劉夢詩，崔光銳，邱 堅(jiān)，廖微微

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡科，海南 ?？?570100)

食管癌是最常見的胃腸道腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈逐步上升趨勢[1]。由于患者在早期可能出現(xiàn)消瘦、惡心、體重減輕等非特異性癥狀，使食管癌的早期診斷變得困難。近年來，盡管通過手術(shù)、化療或放療等方式對(duì)食管癌的治療已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但對(duì)于這種致命的疾病仍然沒有有效的根治方法，存活率仍然很低[2]。因此，探究食管癌的發(fā)病機(jī)制，尋找治療食管癌的藥物，對(duì)于提高食管癌患者的生存率具有重要的意義。有研究表明，麻醉藥物能夠影響腫瘤細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移[3]，而咪達(dá)唑侖(midazolam，MID)作為一種外科手術(shù)常用的的麻醉藥物，可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡[4]，但MID對(duì)于食管癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響尚不清楚。另有研究表明，miR-875-5p在食管癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，且促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[5]。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-875-5p與基質(zhì)抗原2(Stromal antigen 2，STAG2)存在結(jié)合位點(diǎn)，STAG2是位于X染色體(Xq25)上，含有34個(gè)外顯子的基因，已有研究報(bào)道上調(diào)STAG2基因的表達(dá)能抑制腎癌細(xì)胞的增殖能力、促進(jìn)腎癌細(xì)胞的凋亡[6]。但MID是否可通過影響miR-875-5p/STAG2軸來調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖與凋亡尚未可知。因此。本研究主要探討MID對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，分析其是否能夠調(diào)控miR-875-5p/STAG2軸，旨在為食管癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器:人食管癌細(xì)胞系Eca109及食管正常上皮細(xì)胞HEEC均購自深圳市豪地華拓生物公司；miR-875-5p模擬物(miR-875-5p mimics)及其陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-875-5p抑制物(anti-miR-875-5p)及其陰性對(duì)照(anti-miR-NC)均購自美國ThermoFisher公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自TaKaRa公司；CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒均購自金圖生物公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Bio-Rad公司；細(xì)胞周期試劑盒、TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TransStart?Green qPCR SuperMix均購自上海李記生物公司；STAG2兔多克隆抗體、β-actin兔多克隆抗體(anti-STAG2、anti-β-actin)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗均購自美國Abcam公司；熒光定量PCR儀、CO2培養(yǎng)箱均購自德國SIGMA公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組:將Eca109細(xì)胞及食管正常上皮細(xì)胞HEEC在37℃，含有5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期的Eca109細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板中(3×104個(gè)/孔)，參照文獻(xiàn)[7]，用不同濃度的MID(0，10，20，30，40μmoL/L)處理Eca109細(xì)胞24h，通過CCK-8法檢測Eca109細(xì)胞的存活率，篩選適宜的MID濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞分組：在Eca109細(xì)胞中加入MID并調(diào)整濃度為30μmoL/L，記為MID組；正常培養(yǎng)的Eca109細(xì)胞記為NC組。細(xì)胞融合率達(dá)到80%左右時(shí)，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒對(duì)Eca109細(xì)胞進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染，分組如下：anti-miR-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、anti-miR-845-5p組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-845-5p)、MID+miR-NC組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC后使用含有30μmoL/L MID的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h)、MID+miR-875-5p mimics組(細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-875-5p mimics后使用含有30 μmoL/L MID的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h)。

1.3miRNA轉(zhuǎn)錄組測序:提取MID組及NC組Eca109細(xì)胞的總RNA，對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測及處理后構(gòu)建cDNA文庫，通過RNA-seq測序及生物信息學(xué)技術(shù)分析MID組及NC組差異表達(dá)的miRNA。

1.4CCK-8法檢測Eca109細(xì)胞存活率:分別收集Eca109細(xì)胞接種至96孔板(5×103個(gè)/孔)中，按照1.2中的方法進(jìn)行相應(yīng)處理后，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)48h。然后再向每個(gè)孔中加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育3h，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測定Eca109細(xì)胞在450nm波長處的吸光值(OD值)。細(xì)胞存活率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)-OD空白對(duì)照)/(OD正常對(duì)照-OD空白對(duì)照)×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測Eca109細(xì)胞凋亡情況:分別收集不同處理組的Eca109細(xì)胞并用冰冷的PBS洗3次，加入200μL Annexin V-FITC結(jié)合液,輕輕重懸細(xì)胞，室溫(20-25℃)避光孵育15min；1000rpm離心5min，除去上清，加入190μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞；加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，冰溶避光放置2h；進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測；最后使用FlowJo V10軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測Eca109細(xì)胞周期:將細(xì)胞用75%乙醇過夜固定后，按照細(xì)胞周期試劑盒說明書處理細(xì)胞，最后利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.7qRT-PCR檢測Eca109細(xì)胞中miR-875-5p、STAG2 mRNA表達(dá)水平:用Trizol試劑從Eca109細(xì)胞中提取總RNA，利用TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用TransStart?Green qPCR SuperMix試劑盒對(duì)miR-875-5p、STAG2 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行定量。以GAPDH為內(nèi)參，標(biāo)準(zhǔn)化STAG2值；以U6為內(nèi)參，標(biāo)準(zhǔn)化miR-875-5p值。最后通過2-△△CT法計(jì)算基因表達(dá)水平。所用引物序列見表1。

表1 miR-875-5p U6 STAG2 GAPDH qRT-PCR引物序列

1.8Western Blot檢測Eca109細(xì)胞中STAG2蛋白表達(dá)水平:用RIPA裂解緩沖液提取Eca109細(xì)胞蛋白，將20μg蛋白質(zhì)樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂牛奶封閉1h，分別添加兔多克隆抗體anti-STAG2(1∶4000)、anti-β-actin(1∶3000)于4℃下孵育過夜，然后與二抗(1∶5000)在TBST中室溫孵育2h。加入ECL試劑觀察蛋白質(zhì)印跡。對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行掃描，并對(duì)灰度值進(jìn)行量化分析。

1.9雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-875-5p與STAG2靶向關(guān)系:使用starbase網(wǎng)站預(yù)測miR-875-5p與STAG2的結(jié)合位點(diǎn)。分別構(gòu)建STAG2的野生型(WT)和突變型(MUT)3'-UTR區(qū)質(zhì)粒，標(biāo)記為WT-STAG2、MUT-STAG2。將WT-STAG2和MUT-STAG2分別與miR-NC或miR-875-5p mimics共轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，48h后，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞15 min，離心，收集細(xì)胞上清；打開GLO-MAX 20/20熒光檢測儀，設(shè)置程序，讀數(shù)10 s，檢測間隔2 s；將20μL的上清液、100 μL螢火蟲熒光素酶底物L(fēng)ARII加入到96孔板中混勻后開始檢測，記錄數(shù)據(jù)；反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入100μL海腎熒光素酶工作液，混合均勻，終止螢火蟲熒光素酶反應(yīng)，啟動(dòng)海腎熒光素酶反應(yīng)，開始檢測并記錄數(shù)據(jù)。計(jì)算二者比值，分析結(jié)果。

1.10體內(nèi)異種移植瘤實(shí)驗(yàn):20只雄性BALB/c裸鼠隨機(jī)分為裸鼠NC組、裸鼠MID組、裸鼠MID+miR-NC組、裸鼠MID+miR-875-5p mimics組，每組5只，將細(xì)胞濃度為4×106個(gè)/mL的200μL對(duì)應(yīng)的細(xì)胞懸液分別注射到裸鼠右腋下，NC組注射等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)15d后頸椎脫臼處死各組裸鼠，分離出腫瘤并測量腫瘤質(zhì)量。

2 結(jié) 果

2.1MID對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的影響:與0μmoL/L MID相比，10μmoL/L MID、20μmoL/L MID、30μmoL/L MID、40μmoL/L MID處理的Eca109細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.05)，見圖1，且MID濃度為30μmoL/L時(shí)，細(xì)胞存活率接近50%，因此后續(xù)選用30μmoL/L MID用于研究。

圖1 不同濃度MID對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的影響

2.2miRNA轉(zhuǎn)錄組測序篩選差異miRNA:通過高通量測序和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后結(jié)果見圖2，▲為顯著上調(diào)的miRNA，▼為顯著下調(diào)的miRNA，●表示無顯著性差異的miRNA，本研究發(fā)現(xiàn)在顯著下調(diào)的miRNA中有miR-875-5p，表明MID可抑制Eca109細(xì)胞中miR-875-5p的表達(dá)。

圖2 MID處理后的Eca109細(xì)胞的miRNA轉(zhuǎn)錄組測序分析

2.3MID對(duì)Eca109細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及miR-875-5p表達(dá)的影響:MID組Eca109細(xì)胞存活率、S期細(xì)胞比例、miR-875-5p表達(dá)水平顯著低于NC組，細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于NC組(P<0.001)，見圖3。

圖3 MID對(duì)Eca109細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及miR-875-5p表達(dá)的影響

2.4Eca109細(xì)胞和HEEC細(xì)胞中miR-875-5p與STAG2 mRNA表達(dá):與食管正常上皮細(xì)胞HEEC比較，食管癌Eca109細(xì)胞中miR-875-5p表達(dá)水平顯著升高，而STAG2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.001)。見圖4。

圖4 Eca109細(xì)胞中miR-875-5p與STAG2的表達(dá)水平

2.5miR-875-5p靶向調(diào)控STAG2的表達(dá):使用starbase網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-875-5p與STAG2存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖5A。與miR-NC+WT-STAG2組比較，miR-875-5p mimics+WT-STAG2組Eca109細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性顯著降低(P<0.05)，而miR-875-5p mimics+MUT-STAG2組Eca109細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性與miR-NC+MUT-STAG2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5B。

圖5 miR-875-5p靶向調(diào)控STAG2的表達(dá)

2.6抑制miR-875-5p表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響:anti-miR-875-5p組Eca109細(xì)胞中miR-875-5p表達(dá)水平顯著低于NC組和anti-miR-NC組，提示細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，見圖6A。與NC組和anti-miR-NC組比較，anti-miR-875-5p 組Eca109細(xì)胞的存活率、S期細(xì)胞比例顯著降低，而細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)，見圖6。

圖6 抑制miR-875-5p表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞中miR-875-5p表達(dá)水平、細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響

2.7過表達(dá)miR-875-5p可逆轉(zhuǎn)MID對(duì)Eca109細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的作用:與NC組比較，MID干預(yù)后的Eca109細(xì)胞中miR-875-5p表達(dá)水平、細(xì)胞存活率、S期細(xì)胞比例顯著降低，細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05)；將miR-875-5p mimics轉(zhuǎn)染至Eca109細(xì)胞并聯(lián)合MID干預(yù)后，Eca109細(xì)胞中miR-875-5p表達(dá)水平、細(xì)胞存活率、S期細(xì)胞比例顯著高于MID組和MID+miR-NC組，細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例顯著低于MID組和MID+miR-NC組(P<0.05)，見圖7。

圖7 過表達(dá)miR-875-5p可逆轉(zhuǎn)MID對(duì)Eca109細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的作用

2.8過表達(dá)miR-875-5p對(duì)MID處理的Eca109細(xì)胞中STAG2表達(dá)的影響:MID組Eca109細(xì)胞中STAG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于NC組(P<0.05)，而與MID組和MID+miR-NC組相比，MID+miR-875-5p mimics組Eca109細(xì)胞中STAG2的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖8。

圖8 過表達(dá)miR-875-5p對(duì)MID處理的Eca109細(xì)胞中STAG2 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

2.9MID及miR-875-5p對(duì)裸鼠體內(nèi)移植瘤生長的影響:與裸鼠NC組比較，裸鼠MID組裸鼠體內(nèi)移植瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05)；與裸鼠MID組、裸鼠MID+miR-NC組比較，裸鼠MID+miR-875-5p mimics組裸鼠體內(nèi)移植瘤質(zhì)量顯著升高(P<0.05)，見圖9。

圖9 MID及miR-875-5p對(duì)裸鼠體內(nèi)移植瘤生長的影響

3 討 論

MID是一種苯二氮卓類化合物，其具有典型的苯二氮卓類藥理活性，可產(chǎn)生抗焦慮、鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥及肌肉松弛作用[7]。近年來，MID在抗腫瘤的研究中備受關(guān)注。如鄧大立等[8]闡明MID可通過上調(diào)miR-137表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡；Sun等[9]闡述MID能抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的MID(0，10，20，30，40μmoL/L)干預(yù)Eca109細(xì)胞后，隨著MID濃度的升高，Eca109細(xì)胞存活率顯著下降，且MID濃度為30μmoL/L時(shí)，細(xì)胞存活率接近50%，因此選用30μmoL/L MID用于后續(xù)研究；另外，本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)30μmoL/L MID干預(yù)的Eca109細(xì)胞增殖能力、S期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例增加，這與報(bào)道[7，9]是一致的，提示MID可能通過抑制Eca109細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并將細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞分裂的方式來發(fā)揮抗腫瘤作用。

miRNA是一種由22個(gè)左右的核苷酸組成的非編碼的小分子單鏈RNA，其與mRNA的3‘端非編碼區(qū)以完全或不完全互補(bǔ)的方式相互作用，促進(jìn)mRNA降解，進(jìn)而抑制mRNA翻譯。miRNA對(duì)多種基因具有調(diào)控作用，在細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期等細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。一些miRNAs具有抑癌基因的功能，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。另一些miRNAs具有原癌基因的功能，能抑制抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。miR-875-5p作為一種與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的miRNA，已有研究報(bào)道，miR-875-5p通過抑制SATB2促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲[10]；miR-875-5p在甲狀腺癌中高表達(dá)，其上調(diào)可誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞增殖[11]。表明miR-875-5p在多種腫瘤中具有致癌的作用。本研究通過采用高通量miRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析篩選出miR-875-5p在MID處理的Eca109細(xì)胞中顯著下調(diào)，同時(shí)通過qRT-PCR驗(yàn)證了MID干預(yù)可抑制Eca109細(xì)胞中miR-875-5p表達(dá)，證明MID確實(shí)可引起miR-875-5p的下調(diào)。本研究結(jié)果同樣證實(shí)了miR-875-5p具有促癌作用，本研究發(fā)現(xiàn)miR-875-5p在Eca109細(xì)胞中高表達(dá)；抑制miR-875-5p表達(dá)可顯著抑制Eca109細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、G0/G1期細(xì)胞比例增加；過表達(dá)miR-875-5p可逆轉(zhuǎn)MID對(duì)Eca109細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的作用，同時(shí)還可逆轉(zhuǎn)MID對(duì)裸鼠體內(nèi)移植瘤生長的抑制作用。提示MID通過下調(diào)miR-875-5p抑制Eca109細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期。

為了進(jìn)一步探究MID通過下調(diào)miR-875-5p抑制Eca109細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞周期的具體機(jī)制，本研究通過starbase網(wǎng)站預(yù)測和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)STAG2是miR-875-5p的靶基因。STAG2是黏著蛋白復(fù)合物的亞基成分之一，其在有絲分裂或減數(shù)分裂過程中姐妹染色單體的正常分離中起著重要的作用。據(jù)報(bào)道，STAG2 突變可以改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄程序，從而促進(jìn)侵襲性癌癥表型[12]；STAG2在宮頸癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，過表達(dá)STAG2可抑制宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲[13]。本研究結(jié)果與上述研究是一致的，本研究結(jié)果表明，STAG2在Eca109細(xì)胞中低表達(dá)；MID能夠上調(diào)Eca109細(xì)胞中STAG2 mRNA及蛋白表達(dá)水平；過表達(dá)miR-875-5p則逆轉(zhuǎn)MID處理對(duì)Eca109細(xì)胞中STAG2表達(dá)的促進(jìn)作用。表明miR-875-5p通過靶向STAG2，可能是MID調(diào)控Eca109細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期的重要途徑。

綜上所述，在Eca109細(xì)胞中miR-875-5p高表達(dá)，STAG2低表達(dá)，MID通過下調(diào)miR-875-5p水平靶向促進(jìn)STAG2的表達(dá)，從而抑制Eca109細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。該研究為MID對(duì)食管癌的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，為食管癌的治療提供新的方向。但是MID對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用涉及的分子機(jī)制較多，有待后續(xù)進(jìn)一步深入探究。