 mg/mL卡那霉素5 μL），于28 ℃、180 r/min培養(yǎng)箱中擴大培養(yǎng)，再進行二次擴大培養(yǎng)，使接種量為2%[12]。取經二次擴大培養(yǎng)后的菌液，以2%的接種量接種于新的培養(yǎng)基中，置于28℃、180 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并將此時記為0 h（初始接種期），每隔4 h取樣。孔板中加入不同培養(yǎng)時間的釀酒酵母菌液30 μL，再加420 μL培養(yǎng)基，采用MTT法于600 nm波長處測定樣品吸光度值，以培養(yǎng)時間為橫坐標、吸光度值×稀釋倍數為縱坐標繪制生長曲線，以確認釀酒酵母進入衰老期的時間點。

2.3 人參-茯苓藥對最佳配伍比例和給藥條件的篩選

2.3.1 最佳配伍比例的篩選 筆者參考文獻[13]方法，先將不同配伍比例的人參-茯苓藥對提取物的給藥濃度設置為180 μg/mL，給藥時間點設置為第16 h。取“2.2”項下經二次擴大培養(yǎng)的釀酒酵母菌液，按2%的接種量接種于新的培養(yǎng)基中（此時開始計時，下同），培養(yǎng)至第16 h時，分為空白對照組和不同配伍比例（1∶1、1∶2、2∶1、1∶4、4∶1）的人參-茯苓藥對提取物組，空白對照組加入等體積無菌水，給藥組分別加入180 μg/mL不同配伍比例的人參-茯苓藥對提取物，繼續(xù)培養(yǎng)至第96 h，取樣；采用MTT法測定細胞吸光度值（吸光度值越大，表明細胞存活率越高），以篩選最佳配伍比例。實驗重復3次。

2.3.2 最佳給藥濃度的篩選 參考文獻[14]方法，將給藥時間點設置為第16 h，人參-茯苓藥對1∶4提取物（根據“2.3.1”項下結果確定）的給藥濃度設置為100、140、180、220、260、300 μg/mL。取“2.2”項下經二次擴大培養(yǎng)的釀酒酵母菌液，按2%的接種量接種于新的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第16 h時，分為空白對照組和人參-茯苓藥對1∶4提取物不同給藥濃度組，空白對照組加入等體積無菌水，給藥組分別加入不同濃度的人參-茯苓藥對1∶4提取物，繼續(xù)培養(yǎng)至第96 h，取樣；采用MTT法測定細胞吸光度值，以篩選最佳給藥濃度。實驗重復3次。

2.3.3 最佳給藥時間點的篩選 選擇“2.3.1”“2.3.2”項下篩選出的最佳配伍比例和給藥濃度，將給藥時間點設置為第16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88 h。取“2.2”項下經二次擴大培養(yǎng)的釀酒酵母菌液，按2%的接種量接種于新的培養(yǎng)基中，分為空白對照組和不同給藥時間點組，然后分別培養(yǎng)至上述時間點時給藥，繼續(xù)培養(yǎng)至第96 h，取樣；采用MTT法測定細胞吸光度值，以篩選最佳給藥時間點。實驗重復3次。

2.4 釀酒酵母細胞內抗氧化酶活性及ROS、MDA水平的測定

2.4.1 分組及給藥 取“2.2”項下經二次擴大培養(yǎng)的釀酒酵母菌液，按2%的接種量接種于新的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第28 h時，分為空白對照組、人參-茯苓藥對1∶4提取物組（220 μg/mL）、人參單藥組（220 μg/mL）、茯苓單藥組（220 μg/mL）。空白對照組加入等體積無菌水，各給藥組分別加入相應藥物，繼續(xù)培養(yǎng)至第96 h后，取樣進行后續(xù)實驗。

2.4.2 粗酶液的制備 取“2.4.1”項下各組釀酒酵母菌液500 μL，以3 000 r/min離心5 min，吸棄培養(yǎng)基；沉淀用PBS洗滌3次后，加入500 μL PBS，置于冰水浴中超聲（功率300 W，工作9 s，間歇3 s，總時間為5 min）破碎，然后于4℃條件下以12 000 r/min離心10 min，取上清液（即粗酶液），采用BCA法測定蛋白濃度后，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3 釀酒酵母細胞內SOD、POD、CAT水平及MDA水平的檢測 取“2.4.2”項下各組釀酒酵母細胞粗酶液適量至96孔板中，每組設3個復孔，按照試劑盒說明書方法檢測細胞內抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性及MDA水平。實驗重復3次。

2.4.4 釀酒酵母細胞內ROS水平的檢測 取“2.4.1”項下各組釀酒酵母菌液50 μL，以3 000 r/min離心5 min，吸棄培養(yǎng)基；沉淀用PBS洗滌3次后，加入DCFH-DA染色液500 μL，置于28℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。離心棄去染色液，以PBS洗滌細胞3次后，用500 μL PBS重懸，取100 μL重懸液加入熒光板中，采用熒光酶標儀檢測各組細胞內ROS的水平。實驗重復3次。

2.5 釀酒酵母細胞內ATP含量及MMP的測定

2.5.1 ATP含量的測定 取“2.4.1”項下各組釀酒酵母菌液50 μL，以3 000 r/min離心5 min，吸棄培養(yǎng)基；沉淀用PBS洗滌3次后，加入酵母破壁酶，于30℃孵育2 h，再離心除去上清液，沉淀用PBS清洗3次；加入200 μL裂解液渦旋5 s，反復3次，于4℃條件下以12 000 r/min離心5 min，取上清液按照試劑盒說明書方法操作，檢測ATP含量。實驗重復3次。

2.5.2 MMP的測定 取“2.4.1”項下各組釀酒酵母菌液50 μL，以3 000 r/min離心5 min，吸棄培養(yǎng)基；沉淀用PBS洗滌3次后，加入2 μmol/L羅丹明123溶液500 μL，于28℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min；離心除去上清液，沉淀用PBS洗滌3次后，加入500 μL PBS重懸，采用流式細胞儀檢測MMP。實驗重復3次。

2.6 釀酒酵母細胞內氧化應激與能量代謝相關基因mRNA表達水平的測定

取“2.4.1”項下各組釀酒酵母菌液5 mL，用Trizol法提取總RNA，利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，再以cDNA為模板，進行PCR。PCR反應體系（共25 μL）為SYBR 12.5 μL，DEPC水8 μL，cDNA模版2.5 μL，上、下游引物各1 μL。反應條件為95℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。以TUB1為內參，采用2-△△Ct法定量分析SOD1、CTT1、GSH1、ATP1、MRS1、CDC19 mRNA的表達水平。實驗重復3次。

2.7 統(tǒng)計學方法

數據采用GraphPad Prism 9軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均采用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 釀酒酵母的生長曲線

由圖1可知，第0～4 h時為釀酒酵母的遲滯期，第4～16 h時為對數生長期，16 h以后進入穩(wěn)定期，第68 h時到達拐點，釀酒酵母開始進入衰老期，直至第96 h左右酵母細胞數量趨于穩(wěn)定，因此選擇第96 h作為本實驗的檢測時間點。

圖1 釀酒酵母的生長曲線

3.2 人參-茯苓藥對最佳配伍比例和給藥條件

3.2.1 最佳配伍比例 與空白對照組（0.46±0.02）比較，人參-茯苓藥對2∶1提取物組（0.58±0.06）和人參-茯苓藥對1∶4提取物組（0.78±0.03）的吸光度值均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且后者的吸光度值更大，提示釀酒酵母細胞的存活率更高。由此可知，人參、茯苓的最佳配伍比例為1∶4。

3.2.2 最佳給藥濃度 與空白對照組（5.36±0.12）比較，人參-茯苓藥對1∶4提取物220 μg/mL組（7.61±0.13）和人參-茯苓藥對1∶4提取物300 μg/mL組（6.52±0.17）的吸光度值均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且前者的吸光度值更大（即釀酒酵母細胞的存活率更高）、給藥濃度更小。由此可知，人參-茯苓藥對1∶4提取物的最佳給藥濃度為220 μg/mL。

3.2.3 最佳給藥時間點 與空白對照組（8.22±0.24）比較，第28 h組（10.55±0.08）和第64 h組（8.71±0.06）的吸光度值均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且前者吸光度值更大，提示釀酒酵母細胞的存活率更高。由此可知，最佳給藥時間點為第28 h。

3.3 釀酒酵母細胞內抗氧化酶活性及MDA、ROS水平

與空白對照組比較，人參-茯苓藥對1∶4提取物組釀酒酵母細胞內抗氧化酶SOD、POD、CAT活性均顯著升高（P＜0.01），MDA、ROS水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；人參單藥組釀酒酵母細胞內POD、CAT活性顯著升高（P＜0.05）；茯苓單藥組釀酒酵母細胞內SOD、POD、CAT活性均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組釀酒酵母細胞內抗氧化酶活性及MDA、ROS水平的測定結果（±s，n＝3）

表2 各組釀酒酵母細胞內抗氧化酶活性及MDA、ROS水平的測定結果（±s，n＝3）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與空白對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組人參-茯苓藥對1∶4提取物組人參單藥組茯苓單藥組ROS 4155.77±137.73 3553.84±261.97b 3992.93±246.53 4082.47±47.66 SOD/（U/mgprot）63.70±1.42 96.22±1.29a 72.21±2.57 78.83±0.84b POD/（U/mgprot）4.97±0.07 14.09±0.12a 10.21±0.12 13.06±0.08a CAT/（U/mgprot）0.65±0.03 8.12±0.17a 4.38±0.19b 2.97±0.08a MDA/（μmol/mgprot）0.88±0.01 0.50±0.08a 0.55±0.06 0.74±0.03

3.4 釀酒酵母細胞內ATP含量及MMP水平的測定結果

與空白對照組比較，人參-茯苓藥對1∶4提取物組釀酒酵母細胞內ATP含量及MMP均顯著升高（P＜0.01）；人參單藥組和茯苓單藥組釀酒酵母細胞內ATP含量顯著升高（P＜0.05）。結果見表3、圖2。

表3 各組釀酒酵母細胞內ATP含量及MMP的測定結果（±s，n＝3）

表3 各組釀酒酵母細胞內ATP含量及MMP的測定結果（±s，n＝3）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與空白對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組人參-茯苓藥對1∶4提取物組人參單藥組茯苓單藥組ATP/（nmoL/mg）153.41±15.78 863.32±23.59a 746.52±18.13b 689.37±11.19b MMP/Hz 165.98±10.08 367.30±18.90a 223.40±8.87 226.48±9.99

圖2 各組釀酒酵母細胞內MMP的熒光強度圖

3.5 釀酒酵母細胞內氧化應激與能量代謝相關基因mRNA表達水平的測定結果

與空白對照組比較，人參-茯苓藥對1∶4提取物組釀酒酵母細胞內SOD1、ATP1、CDC19 mRNA的表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），CTT1、GSH1、MRS1 mRNA的表達水平均顯著升高（P＜0.01）；人參單藥組和茯苓單藥組釀酒酵母細胞內SOD1（茯苓單藥組除外）、ATP1 mRNA的表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表4。

表4 各組釀酒酵母細胞內氧化應激與能量代謝相關基因mRNA表達水平的測定結果（±s，n＝3）

表4 各組釀酒酵母細胞內氧化應激與能量代謝相關基因mRNA表達水平的測定結果（±s，n＝3）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與空白對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組人參-茯苓藥對1∶4提取物組人參單藥組茯苓單藥組SOD1mRNA 1.00±0.00 0.61±0.01a 0.63±0.01b 0.91±0.02 CTT1mRNA 1.00±0.00 2.50±0.12a 0.97±0.01 1.41±0.39 GSH1mRNA 1.00±0.00 1.71±0.18a 1.40±0.05 1.15±0.09 ATP1mRNA 1.00±0.00 0.31±0.01a 0.37±0.06a 0.68±0.02b MRS1mRNA 1.00±0.00 1.40±0.05a 1.09±0.11 0.82±0.01 CDC19mRNA 1.00±0.00 0.49±0.01b 0.74±0.04 0.95±0.02

4 討論

人參和茯苓均具有抗衰老作用，在古代許多方劑中均有應用，且人參-茯苓藥對是抗衰老最常見的配伍。目前，大多數學者研究的是人參或茯苓中某種化學成分的抗衰老作用，如：人參總皂苷對果蠅有抗衰老作用；人參皂苷Rg1可在造血干/祖細胞連續(xù)移植中延緩細胞衰老；人參皂苷Re可修復自然衰老大鼠的學習記憶能力；人參多糖可通過抑制ROS表達延緩細胞衰老；茯苓多糖可通過清除自由基實現抗衰老作用；茯苓水提取物可抑制人成纖維細胞HS68的衰老凋亡；茯苓酸可延緩人肺成纖維細胞WI-38的衰老，等等[15-21]?；诖耍P者首先對人參、茯苓的配伍比例進行篩選，結果發(fā)現，當人參、茯苓的質量比為1∶4時，釀酒酵母細胞的存活率最高；再通過進一步篩選，得到人參-茯苓藥對1∶4提取物的最佳給藥濃度為220 μg/mL、最佳給藥時間點為第28 h。

相關研究表明，氧化反應可為生命體提供能量，該反應過程中產生的ROS越高，則抗氧化能力越弱[22]。因此，ROS的清除對機體具有重要作用。清除ROS的過程常需要一系列抗氧化酶的參與，其中就包括SOD、POD和CAT等[23]。MDA是脂質過氧化反應中的重要標志物，可間接反映細胞遭受自由基損害的嚴重程度[24]。本研究發(fā)現，經人參-茯苓藥對1∶4提取物干預后，釀酒酵母細胞內抗氧化酶SOD、POD、CAT活性均顯著升高，ROS和MDA水平均顯著降低，這表明人參-茯苓藥對1∶4提取物可緩解釀酒酵母細胞內的氧化應激程度。

釀酒酵母中的抗氧化活性基因主要有SOD1、CTT1、GSH1等[25]。SOD1基因編碼銅/鋅過氧化物歧化酶，可將氧自由基轉化為H2O2，再進一步被機體清除[26]。CTT1基因的高表達可抵御氧化損傷；谷胱甘肽具有抗氧化作用，GSH1是編碼谷胱甘肽合成酶的基因，對谷胱甘肽的合成具有重要作用[27]。本研究發(fā)現，經人參-茯苓藥對1∶4提取物干預后，釀酒酵母細胞中CTT1、GSH1 mRNA的表達水平均顯著升高，SOD1 mRNA的表達水平顯著降低，這進一步說明人參-茯苓藥對1∶4提取物可通過正向調控氧化應激相關基因的表達來發(fā)揮抗衰老的作用。

衰老與細胞凋亡密切相關，在衰老過程中伴隨著細胞凋亡、壞死等。衰老細胞內ATP含量下降，MMP會隨著細胞狀態(tài)的改變而發(fā)生改變，MMP的丟失被認為是早期凋亡的特征之一[28]。線粒體是能量代謝的主要場所，ATP合酶是線粒體氧化磷酸化的關鍵酶，其功能缺陷會導致能量代謝障礙，從而引起細胞衰老。ATP1基因是調控ATP酶的α亞基，其水平下調可以促進ATP酶的合成，從而維持細胞能量代謝穩(wěn)定[29]；CDC19基因可調控丙酮酸脫氫酶激酶，其水平下調可以增加ATP的有效循環(huán)，對能量代謝有正向作用[30]；MRS1是編碼細胞線粒體轉運蛋白的基因，其高表達有利于維持線粒體的正常結構及功能[31]。本研究發(fā)現，經人參-茯苓藥對1∶4提取物干預后，釀酒酵母細胞內ATP1、CDC19 mRNA的表達水平均顯著降低，ATP含量和MMP以及MRS1 mRNA的表達水平均顯著升高，這表明人參-茯苓藥對1∶4提取物對釀酒酵母細胞的能量代謝具有正向調控作用。

綜上所述，人參-茯苓藥對以1∶4的質量比配伍時對釀酒酵母的抗衰老作用較好，其作用機制可能與正向調控釀酒酵母細胞氧化應激以及能量代謝有關。