鄒楠婷，吳 招，顧茜蘭，應 賽，楊海浩，祁 燕，李小絲，彭江云，萬春平

（云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500）

蠲痹顆粒是由云南省當代扶陽學派杰出代表、著名中醫(yī)學家吳生元教授研制的抗類風濕關節(jié)炎的經驗藥方[1]，1995年獲院內制劑批件（滇ZJGF/1995-25），2008年獲再注冊批件（滇藥制字〈Z〉20082554A），2012年8月獲國家發(fā)明專利（專利號：201010185717.X）。處方由附片、川芎、桂枝、五加皮等藥味配伍而成，具有溫陽通絡、祛風除濕、散寒、消腫止痛的功效，主治風寒濕痹證。

前期臨床觀察和實驗研究證實：蠲痹顆粒對活動期類風濕關節(jié)炎有顯著臨床療效，能減輕病人的臨床癥狀，下調C-反應蛋白（CRP）和血沉（ESR）等有關治療指標。此外，蠲痹顆粒對大鼠佐劑性關節(jié)炎（AA）和小鼠膠原關節(jié)炎（CIA）有顯著的抗炎和鎮(zhèn)痛作用[2-4]，提示蠲痹顆粒防治類風濕關節(jié)炎與其抑制T細胞介導的免疫反應密切相關。但該藥的確切免疫調節(jié)機制尚未明確，因此有必要進一步研究其治療類風濕關節(jié)炎的免疫學機制。

最新研究顯示[5-7]，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路與RA時T淋巴細胞激活和細胞因子分泌具有密切聯(lián)系，已成為RA藥物治療的重要作用靶點。該通路主要由ERK、p38和JNK激酶組成的。本研究通過建立體外細胞分化模型，探討蠲痹顆粒醇提物（JBKL）對T、B淋巴細胞體外增殖的影響，及其調控MAPK信號轉導干預T細胞活化效應機制的研究，為扶陽法治療風寒濕痹證類風濕關節(jié)炎提供理論依據和科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 BALB/c小鼠，雌性，78周齡，體質量（18±1）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2019-0010；實驗動物在 SPF級動物房飼養(yǎng)1周后使用。環(huán)境溫度濕度分別為（22±1）℃和（55±5）%，12 h晝夜循環(huán)。動物自主攝取滅菌或消毒后的飼料和水。所有實驗均嚴格按照實驗動物相關條例執(zhí)行。

蠲痹顆粒浸膏醇提物制備：稱取289.4 g蠲痹顆粒浸膏，用蒸餾水加熱溶解完全，冷卻后加入乙醇混勻，直至乙醇含量為80%，放置12 h后離心，取上清液過濾，并減壓回收乙醇，得蠲痹顆粒藥材浸膏，將浸膏置于真空干燥箱真空干燥約2 d，得蠲痹顆粒固體浸膏3.658 g，折合原藥材：1 g醇提物相當于79.11 g蠲痹顆粒浸膏。

RPMI-1640培養(yǎng)基購自 GibcoBRL公司（life Technologies，Grandisland，NY，USA）；胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）和 MTT均購買于 Hyclone公司（Logan，Utah，USA）；刀豆蛋白 A（Con A）和細菌脂多糖（LPS）均購自美國 SIGMA 公司（St.Louis，MO，USA）；IL-10、IL-6、IL-17A 和 IFN-γ細胞因子 ELISA 檢測試劑盒和Anti-CD3抗體均購自BD PharMingen公司（San Diego，CA，USA）；抗 phospho-ERK1/2，phosphop38購自Cell Signaling Technology；其它試劑為國產分析純。

Megafuge l1.0R離心機（德國ThermoScientific Heraeus）；二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo-Fisher；Epoch連續(xù)波長酶標儀來自美國Bio-Tek公司；DM2500正置顯微鏡（德國萊卡儀器有限公司）；伯樂小型垂直電泳套裝及通用電泳儀164-5070（美國Bio-Rad）、ODYSSEYCLx激光成像系統(tǒng)（美國 LICOR公司）。

1.2 脾淋巴細胞和純化CD4+T細胞制備 脫脊椎處死小鼠，摘取脾臟，研磨獲取脾細胞懸液，用紅細胞裂解液裂解紅細胞，用PBS洗2～3次，離心濾過后加入含2%FBS的RPMI-1640混勻得到脾淋巴細胞，并將細胞調至所需濃度。采用免疫磁珠分離法（陰性選擇），加入小鼠抗小鼠I-Ad/b、同山羊抗小鼠抗體IgG結合磁珠，除去與磁珠結合I-A+抗原遞呈細胞和Ig+的B細胞，獲得純化的T細胞。CD4+T細胞的純化在上述純化條件下加入抗CD8抗體標記磁珠，除去CD8+T細胞，得到純化CD4+T細胞。以上操作均需無菌處理。

1.3 JBKL對小鼠脾淋巴細胞增殖功能的影響 以5×105/孔的BALB/c小鼠脾淋巴細胞數接種于96孔板，藥物組加入低、中、高劑量（3、10、30 μg/m L）的JBKL，再加入 5 μg/mL ConA 或 LPS（10 μg/mL）刺激T、B淋巴細胞增殖。另外，設不加刺激劑和藥物的空白組，以及只加刺激劑的對照組，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)第44 h后每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，再孵育4 h結束后，吸除上清，每孔加入100μL DMSO，低速振蕩充分溶解反應后的MTT結晶，用酶標儀在570 nm波長處檢測各孔的吸光度。對于Anti-CD3 mAb誘導T細胞增殖，方法如下：5μg/m L Anti-CD3 mAb稀釋溶液（碳酸鹽緩沖液稀釋，pH 9.6）包被96孔培養(yǎng)板，誘導T淋巴細胞增殖，于37℃培養(yǎng)箱中放置2 h后，丟棄液體，用PBS洗1次，加入脾淋巴細胞（5×105/孔）和不同濃度JBKL，之后的方法同上均用MTT法檢測。

1.4 MTT檢測JBKL對小鼠脾淋巴細胞細胞毒性檢測往96孔板內加入4×105/孔的正常小鼠脾淋巴細胞，同時加入 JBKL（0、3、10、30 μg/m L）。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，每孔加入20μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)孵育4 h。培養(yǎng)結束時，棄去原液，每孔加入100 μL DMSO，充分溶解結晶，用酶標儀于570 nm處測定吸光度。

1.5 JBKL對Anti-CD3 mAb誘導T細胞細胞因子產生的影響 純化的CD4+T淋巴細胞（4×105/孔）接種于包被著anti-CD3 mAb（5μg/mL）的24孔培養(yǎng)板中，同時加入不同濃度的 JBKL（0、3、10、30 μg/mL）。對照組則不含anti-CD3 mAb。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36 h后收集細胞上清液，離心（5 000 r/min，4℃，5 min），根據相應 IL-10、IL-6、IFN-γ 和 IL-17A的ELISA試劑盒說明書檢測細胞培養(yǎng)液中各細胞因子的含量。

1.6 CD4+T細胞MAPK信號通路的相關蛋白表達水平 PBS稀釋的anti-CD3 mAb（5μg/mL）加入24孔培養(yǎng)板，于4℃包被過夜，用PBS洗2次。加入CD4+T淋巴細胞（5×106/孔）、anti-CD28 mAb（2 μg/m L）和不同濃度的蠲痹顆粒提取物（0、3、10、30、100 μg/m L），刺激30 min，另設無刺激對照組。收集細胞于Eppendorf管中，每管分別加入等量的裂解溶液（RIPA、蛋白酶抑制劑和磷酸化蛋白酶抑制劑），4℃裂解 30 min，離心（4 ℃、10 min、12 000 r/min），吸取上清獲得細胞總蛋白?？偟鞍装凑誃CA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定后再把濃度調成一致，取相同體積樣品加入適量SDS，100℃水浴煮沸10 min變性總蛋白。將總蛋白進行垂直電泳分離、轉膜、封閉、洗膜，分別加入抗體p-ERK和p-P38，4℃孵育6 h，洗膜，加入相應二抗室溫避光孵育1 h，棄去二抗洗膜后于ODYSSEYCLx雙色紅外激光成像儀上掃膜，用ImageStudio軟件采集分析蛋白條帶圖像。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的顯色為內參。

1.7 統(tǒng)計學分析 用SPSS 17.0軟件對數據結果進行分析，所有數據都以均數±標準差（±s）表示，組間比較使用t檢驗和單因素方差分析處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 JBKL對小鼠脾淋巴細胞活性和細胞毒性的影響 圖1A結果顯示，正常小鼠T淋巴細胞在絲裂原Con A誘導下顯著增殖；與溶媒對照組比較，JBKL 30μg/mL藥物干預后，能夠顯著抑制Con A誘導小鼠T淋巴細胞增殖能力。圖1B結果表明，與溶媒對照組相比，JBKL 30μg/mL顯著抑制Anti-CD3 mAb誘導正常小鼠脾臟T淋巴細胞活化。圖1C結果表明，LPS顯著刺激正常小鼠B淋巴細胞發(fā)生增殖，與溶媒對照組相比，JBKL 30μg/m L藥物干預顯著抑制正常小鼠B淋巴細胞的增殖活性。圖1D結果表明，與溶媒對照組相比，JBKL在濃度（3～30）μg/m L對正常脾淋巴細胞活度無明顯的影響，提示 JBKL在（3～30）μg/mL對正常小鼠淋巴細胞無明顯細胞毒性作用。上述結果表明，JBKL體外具有顯著的免疫抑制活性。

圖1 不同濃度蠲痹顆粒醇提物（JBKL）對 ConA（A）、Anti-CD3 m Ab（B）和 LPS（C）誘導的正常小鼠脾淋巴細胞增殖情況影響和細胞毒性（D）（±s，n=3）

2.2 JBKL對TCR信號誘導的CD4+T淋巴細胞細胞因子產生的影響 為進一步探究JBKL對細胞因子產生的影響，本研究應用ELISA法檢測JBKL對Anti-CD3 mAb誘導CD4+T淋巴細胞細胞因子產生的影響。ELISA檢測結果顯示，CD4+T淋巴細胞經 Anti-CD3 mAb誘導后分泌更多的 IFN-γ、IL-17A、Treg細胞因子（IL-10）和促炎細胞因子（IL-6）。給予不同濃度的JBKL作用后，產生的IFN-γ和IL-17A顯著低于溶媒對照組。同時大幅增加Treg負調控細胞因子（IL-10）的分泌量，降低IL-6產生水平（表1）。

表1 蠲痹顆粒醇提物（JBKL）對Anti-CD3 m Ab誘導CD4+T細胞細胞因子的影響（±s，n=3，pg/mL）

表1 蠲痹顆粒醇提物（JBKL）對Anti-CD3 m Ab誘導CD4+T細胞細胞因子的影響（±s，n=3，pg/mL）

注：與溶媒對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別劑量/（μg·mL-1）IFN-γIL-17A IL-6 IL-10無刺激劑組 99.18±45.43 100.29±45.43 18.39±0.93 11.37±3.63溶媒對照組 2 590.50±30.59 623.45±17.17 154.69±30.74 361.34±27.66 JBKL 低濃度組 3 2 289.68±331.41 474.07±29.06* 146.52±14.43 354.43±34.43 JBKL 中濃度組 10 2 032.73±256.24 471.22±102.78 108.42±16.37 401.56±61.56 JBKL 高濃度組 30 2 129.47±16.66* 324.26±35.63** 89.18±23.54* 571.75±81.75*

2.3 JBKL干預后，CD4+T淋巴細胞磷酸化p38和ERK蛋白水平變化 圖2結果顯示，30μg/mL和100μg/m L JBKL作用后磷酸化ERK表達量較溶媒對照組減少。而在濃度100μg/mL，JBKL顯著抑制p38磷酸化表達水平，提示JBKL可能通過作用于ERK-MAPK和p38-MAPK信號通路來發(fā)揮抑制T細胞活化的作用。

圖2 蠲痹顆粒醇提物（JBKL）對Anti-CD3 m Ab誘導

3 討論

T細胞介導的免疫反應損傷是導致RA等系統(tǒng)性自身免疫病發(fā)病的主要原因之一[1，8]。臨床上大多數RA患者的病程較長，主要以關節(jié)的免疫損傷為特征，并且在病原生物的持續(xù)感染下，病變可從小關節(jié)波及到大關節(jié)，最終引起嚴重的炎癥損害[8]。但該病病因和發(fā)生機制目前尚未闡明。T淋巴細胞作為適應性免疫應答的主要效應細胞，其不同亞群發(fā)揮著不同的免疫效應，主要誘導分泌各類細胞因子或效應分子，從而參與調節(jié)體液免疫應答、炎癥反應和自身免疫病等過程。因此，類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生與針對自身抗原的T淋巴細胞異?；罨鲋秤嘘P[9-10]。

前期研究顯示，蠲痹顆粒能有效抑制DNFB引發(fā)的遲發(fā)型超敏反應（DTH）。DNFB能夠刺激T細胞活化，釋放大量的細胞因子和炎癥介質，造成炎性損傷?；诖耍覀冞M一步研究發(fā)現(xiàn)蠲痹顆粒能顯著改善膠原誘導性小鼠關節(jié)炎，維持Th17/Treg細胞平衡，減少致炎因子IL-17A分泌量，促進免疫抑制因子IL-10的釋放，動物模型實驗證明給予蠲痹顆粒后能阻礙T細胞異?；罨l(fā)生的免疫應答，所以蠲痹顆粒治療RA的免疫調節(jié)機制是值得探索的。因此，本實驗采用ConA、Anti-CD3 mAb和LPS誘導脾臟T、B淋巴細胞增殖的體外模型，并加入JBKL；MTT結果顯示，T、B細胞增殖活性在JBKL干預后減弱。且細胞毒性實驗結果表明JBKL對正常脾淋巴細胞無明顯細胞毒性作用，排除了JBKL抑制淋巴細胞增殖作用依賴于細胞毒性的可能，與前期體內結果一致，進而證實蠲痹顆粒具有顯著免疫抑制活性，這可能是蠲痹顆粒治療RA主要的依據之一[1，4，11]。

白細胞分化抗原3（CD3）是一類分布于細胞膜表面的蛋白質，CD3和 TCR肽鏈（α、β、γ）以非共價鍵相互連接，形成CD3-TCR復合體，在抗原刺激下使T細胞活化[12]。大量研究證實Anti-CD3 mAb可模擬抗原刺激直接作用于CD3，介導T細胞快速活化增殖，促進Th1、Th17、Treg等T細胞亞群分泌細胞因子和炎癥介質釋放[13]。結果表明，JBKL 30μg/mL顯著降低了IFN-γ、IL-17A和IL-6的水平，顯著提高了負調控因子IL-10的水平。IFN-γ除了激活巨噬細胞發(fā)揮抗腫瘤效應和促進炎癥反應外，還有免疫調節(jié)作用[14]。由Th17細胞分泌的IL-17A有較強的促炎癥作用，在RA的啟動與進展中發(fā)揮關鍵作用[15-17]。另外，Th17細胞在IL-6刺激下會發(fā)生增殖和分化[18]，IL-6還可以活化B淋巴細胞，發(fā)揮以抗體為主導的特異性體液免疫效應。由Treg細胞分泌的IL-10是維持免疫耐受的關鍵因子，以防止自生免疫性疾病發(fā)生。課題組前期在膠原誘導性關節(jié)炎模型中發(fā)現(xiàn)JBKL能調控Th17細胞與Treg細胞平衡，下調促炎因子IL-17A表達[3]。本研究在體外細胞因子表達角度進一步證實JBKL能調控Th17/Treg細胞平衡，這可能是蠲痹顆粒治療類風濕關節(jié)炎的免疫學機制之一。

在RA發(fā)病時，MAPK信號通路是參與TCR信號轉導的重要途徑。T細胞激活信號通過多種途徑轉導入細胞核，其中MAPK信號通路是參與TCR信號轉導的重要途徑。MAPK的3種主要成分：ERK、JNK以及P38均參與T細胞激活。通過激活MAPK信號通路釋放多種核轉錄因子，參與T細胞免疫應答過程[19]。基于此，我們進一步應用Western blot檢測JBKL對MAPK信號通路中相關蛋白的影響。結果表明，JBKL給藥后磷酸化ERK和p38表達降低，提示抑制MAPK信號通路，可能是蠲痹顆粒免疫抑制作用及治療類風濕關節(jié)炎的分子機制之一。

綜上所述，本實驗結果證實了JBKL通過調控MAPK信號轉導通路中p38和ERK蛋白磷酸化，從而抑制T細胞活化增殖和促炎因子分泌。本研究可為深入探究中藥復方蠲痹顆粒治療類風濕關節(jié)炎的作用機制提供科學基礎。