廖魏祖, 賈庚佩, 楊 政, 孫 毅

(1. 長江大學(xué), 湖北 荊州, 434100; 長江大學(xué)附屬荊州醫(yī)院, 2. 全科醫(yī)學(xué)科,3. 感染科, 4. 皮膚病與性病科, 湖北 荊州, 434100)

真菌廣泛存在于呼吸道、生殖道、消化道、口腔和皮膚等處[1], 大部分為機(jī)會致病菌[2], 可引起淺部真菌感染和深部真菌感染[3], 其中深部真菌感染是常見的院內(nèi)感染類型之一[4]。由于缺乏特異性表現(xiàn)，真菌感染的臨床診斷極其困難，且治療難度大，治療成本高[5]。因此，探尋新型的抗真菌治療方案和抗真菌藥協(xié)同治療策略對于改善患者預(yù)后具有積極意義。氫氧機(jī)是利用電解水技術(shù)制備氫氣、氧氣的設(shè)備，醫(yī)療用氫氧氣霧化機(jī)主要由電解槽和超聲霧化系統(tǒng)組成，通過提供氫氧混合氣體經(jīng)呼吸系統(tǒng)進(jìn)入人體起治療作用，也可與霧化藥液混合后進(jìn)行霧化吸入、濕化治療[6-7]。本研究使用氫氧機(jī)制備的氫氧混合氣體對臨床常見的致病真菌進(jìn)行體外處理，觀察不同處理時間的真菌殺傷效果，并檢測處理后真菌對唑類抗真菌藥的敏感性變化，以期為臨床單獨(dú)應(yīng)用氫氧機(jī)或聯(lián)用抗真菌藥治療真菌感染提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取長江大學(xué)附屬荊州醫(yī)院真菌試驗室保存的12株臨床分離真菌作為試驗菌株，分別為白念珠菌R9、R14、R15、SC5314, 耳念珠菌AR382、AR387、AR389(購自美國CDC)，克柔念珠菌ATCC00279, 近平滑念珠菌ATCC22019, 新生隱球菌Z1、Z2、Z3。藥敏試驗質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌(ATCC22019)。試驗藥物包括泊沙康唑(POS)、伊曲康唑(ITR)、氟康唑(FLU)和伏立康唑(VOR)(購自Selleck公司)。氫氧機(jī)購自阿斯克勒庇俄斯醫(yī)學(xué)(南通)有限公司，型號BYT-JP-H03。一次性無菌管購自北京紅祥聚科貿(mào)易有限公司，生產(chǎn)批號H0081031。

1.2 氫氧機(jī)對真菌的體外殺傷試驗

① 菌懸液制備: 以沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基培育真菌2 d后用無菌生理鹽水收集孢子，再使用血細(xì)胞計數(shù)板調(diào)整孢子濃度為2×106CFU/mL。② 菌液稀釋: 將制備好的12株菌株的菌懸液用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋至終濃度2×104CFU/mL, 分別取10 mL分裝于50 mL EP管中。③ 氫氧機(jī)通氣處理: 使用一次性無菌管分別接入氫氧機(jī)出氣口和裝有菌懸液的50 mL EP管中，并確保通氣部位在菌懸液底部。氫氧機(jī)開機(jī)后，設(shè)置氣流量為3 L/min, 霧化檔為5檔。以通氣0 min時(未通氣時)和通氣處理菌懸液5、10 min時為3個觀察時點(diǎn)，各時點(diǎn)分別取菌懸液100 μL, 用玻璃珠涂布于SDA培養(yǎng)基，于37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)2 d后進(jìn)行菌落計數(shù)。所有試驗操作重復(fù)3次。

1.3 體外藥敏試驗

按照美國臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)頒布的M27-A4文件中的微量液基稀釋法，配置RPMI 1640液體培養(yǎng)基。將試驗藥物VOR、POS、FLU和ITR分為8個濃度梯度，工作濃度范圍分別為0.031～4.000 μg/mL、0.031～4.000 μg/mL、0.500～64.000 μg/mL和0.063～8.000 μg/mL。倍比稀釋4種藥物，將稀釋后的藥物分別加入96孔板，設(shè)立無藥孔為生長對照孔，剩余每孔再加入倍比稀釋后藥物100 μL和菌懸液100 μL, 35 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后讀取最低抑菌濃度(MIC)結(jié)果。每個藥敏試驗重復(fù)3次，質(zhì)控菌株為近平滑念珠菌ATCC22019。

1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測

采用雙氫羅丹明123(DHR-123, 購自Sigma-Aldrich公司，貨號NO.D1054, 將粉狀熒光染料溶解于二甲亞砜)檢測細(xì)胞內(nèi)ROS。取3個觀察時點(diǎn)的菌懸液，分別配置6管10 mL孢子濃度為5×106CFU/mL的沙氏葡萄糖水液體培養(yǎng)基菌懸液，取其中1管不做處理，其余5管分別加入DHR-123(5.000 μg/mL), 再取5管中的4管分別加入濃度不同的4種藥物(每管加其中1種藥物)，即ITR(0.250 μg/mL)、VOR(0.125 μg/mL)、POS(0.500 μg/mL)、FLU(0.250 μg/mL)。將配置好的菌懸液放入搖箱中于37 ℃、130 轉(zhuǎn)/min條件下振蕩培養(yǎng)30 min。取培養(yǎng)后的菌液離心(2 000～4 000轉(zhuǎn)/min) 5～10 min, 去除上清后以5 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)重復(fù)洗滌2次。洗滌后重懸細(xì)胞于5 mL SDA液體培養(yǎng)基中，放入搖箱以37 ℃、130轉(zhuǎn)/min振蕩培養(yǎng)60 min, 取經(jīng)第2次培育后的菌液離心(2 000～4 000轉(zhuǎn)/min) 5～10 min, 去除上清后加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸。取150 μL重懸液置于流式管中，使用流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司，型號B53000)進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料比較行卡方檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 氫氧機(jī)不同通氣時間對真菌菌株的殺傷情況

氫氧機(jī)5 min通氣處理對12株菌株的殺傷率與通氣0 min比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 整體殺傷率范圍為6.3%～76.2%, 其中對4株白念珠菌的殺傷率范圍為9.0%～49.6%, 對3株耳念珠菌的殺傷率范圍為6.3%～20.9%, 對3株新生隱球菌的殺傷范圍為10.3%～76.2%, 對克柔念珠菌的殺傷率為21.1%, 對近平滑念珠菌的殺傷率為37.8%。與5 min通氣處理相比，氫氧機(jī)10 min通氣處理對12株菌株的殺傷率增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 整體殺傷率范圍為19.6%～93.5%, 其中對4株白念珠菌的殺傷率增至23.1%～53.4%, 對3株耳念珠菌的殺傷率增至23.9%～49.7%, 對3株新生隱球菌的殺傷率增至19.6%～93.5%, 對克柔念珠菌的殺傷率增至39.5%, 對近平滑念珠菌的殺傷率增至46.1%。由此可見, 5 min通氣處理即可顯著改變對真菌的殺傷效果，但10 min通氣處理對真菌的殺傷效果顯著更優(yōu)，故10 min是更合適的通氣處理時間。經(jīng)高濃度氫氣處理后，孢子數(shù)明顯減少，說明高濃度氫氣通氣處理對真菌菌株產(chǎn)生了明顯的殺傷效果。菌株生長狀況見圖1, 各菌株殘余孢子數(shù)量見圖2, 通氣不同時間后各菌株孢子存活率見表1。

表1 通氣不同時間后各菌株的孢子存活率 %

2.2 體外藥敏試驗結(jié)果

與未經(jīng)通氣處理時相比，通氣處理10 min后，大部分菌株表現(xiàn)出對抗真菌藥更加敏感。對于白念珠菌, ITR的MIC從0.250～1.000 μg/mL降至0.125～1.000 μg/mL, POS的MIC從0.063～0.500 μg/mL降至0.063～0.250 μg/mL, FLU的MIC從0.500～8.000 μg/mL降至0.125～4.000 μg/mL; 對于耳念珠菌, ITR的MIC從0.125～4.000 μg/mL降至0.125～1.000 μg/mL, VOR的MIC從0.250～4.000 μg/mL降至0.250～2.000 μg/mL, POS的MIC從0.063～4.000 μg/mL降至0.063～0.500 μg/mL, FLU的MIC從4.000～64.000 μg/mL降至2.000～64.000 μg/mL; 對于克柔念珠菌, ITR的MIC從0.250 μg/mL降至0.063 μg/mL, VOR的MIC從0.125 μg/mL降至0.063 μg/mL, POS的MIC從0.500 μg/mL降至0.031 μg/mL, FLU的MIC從0.250 μg/mL降至0.063 μg/mL; 對于近平滑念珠菌, ITR的MIC從0.250 μg/mL降至0.063 μg/mL, VOR的MIC從0.125 μg/mL降至0.063 μg/mL, POS的MIC從0.500 μg/mL降至0.250 μg/mL, FLU的MIC從2.000 μg/mL降至0.063 μg/mL; 對于新生隱球菌, ITR的MIC從0.125～0.250 μg/mL降至0.063～0.250 μg/mL, FLU的MIC從2.000～4.000 μg/mL降至0.500～2.000 μg/mL。藥敏試驗結(jié)果顯示，經(jīng)過高濃度氫氣處理后，抗真菌藥對11株真菌的MIC值明顯降低，說明高濃度氫氣處理可使菌株對藥物的敏感性增強(qiáng)，起到協(xié)同殺傷效果。見表2。

表2 4種抗真菌藥對12株真菌的體外藥敏試驗最低抑菌濃度結(jié)果 μg/mL

2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果以及存活率結(jié)果篩選出克柔念珠菌ATCC00279進(jìn)行ROS檢測，見圖3。相較于通氣處理0 min, 通氣處理10 min后的ATCC00279對4種唑類抗真菌藥的ROS百分比均有所增加，其中ATCC00279對ITR和VOR的ROS百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖4。由此表明，高濃度氫氣處理會對菌株產(chǎn)生明顯殺傷效果，導(dǎo)致孢子數(shù)目減少，且菌株細(xì)胞內(nèi)ROS比例增加，使其對唑類抗真菌藥的敏感性增強(qiáng)。

3 討 論

臨床常見的真菌主要包括念珠菌、曲霉菌和隱球菌等，廣泛存在于呼吸道、生殖道、消化道、口腔及體表皮膚等部位，其中白念珠菌、新型隱球菌和煙曲霉菌是導(dǎo)致真菌感染最重要的3大致病菌[8-9]。真菌性疾病在國內(nèi)外人群中的發(fā)病率均較高，為20%～25%, 可對人們的身心健康造成重大損害[10]。臨床常見的深部真菌感染的發(fā)生往往與廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑的廣泛使用，導(dǎo)管技術(shù)、器官移植的開展，以及艾滋病、惡性腫瘤患者和老年患者的增加等因素有關(guān)[11-12]。念珠菌是深部真菌感染排名首位的病原菌，其后是曲霉菌和隱球菌[3]。隱球菌引起的深部真菌感染主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)及肺[13], 造成隱球菌性腦膜炎和肺炎。相關(guān)研究[14]稱, 40歲以上慢性阻塞性肺疾病患者合并真菌感染的概率為25%～40%。臨床較少見的耳念珠菌有著“超級真菌”之稱，具有多重耐藥性，一旦感染往往難以治療且流行難以控制[15]。目前，侵襲性真菌感染尚無很好的臨床治療方法，深部真菌感染更是嚴(yán)重影響患者轉(zhuǎn)歸，且隨著耐藥菌株的增加抗菌藥的臨床應(yīng)用受到限制[16], 導(dǎo)致患者住院時間延長，甚至危及生命健康。

2020年2月2日，氫氧氣霧化機(jī)被國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)作為三類呼吸醫(yī)療設(shè)備用于慢性阻塞性肺疾病的輔助治療，可改善呼吸困難、咳嗽、咳痰等癥狀?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第七版)》、《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》均將氫氣治療作為推薦治療方法，使得氫氣的臨床價值逐漸引起重視[17]。本研究選取臨床常見的深部致病真菌12株，使用氫氧機(jī)制備的氫氧混合氣體對其進(jìn)行體外處理，發(fā)現(xiàn)氫氧混合氣體在體外對真菌孢子均有不同程度的殺傷效果，其中對新生隱球菌、白念珠菌的殺傷效果尤為明顯，對耳念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌亦表現(xiàn)出較好的殺傷效果。同時，體外藥敏試驗結(jié)果顯示，氫氧機(jī)通氣處理與唑類抗真菌藥對上述真菌孢子的協(xié)同殺傷效果明顯，即氫氧機(jī)通氣可提高真菌孢子對唑類抗真菌藥的敏感性，表明氫氣在真菌感染性疾病治療方面或許有較好的前景。

氫氣的具體作用機(jī)制目前尚未明確，本研究提示氫氣對孢子具有高抑制效果，其可能機(jī)制是高濃度的氫氣打破了真菌微生物的氧化-抗氧化平衡，甚至有可能直接作用于微生物線粒體而影響孢子的能量代謝[17]。本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)通氣處理后，菌株細(xì)胞內(nèi)ROS比例增加，對4種唑類抗真菌藥的敏感性增強(qiáng)。研究[18]證實ROS對孢子具有殺傷效應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)蓄積的ROS氧化細(xì)胞內(nèi)的DNA、蛋白、脂質(zhì)及細(xì)胞器，從而引起氧化應(yīng)激，被ROS氧化的蛋白及脂質(zhì)不僅會失去應(yīng)有功能，而且易在細(xì)胞內(nèi)聚集形成脂褐素等毒性物質(zhì)，并通過影響溶酶體的活性而引起細(xì)胞死亡。另外，氧化應(yīng)激也會引起線粒體的嚴(yán)重?fù)p害，線粒體內(nèi)積聚的ROS可使其DNA突變、脂質(zhì)過氧化，從而影響線粒體的功能，線粒體嚴(yán)重?fù)p害還可引起胞體自噬、自噬性細(xì)胞死亡、凋亡和壞死[19]。研究[20]顯示，不同種類的抗菌藥物可能通過激活呼吸鏈電子傳遞，誘導(dǎo)大量的ROS積累而參與殺菌，對于致死濃度的抗菌藥物而言，抗菌共有通路產(chǎn)生的ROS參與并促進(jìn)抗生素殺菌，進(jìn)而減少細(xì)菌數(shù)目，并減少耐藥菌產(chǎn)生機(jī)會，進(jìn)一步證實氫氧機(jī)產(chǎn)生的氫氧混合氣體和唑類抗真菌藥對真菌孢子具有協(xié)同殺傷作用。相關(guān)研究[21]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)呼吸道吸入氫氣可改善眾多疾病模型中的組織損傷，如肺、腦、心、腎、皮膚、鼻等，特別是在慢性阻塞性肺疾病合并深部真菌感染的治療中，氫氧混合氣呼吸療法不僅可降低氣體在小氣道中的流速阻力，提高氧氣的利用度，減輕慢性阻塞性肺疾病癥狀，而且對深部真菌感染有一定的協(xié)同治療作用，提升了整體治療效果。

綜上所述，氫氧機(jī)通氣具有安全、易操作等特點(diǎn)，且單獨(dú)氫氧機(jī)通氣處理即可實現(xiàn)高達(dá)93.5%的菌株殺傷效果，將其與抗真菌藥聯(lián)用還可進(jìn)一步降低抗真菌藥對真菌的MIC, 其機(jī)制可能與氫氧機(jī)能增強(qiáng)真菌細(xì)胞內(nèi)ROS活性有關(guān)。本研究可為氫氧機(jī)在真菌感染輔助治療中的臨床應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)，但本研究選取的試驗菌株為臨床常見的深部真菌感染菌株，氫氣單獨(dú)或聯(lián)合抗真菌藥是否對廣譜真菌亦有直接殺傷或協(xié)同殺傷效果還需在后續(xù)研究中進(jìn)一步證實。