沈水杰，陳 璇，顧小俠，姜水菊，姚登福

（1.南通市中醫(yī)院，江蘇 南通 226000；2.蘇州科技城醫(yī)院，江蘇 蘇州 215153；3.南通市第三人民醫(yī)院，江蘇 南通 226000；4.南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001）

與I型細(xì)胞程序性死亡凋亡不同，自噬被認(rèn)為是屬于II型細(xì)胞程序性死亡的細(xì)胞死亡機(jī)制[1]。在生理?xiàng)l件下，自噬通過(guò)清除受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)聚集體和細(xì)胞內(nèi)病原體等途徑，對(duì)應(yīng)激條件下細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持起關(guān)鍵作用。在癌癥的病理狀態(tài)下，誘導(dǎo)自噬激活細(xì)胞死亡（稱為自噬樣細(xì)胞死亡）可以有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的清除[2-4]。有相關(guān)研究表明，在癌癥治療藥物的開(kāi)發(fā)中，藥物對(duì)細(xì)胞自噬作用的影響是一個(gè)很有價(jià)值的研究方向[5]。

中醫(yī)藥的使用已經(jīng)延續(xù)了幾個(gè)世紀(jì)，在預(yù)防和消除腫瘤細(xì)胞方面，中藥已被證實(shí)能夠發(fā)揮重要作用[6]。臨床治療、動(dòng)物及細(xì)胞試驗(yàn)的研究表明：中藥具有抑制腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和血管生成的作用[7-8]。養(yǎng)肺控瘤方（yangfeikongliu formula，YKF），以生黃芪、生曬參補(bǔ)益肺脾，益氣固本，北沙參養(yǎng)陰潤(rùn)肺，薏苡仁、仙鶴草健脾補(bǔ)虛，白花蛇舌草清熱解毒散瘤，全方起益氣養(yǎng)陰，消瘤散結(jié)之效[9]。已有研究表明：YKF聯(lián)合順鉑可抑制荷瘤小鼠癌細(xì)胞中Lewis肺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[10]。此外，YKF能抑制腫瘤生長(zhǎng)，與順鉑協(xié)同降低Lewis晚期肺癌小鼠模型血清IL-2、TNF-α的表達(dá)[11]。但目前對(duì)于YKF影響肺癌細(xì)胞自噬作用的相關(guān)研究仍較少。

據(jù)報(bào)道，自噬相關(guān)蛋白，如Beclin-1、LC3和p62等，在癌組織中的表達(dá)減少與癌癥預(yù)后不良有關(guān)，并可能影響惡性腫瘤的發(fā)展或進(jìn)展[12-14]。Beclin-1是一種重要的自噬相關(guān)蛋白，是自噬體形成所需的III類磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K-III）復(fù)合物的核心成分。Beclin-1通過(guò)抑制MCF7細(xì)胞中荷瘤小鼠體外細(xì)胞生長(zhǎng)和體內(nèi)腫瘤發(fā)生的發(fā)揮其作用[15]。LC3也是通過(guò)磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合形成自噬體所必需的成分之一。因此，通常通過(guò)跟蹤熒光標(biāo)記LC3或在SDSPAGE凝膠上檢測(cè)快速遷移的脂化LC3（LC3-II）和LC3-I的強(qiáng)度比來(lái)觀察自噬活性[16]。p62（SQSTM1）是一種通過(guò)與LC3進(jìn)行相互作用而發(fā)揮功能的自噬關(guān)鍵分子，p62的上調(diào)/下調(diào)與腫瘤形成、促進(jìn)和抗癌治療有關(guān)[17]。目前，YKF誘導(dǎo)的A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的變化尚未清楚。

本研究通過(guò)檢測(cè)p62和Beclin-1的表達(dá)、LC3 II/I比值、電子顯微鏡下的自噬體和LC3斑點(diǎn)來(lái)評(píng)估YKF在A549細(xì)胞自噬中的作用。

1 材料和方法

1.1 YKF和含YKF的血清制備 養(yǎng)肺控瘤方購(gòu)自南通市中醫(yī)院中藥房。組成：生黃芪45 g，生曬參15 g，北沙參 30 g，白花蛇舌草 30 g，仙鶴草 30 g，薏苡仁30 g。藥物以等效人劑量的5倍，10倍和15倍煎煮。劑量轉(zhuǎn)換根據(jù)《中藥藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)（第3版）》提供的方法進(jìn)行換算。

將雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組制備含藥血清，分別為對(duì)照組、5倍劑量組（5×）、10倍劑量組（10×）和15倍劑量組（15×）。藥物治療組給予YKF 3 g/mL、6 g/mL、9 g/mL（相當(dāng)于 5倍、10倍和 15倍劑量），對(duì)照組給予等量蒸餾水。每組每天以3 mL/次進(jìn)行2次灌胃（早晨和晚上）。在第6次灌胃后2 h收集血液以制備含YKF的血清。滅活和滅菌后，將血清儲(chǔ)存在冰箱中供以后使用。動(dòng)物試驗(yàn)嚴(yán)格遵守美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》（NIH Pub.No.85-23，1996修訂），并經(jīng)南通市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌A549細(xì)胞系從國(guó)家認(rèn)證細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心（中國(guó)上海）獲得。含有青霉素-鏈霉素的Opti-MEM（Gibco）用于培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)于含有YKF的血清處理，將A549細(xì)胞接種在6孔板中并培養(yǎng)過(guò)夜。第2天，將細(xì)胞在不同劑量含有10%YKF血清的新鮮完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）處理細(xì)胞以干擾自噬體的形成。

1.3 電子顯微鏡檢測(cè)自噬 藥物處理48 h后，將細(xì)胞消化并重懸于PBS中。細(xì)胞用PBS洗滌3次。離心后，沿著管壁加入2.5%戊二醛并在4℃下固定過(guò)夜。第2天，用PBS固定細(xì)胞并漂洗3次，然后，用1%四氧化鋨在4℃固定30 min。將不同濃度的丙酮連續(xù)加入到細(xì)胞中進(jìn)行脫水（順序?yàn)?0%，70%，90%，100%）。將細(xì)胞與稀釋的包埋劑在室溫下混合30 min，并在室溫下用純包埋劑代替過(guò)夜。將細(xì)胞質(zhì)量移至膠囊底部并加入包埋溶液的混合物。然后，將它們?cè)?0℃的烤箱中烘烤以凝固成一個(gè)硬塊。將硬塊切成約1μm厚的半薄切片并用醋酸鈉和檸檬酸鉛染色。在電子顯微鏡下觀察自噬體。當(dāng)自噬體和溶酶體融合形成自噬體時(shí)，它們呈現(xiàn)單層結(jié)構(gòu)。

1.4 mRFP-GFP-LC3慢病毒載體制備和自噬流檢測(cè)在293 T細(xì)胞中制備pLVX-puro-mRGP-EGFPLC3B慢病毒載體，將293 T細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)至80%時(shí)傳代。將5μg pLVX-puro-mRGPEGFP-LC3B，5μg psPAX2和 5μg pMD2.G的質(zhì)?；旌衔锶芙庥?00μL opti-MEM中。并制備另一種20μL lipo3 000和600μL opti-MEM的混合物。將2種混合物溶液混合后在室溫下放置20 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中。細(xì)胞培養(yǎng)48 h。收集上清液以獲得慢病毒載體，并用0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾。通過(guò)超速離心濃縮慢病毒載體，并用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾。然后，測(cè)量了病毒滴度。為了檢測(cè)A549細(xì)胞中的自噬流，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種到24孔板中。接著，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜。第2天，每個(gè)孔以MOI=20的病毒量加入新鮮培養(yǎng)液。感染24 h后，去除含有病毒的培養(yǎng)基。共孵育48 h后，將細(xì)胞用多聚甲醛固定并密封。用共聚焦顯微鏡觀察綠色斑點(diǎn)和紅色斑點(diǎn)，并以800×拍照。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用無(wú)菌PBS洗滌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段的A549細(xì)胞1次，并用胰蛋白酶消化。將細(xì)胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)基中。計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞以每孔3×105個(gè)/m L接種到6孔板中，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜。第2天，將Si-Beclin-1-1/2/3或siRNA陰性對(duì)照（NC）與Lipofectamine 3 000混合，并加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中6 h，然后換成完整的培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h。最后，收集細(xì)胞用于進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR） 為了確定Beclin-1 mRNA的表達(dá)水平，使用qRT-PCR分析不同方法處理的細(xì)胞。用RNAiso Plus（Trizol）加入細(xì)胞并充分裂解，并通過(guò)光譜儀測(cè)定RNA的純度和濃度。使用 PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）（TAKARA）將等質(zhì)量的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以ABI ViiA7熒光定量PCR儀中的Power SYBR Green PCR Master Mix（Thermo）擴(kuò)增系統(tǒng)為基礎(chǔ)，利用cDNA產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。實(shí)時(shí)定量PCR的引物為：

Beclin-1 mRNA的表達(dá)水平相對(duì)于GAPDH。

1.7 CCK-8 將每孔以104的細(xì)胞接種在96孔板中并置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜。第2天，將細(xì)胞與含有10%YKF血清的完整培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。孵育時(shí)間后，將96孔板的每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8溶液并再溫育2 h。在450 nm處測(cè)量每個(gè)孔的吸光度。

1.8 蛋白質(zhì)印跡 處理過(guò)的細(xì)胞用PBS洗滌，然后在結(jié)冰條件下使用RIPA裂解物（Beyotime，Shanghai，China）裂解30 min。離心后收集的上清液是總蛋白質(zhì)。基于BSA方法定量每個(gè)蛋白質(zhì)樣品。等質(zhì)量的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE和電泳分離上加載緩沖中加載。將蛋白質(zhì)從凝膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉非特異性蛋白質(zhì)，并用第一抗體印跡特異性蛋白質(zhì)。印跡在用Millipore ECL系統(tǒng)孵育第二抗體和化學(xué)發(fā)光后可視化。第一抗體是anti-Beclin-1，anti-p62，anti-LC3，和 GAPDH（PROTEINTECH）。第二抗體是HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（H+L）（Beyotime）。

1.9 Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 用胰蛋白酶消化A549對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，并用PBS洗滌。將細(xì)胞重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基上，細(xì)胞密度調(diào)整至4×105個(gè)/m L。將直徑為8μm的Transwell小室置于含有培養(yǎng)基的24孔板中。將200μL細(xì)胞懸浮液加入到上層小室中并培養(yǎng)48 h。取出小室并用PBS洗滌，并用4%多聚甲醛（PFA）固定20 min。細(xì)胞用結(jié)晶紫染色溶液染成紫色。將帶有細(xì)胞的小室置于載玻片上并在顯微鏡下觀察。Transwell分析細(xì)胞侵襲能力的方法與上述方法相同除了需要除了在Transwell小室中添加基質(zhì)膠以及在Transwell上室添加105個(gè)細(xì)胞外。

1.10 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進(jìn)行分析，并用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YKF含藥血清促進(jìn)A549細(xì)胞的自噬作用 分別用含5×、10×、15×YKF的血清對(duì)A549細(xì)胞處理48 h，并評(píng)估YKF對(duì)細(xì)胞活力的影響。見(jiàn)圖1A左。結(jié)果顯示：含YKF的血清劑量越高，細(xì)胞活力越低，但3組間細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明較高劑量的YKF并不具有更好的抑制細(xì)胞活性的能力。選擇含有5×YKF的血清對(duì)A549細(xì)胞處理24 h、48 h、72 h，并進(jìn)行CCK-8活力測(cè)定。見(jiàn)圖1A右。結(jié)果顯示：細(xì)胞活力隨著處理時(shí)間的增加而降低。

圖1 養(yǎng)肺控瘤方（YKF）促進(jìn)A549細(xì)胞自噬

使用蛋白質(zhì)LC3 II/LC3 I比值來(lái)觀察自噬體的形成和自噬情況。為了評(píng)估YKF對(duì)A549細(xì)胞自噬的影響，用含YKF的血清處理A549細(xì)胞48 h后，檢測(cè)細(xì)胞中LC3 II/I比值、p62和Beclin-1的表達(dá)。見(jiàn)圖1B。結(jié)果顯示，LC3 II/I比值升高，p62和Beclin-1表達(dá)水平增加，（P＜0.001）。結(jié)果表明：YKF 可能誘導(dǎo)A549細(xì)胞的自噬性死亡。

2.2 通過(guò)3-MA抑制自噬逆轉(zhuǎn)YKF對(duì)A549細(xì)胞的促進(jìn)自噬作用 選擇含5×YKF的血清處理48 h的A549細(xì)胞。并在放大13 000倍的電子顯微鏡下觀察其自噬情況。見(jiàn)圖2A。為了進(jìn)一步確定YKF的自噬促進(jìn)作用，我們比較了含5×YKF血清處理的A549細(xì)胞用3-MA抑制自噬劑或不用3-MA抑制自噬劑后的LC3斑點(diǎn)。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，含5×YKF血清可誘導(dǎo)LC3斑點(diǎn)增加，而這種增加在3-MA處理后消失，表明YKF對(duì)A549細(xì)胞發(fā)揮促進(jìn)自噬的作用。見(jiàn)圖2B。

圖2 3-M A抑制自噬對(duì)YKF誘導(dǎo)的A549細(xì)胞自噬的影響

2.3 沉默Beclin-1逆轉(zhuǎn)了YKF對(duì)A549細(xì)胞的促進(jìn)自噬作用 我們通過(guò)siRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染敲除A549細(xì)胞中的Beclin-1，并檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活力的影響。經(jīng)si-Beclin1-1、si-Beclin1-2 和 si-Beclin1-3 轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，僅si-Beclin1-2能誘導(dǎo)Beclin-1下調(diào)，（P＜0.01）。因此，在以下試驗(yàn)中選擇si-Beclin1-2來(lái)沉默Beclin-1。見(jiàn)圖3A。沉默Beclin-1降低了YKF誘導(dǎo)的LC3II/I比值和p62表達(dá)水平。同樣，3-MA也達(dá)到了與沉默Beclin-1相同的效果，抑制了LC3II/I比值和p62的表達(dá)水平，表明YKF誘導(dǎo)的A549細(xì)胞自噬依賴于Beclin-1。見(jiàn)圖3B。以上結(jié)果表明：Beclin-1沉默和3-MA均可逆轉(zhuǎn)YKF誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降（P＜0.001）。見(jiàn)圖3C。

圖3 沉默Beclin-1可逆轉(zhuǎn)含YKF的血清對(duì)A549細(xì)胞的自噬促進(jìn)作用

2.4 沉默Beclin-1逆轉(zhuǎn)含YKF的血清抑制細(xì)胞遷移 為了進(jìn)一步確定YKF的抗腫瘤特性，研究含YKF血清對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，含5×YKF血清導(dǎo)致遷移的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.001）。在Beclin-1沉默的A549細(xì)胞中加入含5×YKF的血清。與含5×YKF血清和si-Beclin-1陰性對(duì)照細(xì)胞相比，Beclin-1沉默的A549細(xì)胞遷移更多（P＜0.05）。此外，與含5×YKF的血清和si-Beclin-1陰性對(duì)照細(xì)胞相比，自噬抑制劑3-MA處理的A549細(xì)胞遷移更多（P＜0.01）。這些數(shù)據(jù)表明，YKF通過(guò)影響自噬和Beclin-1來(lái)抑制A549細(xì)胞遷移。見(jiàn)圖4。

圖4 沉默Beclin-1逆轉(zhuǎn)含YKF的血清抑制A 549細(xì)胞遷移

2.5 沉默Beclin-1逆轉(zhuǎn)含有YKF的血清對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制作用 通過(guò)沉默Beclin-1逆轉(zhuǎn)含YKF的血清以抑制A549細(xì)胞侵襲。結(jié)果顯示，與空白組相比，含5×YKF的血清導(dǎo)致侵襲細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.001）。將含5×YKF的血清添加到Beclin-1沉默的A549細(xì)胞中。與5×YKF的血清和si-Beclin-1的陰性對(duì)照細(xì)胞相比，Beclin-1沉默的A549細(xì)胞侵襲性更強(qiáng)（P＜0.05）。此外，與含5×YKF的血清和si-Beclin-1的陰性對(duì)照細(xì)胞相比，3-MA處理的A549細(xì)胞侵襲性更強(qiáng)（P＜0.01）。這些數(shù)據(jù)表明，YKF通過(guò)影響自噬和Beclin-1來(lái)抑制A549細(xì)胞侵襲。見(jiàn)圖5。

圖5 沉默Beclin-1逆轉(zhuǎn)含YKF的血清以抑制A549細(xì)胞侵襲

3 討論

近幾十年來(lái)，許多形式的補(bǔ)充醫(yī)學(xué)和替代醫(yī)學(xué)在世界范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用，在改善癌癥患者的生活質(zhì)量方面發(fā)揮了作用[18]。在中國(guó)，中醫(yī)藥被廣泛接受，并成為有益于癌癥患者補(bǔ)充療法和替代療法的重要手段[6]。許多抗癌中藥方劑已應(yīng)用于臨床，并對(duì)癌癥患者產(chǎn)生了有益的效果。中草藥治療非小細(xì)胞性肺癌的Meta分析表明，中草藥可以有效提高患者生存質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期，在療效、安全性和控制成本方面均具有顯著的優(yōu)勢(shì)[19-20]。本研究作為以細(xì)胞試驗(yàn)為主的基礎(chǔ)研究，證實(shí)了YKF在促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549自噬、抑制肺癌細(xì)胞活力、遷移、侵襲等方面可發(fā)揮重要作用。

自噬在腫瘤存活或細(xì)胞死亡中具有復(fù)雜的雙重作用[1]。調(diào)控自噬是否有利于消除癌癥目前尚不清楚。許多研究表明天然藥物或藥物成分可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的自噬性死亡，如丹參酮[21]，堪非醇[3]和重樓皂苷VI[22]。許多中國(guó)傳統(tǒng)藥物或草藥提取物可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞自噬性死亡[23-25]。本研究結(jié)果顯示：YKF可抑制腫瘤細(xì)胞活力，促進(jìn)A549細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、p62和LC3 II/I）的表達(dá)和自噬體的形成，進(jìn)一步證實(shí)YKF可誘導(dǎo)A549細(xì)胞的自噬性死亡。同時(shí)，YKF對(duì)A549細(xì)胞可發(fā)揮抗細(xì)胞遷移和侵襲的作用。綜合來(lái)看，YKF對(duì)A549細(xì)胞能夠起到有效的抗腫瘤活性的作用。

惡性細(xì)胞常常會(huì)表現(xiàn)出自噬缺陷和自噬相關(guān)蛋白的異常模式。Beclin-1作為自噬的核心蛋白，顯示出異常的表達(dá)模式和/或活性，這些異常與致癌作用呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)[26-28]。文獻(xiàn)報(bào)道，基于小鼠Beclin-1基因敲除的研究[29]表明Beclin-1的雜合破壞導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞增殖增加和自噬減少，并表明Beclin-1或其他自噬基因的突變可能有助于人類癌癥的發(fā)病機(jī)制。例如，有研究發(fā)現(xiàn)Beclin-1在胰腺癌和前列腺癌癥等癌癥患者中表達(dá)下調(diào)[30-31]。此外，具有抗癌特性的藥物對(duì)Beclin-1的抑制作用有利于癌癥細(xì)胞的去除[32]。本研究發(fā)現(xiàn)在含YKF血清誘導(dǎo)的A549細(xì)胞活力下降和自噬增加的情況下，Beclin-1的表達(dá)水平顯著提高，而基因敲除抑制了YKF對(duì)A549細(xì)胞LC3 II/I比值、p62表達(dá)、遷移和侵襲的影響。由此，我們可以推斷，Beclin-1是YKF誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、抑制A549細(xì)胞遷移和侵襲的抗癌特性中的一個(gè)關(guān)鍵性分子。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)：YKF對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗癌作用。此外，A549細(xì)胞的Beclin-1依賴性自噬死亡是YKF抑制肺癌進(jìn)展的機(jī)制。本研究基于傳統(tǒng)處方Y(jié)KF進(jìn)行的基礎(chǔ)試驗(yàn)來(lái)闡明抗癌藥物YKF的作用機(jī)制，以期在未來(lái)的腫瘤治療中提供更多科學(xué)依據(jù)和思路。