沈 琴, 朱 宏, 陳路沅

(南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院 口腔科, 廣東 深圳, 518100)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨密度減少為基本特征的骨骼系統(tǒng)疾病，易發(fā)于老年人群，主要表現(xiàn)為骨脆性增加、骨強度下降、易發(fā)生骨折[1-2]。骨質(zhì)疏松癥骨丟失主要由機體內(nèi)成骨細胞形成和破骨細胞分化的失衡引起。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是一種長度超過200 nt的非編碼RNA小分子，其異常表達與骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3]。LncRNA AK077216在破骨細胞生成過程中顯著上調(diào)，通過調(diào)節(jié)活化T細胞核因子的表達，促進破骨細胞的形成[4]。lncRNA XIST在骨質(zhì)疏松癥患者中高表達，體外過表達lncRNA XIST可降低堿性磷酸酶(ALP)、骨γ-羧基谷氨酸蛋白和runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2的表達，從而抑制骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化[5]。LncRNA NEF在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血漿中呈下調(diào)趨勢，且與患者復(fù)發(fā)關(guān)系密切[6]。目前，有關(guān)LncRNA NEF在骨質(zhì)疏松中的作用機制尚未明確。本研究建立動物骨質(zhì)疏松模型，檢測LncRNA NEF在骨質(zhì)疏松中的表達變化，并進行體外實驗分析沉默LncRNA NEF對成骨、破骨細胞分化的影響，以期為尋找骨質(zhì)疏松潛在治療靶標提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞來源

6月齡SPF級健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量(180.25±27.03) g, 購自廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司，使用許可證為[SYXK(粵)2020-0242]。飼養(yǎng)條件：每12 h明暗交替自然光照，進食、進水，25 ℃, 濕度50%, 噪音<60分貝，環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。

大鼠前成骨細胞系MC3T3-E1細胞(TC-axbz-094)購自上海信裕生物科技有限公司; 大鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞株(C2001)購自上海盈灣生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

MEMα培養(yǎng)基(KPM150421P)均購自武漢楚銳科藥業(yè)科技有限公司; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RP1105-100T)、AceQqPCR SYBR Green Mix(ALH185)、Trizol Reagent核酸分離試劑(YT526)、堿性磷酸酶活性檢測試劑盒(1535174279); 茜素紅染色液(YT8939)購自北京伊塔生物科技有限公司; 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染液(OX02564)購自上海圻明生物科技有限公司; 蛋白提取試劑盒(SD-001)購自晨學(xué)生物科技(廣州)有限公司; 兔抗人ALP(Abcam)、組織蛋白酶K(CTSK, PAB8636)購自上海科敏生物科技有限公司; HRP標記山羊抗兔二抗(GB23303)抗體均購自東莞市潤博生物科技有限公司。

CO2培養(yǎng)箱(NHD DYE1738)購自日本sanyo公司; Elx800酶標儀(HSG9832)購自美國Thermo公司; 雙能X射線骨密度儀(DPX-NT)購自上海聚慕醫(yī)療器械有限公司; 微計算機斷層掃描儀(uCT50)購自瑞士SCANCO Medical。

1.3 方法

1.3.1 鼠尾懸吊法制備骨質(zhì)疏松動物模型: 取12只大鼠，隨機分為對照組(n=6, 正常大鼠)和實驗組(n=6, 骨質(zhì)疏松癥大鼠)。大鼠骨質(zhì)疏松癥模型建立: 對大鼠實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用鼠尾懸吊法(尾部懸吊，前肢著地，后肢懸空)[7], 制備骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，使其身體長軸與水平面夾角呈30 °, 且活動不受限制, 4周后給予大鼠戊巴比妥鈉(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉后處死，剝離左側(cè)脛骨、椎骨，置于雙能X射線骨密度儀探頭下掃描，測定其骨密度值[8]。

1.3.2 微計算機斷層掃描技術(shù)檢測大鼠股骨骨量及結(jié)構(gòu): 腹腔注射麻醉后，處死取大鼠股骨組織，通過微計算機斷層掃描儀及相關(guān)軟件，檢測骨體積分數(shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間距(Tb.Sp)。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法檢測LncRNA NEF、ALP、TRAP、CTSK水平: TRIzol法分別提取對照組、實驗組股骨組織總RNA并測定濃度。以RNA為模板、PrimeScript RT reagent試劑盒說明書為操作標準進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。體系20 μL: ULtraSYBR mixture(10.0 μL)、模板cDNA(2.0 μL)及上、下游引物(各2.0 μL)、去離子純化水(4.0 μL); 條件(40個循環(huán)): 93 ℃ 30 s、93 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s。β-actin為內(nèi)參引物，引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。采用2-△△Ct方法計算LncRNA NEF、ALP、TRAP、CTSKmRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.3.4 細胞培養(yǎng)及分化誘導(dǎo): ① 細胞培養(yǎng)。分別復(fù)蘇并解凍MC3T3-E1細胞、RAW264.7細胞，分別用含10%胎牛血清(FBS)+1%雙抗的MEMα培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2 d換液，無菌操作并傳代培養(yǎng)。② 細胞分化誘導(dǎo): 誘導(dǎo)MC3T3-E1細胞成骨分化時，更換成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(含15% FBS+50 μmol/L α-左旋抗壞血酸+10 mmol/Lβ甘油磷酸鹽+10-8mol/L地塞米松+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素的MEMα培養(yǎng)基)，每2 d換液，誘導(dǎo)15 d。誘導(dǎo)RAW264.7細胞破骨分化時，更換含100 ng/mL破骨誘導(dǎo)因子RANKL的MEMα培養(yǎng)基，每2 d換液，誘導(dǎo)6 d。

1.3.5 茜素紅染色: 將誘導(dǎo)成骨分化后的細胞用4%多聚甲醛固定30 min、茜素紅染液(pH值4.2)染色10 min, 顯微鏡下觀察成骨分化效果。

1.3.6 檢測成骨分化過程中ALP活性及LncRNA NEF水平: 取“1.3.4”誘導(dǎo)成骨分化的MC3T3-E1細胞，嚴格按照ALP活性檢測試劑盒檢測誘導(dǎo)分化第0、15 天的細胞ALP活性，以全自動酶標儀測定各樣品520 nm處吸光度(OD)值，在ALP標準曲線上讀取酶活性值。參照“1.3.3” qRT-PCR法檢測誘導(dǎo)分化第0、15天的細胞LncRNA NEF水平。

1.3.7 TRAP染色: 將誘導(dǎo)破骨分化后的細胞用4%多聚甲醛固定30 min、0.1%TritonX100通透10 min, 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌; 加入100 ng/mL 的TRAP染色液，染色60 min。顯微鏡下觀察破骨分化效果，細胞呈酒紅色、含3個及3個以上細胞核為破骨細胞。

1.3.8 檢測破骨分化過程中CTSKmRNA及LncRNA NEF水平: 取“1.3.4”誘導(dǎo)破骨分化的RAW264.7細胞，參照“1.3.3” qRT-PCR法檢測第0、6天CTSKmRNA、LncRNA NEF水平。

1.3.9 慢病毒感染實驗: 設(shè)計并合成LncRNA NEF基因的siRNA序列，依據(jù)pSUPER質(zhì)粒圖譜選擇單一酶切位點Bgl Ⅱ及Hind Ⅲ, 合成shRNA。① 對MC3T3-E1細胞成骨誘導(dǎo)3 d時，分別感染陰性對照的慢病毒、敲低LncRNA NEF的慢病毒，分別設(shè)為NC-shRNA組、shRNA-LncRNA NEF組。繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，參照“1.3.6”檢測2組細胞ALP活性及LncRNA NEF水平; 參照“1.3.5”茜素紅染色檢測下調(diào)LncRNA NEF表達對成骨誘導(dǎo)分化的影響。② 對RAW264.7細胞破骨誘導(dǎo)3 d時，分別感染陰性對照的慢病毒、敲低LncRNA NEF的慢病毒，分別設(shè)為NC-shRNA組、shRNA-LncRNA NEF組。繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，參照“1.3.8”檢測2組細胞CTSKmRNA、LncRNA NEF水平; 參照“1.3.7”TRAP染色檢測下調(diào)LncRNA NEF表達對破骨誘導(dǎo)分化的影響。

1.3.10 蛋白免疫印跡法(WB)檢測成骨分化、破骨分化相關(guān)蛋白表達情況: 收集誘導(dǎo)分化后的細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白并檢測濃度及純度，取20 μg蛋白于12% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離，將各蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，放入脫脂奶粉(5%)溶液室溫封閉2 h, 分別加入成骨分化相關(guān)蛋白(ALP)、破骨分化相關(guān)蛋白(CTSK), 稀釋比均為1∶500(一抗), 4 ℃孵育過夜，洗膜緩沖液(TBST)清洗，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔二抗(1∶1 000), 室溫孵育1 h, 采用ECL發(fā)光試劑顯影，以β-actin為內(nèi)參, Image J軟件對各蛋白相對表達量進行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 大鼠股骨結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

與對照組相比，實驗組大鼠股骨骨密度、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低, Tb.Sp升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠股骨結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

2.2 LncRNA NEF、ALP、TRAP、CTSK在大鼠組織中的表達情況

與對照組比較，實驗組大鼠股骨組織中LncRNA NEF、ALP水平降低,TRAP、CTSK水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 LncRNA NEF、ALP、TRAP、CTSK在大鼠股骨組織中的表達情況

2.3 大鼠LncRNA NEF與ALP、TRAP、CTSK相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明，在骨質(zhì)疏松癥大鼠中, LncRNA NEF與ALP表達呈正相關(guān)(P<0.05), 與TRAP、CTSK表達呈負相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 骨質(zhì)疏松癥大鼠LncRNA NEF與ALP、TRAP、CTSK相關(guān)性分析

2.4 成骨分化過程中ALP活性及其蛋白表達與LncRNA NEF水平表達變化

與誘導(dǎo)第0天比較，第15天誘導(dǎo)成骨分化的MC3T3-E1細胞ALP活性與LncRNA NEF水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 成骨分化過程中ALP活性與LncRNA NEF水平表達變化

2.5 破骨分化過程中CTSK mRNA及其蛋白

表達與LncRNA NEF水平表達變化與誘導(dǎo)第0 天比較，第6 天誘導(dǎo)破骨分化的RAW264.7細胞CTSKmRNA水平及其蛋白表達均升高, LncRNA NEF水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6、圖1。

表6 成骨分化過程中CTSK mRNA及其蛋白表達與LncRNA NEF水平表達變化

圖1 成骨分化過程中CTSK蛋白表達WB圖

2.6 下調(diào)LncRNA NEF表達對成骨誘導(dǎo)分化的影響

與NC-shRNA組比較, shRNA-Lnc RNA NEF組成骨誘導(dǎo)分化的MC3T3-E1細胞ALP活性與LncRNA NEF水平均降低，且茜素紅染色顯示紅色鈣化結(jié)節(jié)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表7、圖2。

表7 下調(diào)LncRNA NEF表達對成骨誘導(dǎo)ALP活性及LncRNA NEF的影響

2.7 下調(diào)LncRNA NEF表達對破骨誘導(dǎo)分化的影響

與NC-shRNA組比較, shRNA-LncRNA NEF組破骨誘導(dǎo)分化的RAW264.7細胞CTSKmRNA水平及其蛋白表達均升高, LncRNA NEF水平降低，且TRAP染色結(jié)果顯示酒紅色、多核細胞增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表8、圖4。

表8 下調(diào)LncRNA NEF表達對破骨誘導(dǎo)CTSK mRNA與蛋白及LncRNA NEF影響

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥是隨年齡增長而出現(xiàn)的一種病理生理現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為骨量低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞、骨脆性增加等，是引起骨折的主要危險因素，其已成為全球慢性非傳染性疾病之一[9-10]。骨生長是成骨細胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收處于動態(tài)平衡的一個過程，當(dāng)骨吸收大于骨形成時，則引發(fā)骨質(zhì)疏松[10-11]。因此探究影響成骨與破骨分化活性的相關(guān)機制，并尋找新型生物防治靶點具有重要意義。尾懸吊法最早用于模擬宇航員的失重狀態(tài)。大鼠尾部懸吊后，后肢肌肉的主動收縮減少，導(dǎo)致股骨和腰椎的生理運動負荷顯著下降，由于廢用導(dǎo)致骨重建，加速骨轉(zhuǎn)換，骨吸收大于骨形成，骨量減少，使骨結(jié)構(gòu)發(fā)生骨質(zhì)疏松樣變化[12]。骨密度是公認的用于評價是否發(fā)生骨質(zhì)疏松的有力指標[13]。本研究顯示，實驗組大鼠股骨骨密度值顯著低于對照組，說明模型建立成功。

LncRNAs在骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎、牙周炎等多種骨代謝疾病中發(fā)揮重要作用。LncRNAs可以從表觀遺傳(基因組印跡、X染色體失活)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控(干擾臨近基因表達)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方面對基因進行調(diào)控，參與成骨細胞分化、破骨細胞形成，影響骨吸收功能[14-15]。LncRNA NEF是由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄而成，是一種抑癌因子[16]。研究[17]顯示，過表達LncRNA NEF能夠抑制骨肉瘤細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。目前，有關(guān)LncRNA NEF的研究[18-20]主要集中在甲狀腺癌、喉癌、骨相關(guān)腫瘤等方面。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，實驗組大鼠股骨組織中LncRNA NEF水平顯著降低，與相關(guān)研究[5]結(jié)果表達趨勢一致。ALP是成骨標志因子，能夠促進成骨細胞成熟、鈣化，其活性是反映成骨細胞分化程度及功能狀態(tài)的良好指標[21]。TRAP是破骨細胞分化標志酶，可反應(yīng)破骨細胞數(shù)量。本研究發(fā)現(xiàn)，實驗組大鼠血清ALP、TRAP水平較對照組顯著升高，提示骨質(zhì)疏松發(fā)生引起成骨細胞、破骨細胞之間平衡紊亂，且LncRNA NEF異常低表達可能與骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但LncRNA NEF在骨質(zhì)疏松大鼠中對成骨細胞和破骨細胞分化的影響需進一步研究。

ALP、TRAP、CTSK均為骨代謝過程中的重要指標。CTSK是破骨細胞重要的功能因子，主要參與降解骨有機基質(zhì)，促進破骨細胞骨吸收[22]。本研究顯示，前成骨細胞系MC3T3-E1細胞誘導(dǎo)成骨分化過程中MC3T3-E1細胞ALP活性與LncRNA NEF水平均顯著升高; 誘導(dǎo)破骨分化的RAW264.7細胞CTSKmRNA及其蛋白表達水平顯著升高, LncRNA NEF水平顯著降低，提示LncRNA NEF可能參與成骨及破骨分化過程。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，與NC-shRNA組比較，誘導(dǎo)成骨分化的shRNA-LncRNA NEF組細胞ALP活性與LncRNA NEF水平均降低，且茜素紅染色的紅色鈣化結(jié)節(jié)減少，說明下調(diào)LncRNA NEF表達可能抑制MC3T3-E1細胞向成骨分化。與NC-shRNA組比較，誘導(dǎo)破骨分化的shRNA-LncRNA NEF組細胞CTSKmRNA及其蛋白表達水平升高，且TRAP染色結(jié)果顯示破骨細胞數(shù)增多，說明下調(diào)LncRNA NEF表達可能促進RAW264.7細胞向破骨細胞分化。上述提示，LncRNA NEF可能通過調(diào)控ALP、TRAP、CTSK表達，參與調(diào)控成骨及破骨分化過程。

綜上所述，LncRNA NEF在骨質(zhì)疏松大鼠股骨中表達降低, NEF沉默可能通過抑制成骨分化并促進破骨分化，進而誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的發(fā)生。然而本研究并未明確LncRNA NEF對成骨及破骨分化影響的具體作用機制，后期應(yīng)進一步深入闡述。