李林珍，張宇，陳亮，岑銀芝，涂楊麗，楊小生，李勇軍（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550004；.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥中藥開發(fā)應(yīng)用教育部研究工程中心，貴陽 550004）

海州常山Clerodendrum trichotomum Thunb.屬于馬鞭草科大青屬多年生落葉灌木或小喬木，始載于《圖經(jīng)本草》，且在《本草綱目拾遺》《中國(guó)藥用植物志》《中華本草》《中藥大辭典》等著作中均有記載。海州常山株高1.5～10 m，又名后庭花、矮桐子、臭梧桐、香楸、追骨風(fēng)等。海州常山根、莖、葉、花和果實(shí)均可入藥[1]，廣泛分布于我國(guó)的中南、西南、華東、華北各省，且在日本、朝鮮以及菲律賓北部也有分布。其味苦、微辛，性平[2]，具有祛風(fēng)除濕、解毒殺蟲、平肝降壓的功效，多用于治療風(fēng)濕痹痛、高血壓、哮喘、偏頭痛、瘧疾、痢疾等疾病[3]。海州常山的化學(xué)成分類型主要有萜類、苯丙素類、黃酮類和甾體化合物等，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降壓、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化等生物活性[4-10]。Nagao等[11]研究了海州常山莖和葉的甲醇提取物的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)海州常山莖中抗腫瘤活性成分（acteoside和isoacteoside）的含量比葉高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，海州常山莖85%乙醇提取物的出膏率較高且具有較好的抗腫瘤活性，并且本課題組前期對(duì)該提取物的乙酸乙酯部位進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，分離得到的部分化合物具有良好的抗腫瘤活性[12-14]。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)對(duì)海州常山莖85%乙醇提取物的正丁醇部位進(jìn)行分離純化，并采用MTT法考察分離所得化合物對(duì)4種人源腫瘤細(xì)胞（K562、MCF-7、A549和HepG2）的增殖抑制活性，為進(jìn)一步闡明海州常山莖的抗腫瘤活性物質(zhì)基礎(chǔ)及后續(xù)相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有JEOL-ECS400型核磁共振波譜儀（日本JEOL公司）、QTOF型質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）、N-1300D-WB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀[埃朗科技國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]、HH.CP-01型CO2培養(yǎng)箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）、Mettler EL204型電子天平[梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司]、L530型高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）、通用680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）、TS-100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 主要藥品與試劑

實(shí)驗(yàn)用海州常山莖于2016年11月采自江蘇省南京市，經(jīng)江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所姚淦研究員鑒定為馬鞭草科大青屬植物海州常山C.trichotomum Thunb.，標(biāo)本存放于貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥中藥開發(fā)應(yīng)用教育部研究工程中心實(shí)驗(yàn)室。

提取分離實(shí)驗(yàn)用到的主要耗材有Toyopearl HW-40F型大孔樹脂、ODS反相材料（日本Tosoh公司），薄層色譜（TLC）、柱色譜硅膠以及硅膠薄層層析板（中國(guó)青島海洋化工有限公司），羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare公司），MCI填料（日本Mitsubishi Chemical公司），D101型大孔樹脂（天津市海光化工有限公司）；甲醇、丙酮、二氯甲烷、石油醚等試劑均為分析純。

體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)用到的主要試劑有鹽酸阿霉素（批號(hào)SB8020，純度99%）、青鏈霉素混合液（批號(hào)20210119）、二甲基亞砜（北京索萊寶科技有限公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），MTT試劑（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)9170051），DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司）。

1.3 細(xì)胞株

人白細(xì)胞K562、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人肺癌細(xì)胞A549和人肝癌細(xì)胞HepG2均由貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將4種細(xì)胞分別接種在含10%胎牛血清和1%雙抗（含青霉素和鏈霉素）的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1天換液1次。當(dāng)細(xì)胞增殖到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 海州常山莖化學(xué)成分的提取與分離

稱取干燥的海州常山莖15 kg，鍘片，粉碎，以85%乙醇加熱回流提取3次（每次50 L，提取3 h）。合并提取液，減壓濃縮成浸膏（出膏率15%）。將浸膏用水分散后，用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，濃縮后分別得到石油醚部位50 g、乙酸乙酯部位70 g和正丁醇部位470 g。取正丁醇部位470 g，用D101大孔樹脂吸附，依次用水和30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，分別得到水段、30%乙醇段（116 g）、60%乙醇段（80 g）和95%乙醇段（10 g）洗脫物。取95%乙醇段洗脫物，經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜以及結(jié)晶、重結(jié)晶等方法處理，從中分離得到化合物1（3 mg）、化合物2（400 mg）、化合物3（25 mg）和化合物4（20 mg）。取60%乙醇段洗脫物，經(jīng)MCI柱層析，以甲醇-水[1∶9→7∶3，V/V（下同）]梯度洗脫，得到8個(gè)組分（Fr.1～Fr.8）；將Fr.5組分經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，以甲醇-水（1∶1）洗脫，然后經(jīng)ODS柱色譜[甲醇-水（0∶100→100∶0）]、硅膠柱色譜[乙酸乙酯-甲醇（30∶1→5∶1）]、Sephadex LH-20柱色譜[甲醇-水（1∶1）]及Toyopearl HW-40F（甲醇）柱色譜等分離純化得到化合物5（16 mg）、化合物6（89 mg）、化合物7（15 mg）和化合物8（20 mg）。將Fr.7用ODS柱色譜[甲醇-水（1∶9→1∶1）]、Toyopearl HW-40F（甲醇）柱色譜洗脫得到化合物9（20 mg）。取30%乙醇段洗脫物，上樣MCI柱色譜，以甲醇-水（1∶9→1∶1）進(jìn)行洗脫，通過TLC分析合并后得到6個(gè)組分（Fr.9～Fr.14）。將Fr.11組分經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜[甲醇-水（1∶1）]、硅膠柱色譜[乙酸乙酯-甲醇（30∶1→10∶1）]、ODS柱色譜[甲醇-水（1∶9→7∶3）]、Toyopearl HW-40F（甲醇）柱色譜洗脫，不斷純化后得到化合物10（8 mg）、化合物11（10 mg）、化合物12（6 mg）和化合物13（40 mg）。將Fr.13組分經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜[甲醇-水（1∶1）]分離得到4個(gè)亞組分Fr.13.1～Fr.13.4。取Fr.13.1組分過硅膠柱色譜，以乙酸乙酯-甲醇（30∶1→10∶1）梯度洗脫、Toyopearl HW-40F柱色譜（甲醇）分離純化，得到化合物14（55mg）。

2.3 海州常山莖化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)化合物電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）、核磁共振氫譜（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）、核磁共振碳譜（13C-nuclear magnetic resonance，13C-NMR）等波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)鑒定化合物1～14的結(jié)構(gòu)。

化合物1為橙黃色晶體，ESI-MS m/z為345[M+H]+，分子式為 C20H24O5。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.92（1H，s，6-OH），5.12（1H，m，H-16），4.71（1H，s，11-OH），3.37（1H，dd，J＝15.6、8.8 Hz，H-15a），3.03（1H，m，H-1b），2.86（1H，dd，J＝15.2、7.6 Hz，H-15b），1.64（3H，s，H-20），1.51（3H，d，J＝6.0 Hz，H-17），1.42（3H，s，H-18），1.41（3H，s，H-19）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：30.0（C-1），17.9（C-2），36.5（C-3），36.7（C-4），141.7（C-5），144.1（C-6），183.0（C-7），106.9（C-8），139.7（C-9），42.0（C-10），130.9（C-11），153.6（C-12），110.8（C-13），154.8（C-14），34.6（C-15），83.4（C-16），22.2（C-17），28.2（C-18），22.2（C-19），27.3（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物1為teuvincenone B。

化合物2為橙黃色針晶，ESI-MS m/z為327[M+H]+，分子式為 C20H22O4。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.20（1H，s，H-6），5.10（1H，m，H-16），4.71（1H，s，11-OH），3.39（1H，dd，J＝15.2、8.8 Hz，H-15a），3.20（1H，ddd，J＝13.6、5.6、1.6 Hz，H-1a），2.87（1H，dd，J＝15.2、7.2 Hz，H-15b），1.89（3H，s，H-19），1.86（3H，s，H-18），1.51（3H，d，J＝6.4 Hz，H-17），1.48（3H，s，H-20）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：29.4（C-1），30.5（C-2），140.7（C-3），125.5（C-4），165.5（C-5），118.7（C-6），190.4（C-7），109.5（C-8），136.4（C-9），39.8（C-10），131.1（C-11），153.9（C-12），111.2（C-13），154.4（C-14），34.7（C-15），83.3（C-16），22.3（C-17），20.9（C-18），15.2（C-19），22.2（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物2為鉤大青酮。

化合物3為白色針晶，ESI-MS m/z為361[M+H]+，分子 式 為 C20H24O6。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.90（1H，s，6-OH），5.10（1H，m，H-16），3.90（1H，dd，J＝12.4、3.2 Hz，H-17a），3.80（1H，dd，J＝12.4、6.8 Hz，H-17b），3.30（1H，dd，J＝15.6、9.6 Hz，H-15a），3.03（1H，dd，J＝15.2、7.2 Hz，H-15b），3.03（1H，m，H-1a），1.99（1H，m，H-1b），1.63（3H，s，H-20），1.42（3H，s，H-19），1.41（3H，s，H-18）。13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：28.9（C-1），17.9（C-2），42.1（C-3），36.4（C-4），144.6（C-5），141.7（C-6），183.1（C-7），107.3（C-8），140.3（C-9），36.8（C-10），130.9（C-11），153.4（C-12），110.6（C-13），154.5（C-14），30.0（C-15），86.6（C-16），65.0（C-17），28.1（C-18），27.3（C-19），27.5（C-20）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物3為villosin C。

化合物4為無色晶體，ESI-MS m/z為417[M-H]-，分子式為 C22H26O8。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.65（4H，s，H-2，2＇，6，6＇），4.71（2H，d，J＝4.0 Hz，H-7，7＇），4.26（2H，dd，J＝9.0、7.2 Hz，H-9a，9＇a），3.88（2H，m，H-9b，9＇b），3.84（12H，s，3，3＇，5，5＇-OCH3），3.13（2H，m，H-8，8＇）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：133.3（C-1，1＇），104.6（C-2，2＇，6，6＇），149.5（C-3，3＇，5，5＇），136.3（C-4，4＇），87.8（C-7，7＇），55.7（C-8，8＇），72.9（C-9，9＇），56.9（3，3＇，5，5＇-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物4為丁香脂素。

化合物5為白色粉末，ESI-MS m/z為579[M-H]-，分子式為 C28H36O14。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.67（2H，s，H-2＇，6＇），6.61（2H，s，H-2，6），4.82（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1＇＇），4.72（1H，d，J＝4.0 Hz，H-7），4.67（1H，d，J＝4.4 Hz，H-7＇），4.23（2H，m，H-9a，9＇a），3.86（2H，m，H-9b，9＇b），3.81（6H，s，3，5-OCH3），3.79（6H，s，3＇，5＇-OCH3），3.73（1H，dd，J＝12.0、2.4 Hz，H-6＇＇a），3.61（1H，dd，J＝12.0、5.2 Hz，H-6＇＇b），3.36～3.44（3H，m，H-2＇＇，3＇＇，4＇＇），3.15（1H，m，H-5＇＇），3.08（2H，m，H-8，8＇）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：133.2（C-1），104.9（C-2，6），149.5（C-3，5），136.3（C-4），87.3（C-7），55.9（C-8），73.0（C-9），56.9（3，5-OCH3），139.7（C-1＇），104.5（C-2＇，6＇），154.5（C-3＇，5＇），135.6（C-4＇），87.7（C-7＇），55.6（C-8＇），73.0（C-9＇），57.2（3＇，5＇-OCH3），105.4（C-1＇＇），75.8（C-2＇＇），78.5（C-3＇＇），71.4（C-4＇＇），77.9（C-5＇＇），62.7（C-6＇＇）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物5為丁香脂素-4＇-O-β-葡萄糖。

化合物6呈白色膠狀，ESI-MS m/z為657[M-H]-，分子式為 C32H50O14。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.34（1H，s，H-14），4.36（1H，d，J＝7.6 Hz，H-1″），4.31（1H，d，J＝7.6 Hz，H-1′），3.17～3.88（m，糖質(zhì)子H，H-1b，3，15，16），2.73（1H，m，H-7），2.01（1H，m，H-2a），1.80（1H，m，H-2b），1.75（1H，m，H-6a），1.53（1H，m，H-6b），1.27（3H，s，H-20），1.16（1H，m，H-5），1.10（3H，d，J＝6.8 Hz，H-17），1.07（3H，s，H-18），0.91（3H，s，H-19）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：36.0（C-1），28.1（C-2），90.9（C-3），40.9（C-4），54.8（C-5），20.1（C-6），34.1（C-7），135.3（C-8），134.6（C-9），40.3（C-10），149.3（C-11），143.2（C-12），136.5（C-13），118.3（C-14），35.0（C-15），69.3（C-16），18.5（C-17），17.6（C-18），29.2（C-19），20.0（C-20），107.8（C-1′），75.7（C-2′），79.1（C-3′），71.6（C-4′），78.0（C-5′），63.1（C-6′），107.0（C-1″），75.8（C-2″），78.3（C-3″），71.7（C-4″），77.7（C-5″），62.8（C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物6為3，12-O-β-D-二吡喃葡萄糖基-11，16-二羥基松香醇-8，11，13-三烯。

化合物7為白色粉末，ESI-MS m/z為787[M-H]-，分子式為 C38H44O18。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.63（1H，d，J＝16.0 Hz，H-7＇＇＇），7.13（1H，s，H-3），7.10（1H，s，H-2＇＇＇），6.98（1H，s，H-2″″），6.86（1H，d，J＝7.6 Hz，H-6″″），6.81（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5″″），6.64（1H，d，J=8.4 Hz，H-6），6.51（1H，m，H-5），6.29（1H，d，J＝16.4 Hz，H-8＇＇＇），5.60（1H，d，J＝6.8 Hz，H-7″″），5.52（1H，d，J＝1.2 Hz，H-1″），3.93（3H，s，2-OCH3），3.85（3H，s，3＇＇＇-OCH3），3.84（3H，s，3″″-OCH3）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：142.9（C-1），149.4（C-2），103.4（C-3），152.7（C-4），109.6（C-5），116.2（C-6），56.5（2-OCH3），102.1（C-1′），79.0（C-2′），78.5（C-3′），71.8（C-4′），78.2（C-5′），62.7（C-6′），110.6（C-1″），78.8（C-2″），79.3（C-3″），75.5（C-4″），67.7（C-5″），129.8（C-1＇＇＇），113.8（C-2＇＇＇），146.0（C-3＇＇＇），152.2（C-4＇＇＇），131.1（C-5＇＇＇），119.4（C-6＇＇＇），147.2（C-7＇＇＇），115.6（C-8＇＇＇），168.8（C-9＇＇＇），56.9（3＇＇＇-OCH3），134.2（C-1″″），110.8（C-2″″），149.3（C-3″″），147.9（C-4″″），116.4（C-5″″），120.0（C-6″″），90.0（C-7″″），54.8（C-8″″），64.7（C-9″″），56.6（3″″-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物7為五葉山小橘苷C。

化合物8為淡黃色無定形粉末，ESI-MS m/z為651[M-H]-，分 子 式 為 C31H40O15。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.63（1H，d，J＝16.0 Hz，H-7＇＇＇），7.15（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2＇＇＇），7.02（1H，dd，J＝8.4、2.0 Hz，H-6＇＇＇），6.78（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5＇＇＇），6.69（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2），6.66（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.61（1H，dd，J＝8.0、2.0 Hz，H-6），6.38（1H，d，J＝16.0 Hz，H-8＇＇＇），5.17（1H，d，J＝1.6 Hz，H-1＇＇），4.33（1H，d，J＝8.0 Hz，H-1＇），3.89（3H，s，3＇＇＇-OCH3），3.75（3H，s，4-OCH3），2.80（2H，t，J＝7.6 Hz，H-7），1.25（3H，d，J＝6.0 Hz，H-6＇＇）。13CNMR（100 MHz，CD3OD）δ：133.0（C-1），113.0（C-2），147.7（C-3），147.5（C-4），117.2（C-5），121.3（C-6），36.7（C-7），72.2（C-8），56.6（4-OCH3），104.4（C-1＇），76.3（C-2＇），81.7（C-3＇），70.5（C-4＇），76.2（C-5＇），62.5（C-6＇），103.1（C-1″），72.3（C-2″），72.5（C-3″），73.9（C-4″），70.7（C-5″），18.6（C-6″），133.0（C-1＇＇＇），111.8（C-2＇＇＇），147.7（C-3＇＇＇），149.7（C-4＇＇＇），116.8（C-5＇＇＇），124.7（C-6＇＇＇），148.2（C-7＇＇＇），114.9（C-8＇＇＇），168.5（C-9＇＇＇），56.5（3＇＇＇-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物8為角胡麻苷。

化合物9為黃色油狀，ESI-MS m/z為651[M-H]-，分子式為 C31H40O15。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.60（1H，d，J＝15.6 Hz，H-7＇＇＇），7.10（1H，s，H-2＇＇＇），6.98（1H，d，J＝8.0 Hz，H-6＇＇＇），6.77（1H，d，J=8.0 Hz，H-5＇＇＇），6.68（1H，s，H-2），6.63（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5），6.58（1H，d，J＝8.4 Hz，H-6），6.36（1H，d，J＝16.0 Hz，H-8＇＇＇），5.20（1H，s，H-1″），4.50（1H，d，J＝11.2 Hz，H-6′a），4.38（1H，dd，J＝11.6、6.0 Hz，H-6′b），4.33（1H，d，J＝7.6 Hz，H-1′），4.03（1H，m，H-5″），3.92（1H，m，H-2″），3.82（3H，s，3＇＇＇-OCH3），3.75（2H，m，H-7），3.72（3H，s，4-OCH3），3.70（1H，overlapped，H-3″），3.68（1H，overlapped，H-5′），2.78（2H，t，J＝7.6 Hz，H-8），1.27（3H，d，J＝6.0 Hz，H-6″）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：132.6（C-1），112.7（C-2），147.5（C-3），147.3（C-4），117.1（C-5），121.2（C-6），36.8（C-7），72.3（C-8），104.4（C-1′），75.8（C-2′），83.9（C-3′），70.5（C-4′），75.4（C-5′），64.7（C-6′），102.8（C-1″），72.4（C-2″），72.4（C-3″），74.0（C-4″），70.1（C-5″），18.0（C-6″），127.1（C-1＇＇＇），111.4（C-2＇＇＇），149.6（C-3＇＇＇），151.7（C-4＇＇＇），116.7（C-5＇＇＇），124.6（C-6＇＇＇），147.4（C-7＇＇＇），114.8（C-8＇＇＇），169.3（C-9＇＇＇），56.4（4，3＇＇＇-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物9為異地黃苷。

化合物10為白色粉末，ESI-MS m/z為461[M-H]-，分子式為C20H30O12。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.03（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3，5），6.64（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2，6），4.57（1H，d，J＝7.6 Hz，H-1＇），4.40（1H，d，J＝7.6 Hz，H-1＇＇），3.17～4.02（m，糖質(zhì)子 H，H-8），2.77（2H，m，H-7）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：130.9（C-1），131.2（C-2，6），116.2（C-3，5），156.9（C-4），36.5（C-7），72.3（C-8），103.1（C-1＇），82.9（C-2＇），78.3（C-3＇），71.5（C-4＇），77.8（C-5＇），62.8（C-6＇），104.9（C-1＇＇），76.1（C-2＇＇），78.0（C-3＇＇），71.5（C-4＇＇），77.9（C-5＇＇），62.8（C-6＇＇）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物10為2-（4-hydroxyphenyl）ethanol-O-β-D-glucopyranosyl-（1→2）-O-β-D-glucopyranoside。

化合物11為淡黃色無定形固體，ESI-MS m/z為493[M+HCOO]-，分子式為 C19H28O12。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.79（1H，d，J＝2.8 Hz，H-2），6.72（1H，d，J＝8.8 Hz，H-5），6.58（1H，dd，J＝8.8、2.8 Hz，H-6），5.49（1H，d，J＝1.6 Hz，H-1″），4.83（1H，d，J＝7.6 Hz，H-1′），4.13（1H，d，J＝9.6 Hz，H-4″b），3.99（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2″），3.85（3H，s，3-OCH3），3.83（3H，s，4-OCH3），3.37～3.93（m，糖質(zhì)子H），3.62（2H，s，H-5″）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：152.9（C-1），103.7（C-2），149.4（C-3），143.0（C-4），116.2（C-5），109.9（C-6），56.9（4-OCH3），56.5（3-OCH3），102.5（C-1′），78.9（C-2′），78.7（C-3′），71.7（C-4′），78.2（C-5′），62.7（C-6′），110.9（C-1″），78.1（C-2″），80.9（C-3″），75.6（C-4″），66.2（C-5″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物11為3，4-二甲氧基苯基-1-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-葡萄糖苷。

化合物12為淡黃色糖漿狀，ESI-MS m/z為331[MH]-，分子式為C14H20O9。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.13（2H，s，H-3，5），4.67（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1＇），3.79（6H，s，2，6-OCH3），3.73（1H，m，H-2＇），3.63（1H，m，H-3＇），3.63（1H，m，H-3＇），3.33～3.43（4H，m，H-4＇，5＇，6＇）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：129.7（C-1），154.9（C-2，6），94.6（C-3，5），156.2（C-4），56.9（2，6-OCH3），106.3（C-1＇），75.8（C-2＇），77.9（C-3＇），71.4（C-4＇），78.4（C-5＇），62.7（C-6＇）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物12為2，6-二甲氧基-4-羥苯基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物13為白色粉末，ESI-MS m/z為266[M-H]-，分子式為 C10H13N5O4。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：8.33（1H，s，H-2），8.15（1H，s，H-8），7.24（2H，s，-NH2），5.89（1H，d，J＝6.0 Hz，H-1＇），5.33（2H，m，2＇，5＇-OH），5.09（1H，d，J＝4.0 Hz，3＇-OH），4.62（1H，dd，J＝10.8、5.2 Hz，H-2＇），4.17（1H，m，H-3＇），3.98（1H，dd，J＝6.8、3.6 Hz，H-4＇），3.69（1H，dt，J＝12.0、3.6 Hz，H-5＇a），3.58（1H，m，H-5＇b）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：152.3（C-2），149.1（C-4），119.3（C-5），156.1（C-6），139.8（C-8），87.9（C-1＇），73.4（C-2＇），70.5（C-3＇），85.8（C-4＇），61.6（C-5＇）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物13為腺苷。

化合物14為白色固體，ESI-MS m/z為487[M-H]-，分子式為C21H28O13。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.55（1H，d，J＝16.0 Hz，H-7），7.02/7.01（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.90/6.91（1H，dd，J＝8.0、2.4 Hz，H-6），6.73（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.24/6.23（1H，d，J＝16.0 Hz，H-8），5.08（1H，d，J＝2.4 Hz，H-1″），4.52/4.92（各 0.5H，d，J=8.0 Hz，H-1′），3.23～4.03（m，糖質(zhì)子 H，H-2，3，5，6），1.05（3H，d，J＝6.4 Hz，H-6″）。13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：127.7（C-1），115.3（C-2），146.9（C-3），149.8/149.9（C-4），116.6（C-5），123.4（C-6），148.0/148.1（C-7），114.7/114.9（C-8），168.5/168.4（C-9），94.1/98.2（C-1′），76.1/77.4（C-2′），79.3/81.8（C-3′），70.7/70.8（C-4′），74.7（C-5′），62.4/62.5（C-6′），103.1/103.2（C-1″），72.1/72.4（C-2″），71.3（C-3″），73.8（C-4″），70.5（C-5″），18.6（C-6″）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[29]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物14為肉蓯蓉苷F。

2.4 海州常山莖化學(xué)成分的體外抗腫瘤活性研究

采用MTT法檢測(cè)海州常山莖中分離所得化合物對(duì)4種人源腫瘤細(xì)胞（K562、MCF-7、A549和HepG2）的增殖抑制作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組、陽性對(duì)照組（以阿霉素為陽性藥物）和化合物1～14給藥組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各細(xì)胞株，用培養(yǎng)基培養(yǎng)成密度為4×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，按100 μL/孔加入96孔板中，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，然后加入相應(yīng)藥物[化合物1～14給藥組的濃度均為0（空白）、2、4、8、16、32、64 μmol/L，陽性對(duì)照組阿霉素的濃度為0（空白）、0.25、0.5、1、2、4、8 μmol/L，濃度均依據(jù)細(xì)胞增殖抑制預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置]，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，每孔加20 μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄上層培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度（OD），按下式計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（OD 值空白組-OD 值給藥組）/OD 值空白組×100%。采用Graphpad Prism 5.0軟件計(jì)算化合物1～14對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half inhibit concentration，IC50）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果見表1。

表1 化合物 11～ 33對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的IC50測(cè)定結(jié)果（±s，n=3，μmol/L）

表1 化合物 11～ 33對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的IC50測(cè)定結(jié)果（±s，n=3，μmol/L）

a：化合物4～14未顯示出細(xì)胞增殖抑制活性，故數(shù)據(jù)未展示

化合物a H e p G 2細(xì)胞K 5 6 2細(xì)胞M C F-7細(xì)胞A 5 4 9細(xì)胞1 2 3阿霉素2 9.7 4±2.0 7 1 2.5 0±0.4 5 3 1.3 5±1.2 2 0.2 4±0.0 0＞1 0 0.0 0＞1 0 0.0 0 2 8.4 1±3.1 5 5.5 6±0.1 9 4 3.1 8±3.2 3 2 5.0 0±0.4 4＞1 0 0.0 0 0.4 5±0.0 2＞1 0 0.0 0 2 2.3 4±1.3 7＞1 0 0.0 0 4.3 7±0.2 8

由表1所示，化合物1～3均表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性，其中化合物2抑制MCF-7、A549和HepG2細(xì)胞增殖的活性最強(qiáng)，IC50分別為25.00、22.34、12.50 μmol/L；僅有化合物3對(duì)K562細(xì)胞的增殖具有抑制活性，IC50為28.41 μmol/L；化合物1對(duì)MCF-7和HepG2細(xì)胞有一定的增殖抑制活性，IC50分別為43.18、29.74 μmol/L；其余化合物（包括苯丙素類及所有苷類）對(duì)4種測(cè)試細(xì)胞株均未顯示出增殖抑制活性（IC50＞100.00 μmol/L）。

3 討論

本研究采用多種色譜技術(shù)對(duì)海州常山莖85%乙醇提取物的正丁醇部位進(jìn)行分離純化，并綜合運(yùn)用現(xiàn)代波譜技術(shù)對(duì)所得化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到了14個(gè)化合物。在所得的14個(gè)化合物中，除了化合物1～4為苷元外，其他化合物均為苷類，具體包括4個(gè)二萜類（其中1個(gè)為二萜苷）——teuvincenone B（1）、鉤大青酮（2）、villosin C（3）、3，12-O-β-D-二吡喃葡萄糖基-11，16-二羥基松香醇-8，11，13-三烯（6），4個(gè)苯丙素類（其中3個(gè)為苯丙素苷）——丁香脂素（4）、丁香脂素-4＇-O-β-葡萄糖（5）、五葉山小橘苷C（7）和肉蓯蓉苷F（14），3個(gè)苯乙醇苷類——角胡麻苷（8）、異地黃苷（9）和2-（4-hydroxyphenyl）ethanol-O-β -D-glucopyranosyl-（1→2）-O-β -D-glucopyranoside（10），3個(gè)酚苷及其他苷類——3，4-二甲氧基苯基-1-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-葡萄糖苷（11）、2，6-二甲氧基-4-羥苯基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（12）和腺苷（13）。其中，化合物10～13為首次從大青屬植物中分離得到，化合物4、5、14為首次從海州常山中分離得到。

通過MTT法檢測(cè)14個(gè)化合物對(duì)4種人源腫瘤細(xì)胞（K562、MCF-7、A549和HepG2）的增殖抑制活性發(fā)現(xiàn)，二萜類化合物（化合物1～3）對(duì)4種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出了一定的增殖抑制活性，苯丙素類化合物及所有苷類化合物均無此活性（IC50＞100.00 μmol/L，視為無活性[30]）。化合物1～3均為松香烷型二萜類化合物，說明其可能是海州常山抗腫瘤藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。結(jié)合本課題組前期研究成果[12-14]并進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)：抗腫瘤活性較好的化合物均為17（15→16）重排型松香烷二萜，即具有苯并二氫呋喃結(jié)構(gòu)片段（15、16位沒有雙鍵）；部分化合物雖然沒有發(fā)生17（15→16）重排，但是其C-17位的羥基與C-12位的羥基有環(huán)合成呋喃環(huán)的可能，也表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性；部分化合物雖然發(fā)生了17（15→16）重排，但是其15、16位有雙鍵存在，使其沒有表現(xiàn)出潛在的抗腫瘤活性。從以上分析可以推斷，松香烷型二萜類化合物中苯并二氫呋喃結(jié)構(gòu)片段（或該片段開環(huán)）可能是該類化合物抗腫瘤藥效的必需基團(tuán)。

綜上所述，本研究從海州常山莖中分離鑒定了14個(gè)化合物，其中4個(gè)化合物為首次從該屬中分離得到，3個(gè)化合物為首次從該植物中分離得到。體外抗腫瘤活性研究結(jié)果表明，松香烷型二萜類化合物對(duì)4種腫瘤細(xì)胞株的抑制活性較好。本研究在一定程度上豐富了海州常山莖的化學(xué)成分，并為其抗腫瘤活性的進(jìn)一步研究開發(fā)提供了參考依據(jù)。