朱峰，張艷梅，趙虎，王詩雯

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是嚴(yán)重危害人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，我國(guó)老年CRC 發(fā)病率和病死率逐年上升［1］。近年來，盡管針對(duì)老年CRC 患者的診斷和治療方面取得了一些進(jìn)展，但大多數(shù)CRC 患者預(yù)后仍較差［2］，因此，急需篩選新的分子靶標(biāo)并闡明其功能，為老年CRC 患者的治療提供新的策略。氧化應(yīng)激（Oxidative stress）可誘發(fā)糖尿病、心血管疾病、癌癥等多種老年疾病，并已被證明與老年CRC 的發(fā)生密切相關(guān)［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可誘發(fā)慢性炎癥性腸病如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，進(jìn)而引發(fā)CRC［3］。SRXN1（Sulfiredoxin1）是一種抗氧化蛋白，在多種惡性腫瘤中具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的功能［5］，但其在CRC 中的作用機(jī)制尚未闡明。因此，本文通過分析SRXN1 在老年CRC 中的表達(dá)情況及與腫瘤信號(hào)通路的相關(guān)性，并篩選SRXN1 相互作用蛋白，為進(jìn)一步研究SRXN1 在老年CRC 中的功能提供參考。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞培養(yǎng)CRC 細(xì)胞系SW480 購自武漢普諾賽生物公司。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基（源培）中，于37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1．2 免疫共沉淀將SW480 細(xì)胞于10 cm 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，使用蛋白酶體抑制劑MG132（MCE）處理4～6 h，使用細(xì)胞裂解液（碧云天，P0013）裂解細(xì)胞，收集于1.5 mL EP 管中，4 ℃裂解30 min。裂解后的細(xì)胞懸液置于4 ℃離心機(jī)中，13 000 rpm 離心15 min，吸取80 μL 上清加入20 μL 5 ×loading buffer（雅酶，LT101）作為INPUT 組。將剩余上清均分至兩個(gè)新的1.5 mL EP 管，分別加入2 μg IgG（Rabbit，CST，2729S）與SRXN1（Mouse，Santa Cruz，sc-514940）抗體，置于4℃搖床孵育過夜，分別作為IgG 組與IP 組。孵育后分別加入35 μLProtein A/G PLUS-Agarose（Santa Cruz，sc-2003），4 ℃孵育2 h，用細(xì)胞裂解液漂洗4 次，2 000 rpm 離心2min。棄上清，每管加入50 μL 2 ×loading buffer，100℃變性10 min。

1．3 Western blotting將樣本于100℃金屬浴中預(yù)煮2 min，12 000rpm 離心2 min。使用12.5%濃度的SDS-PAGE 預(yù)制膠（雅酶，PG113）進(jìn)行Western blotting 實(shí)驗(yàn)。將10 μg 制備好的IP 樣本，于濃縮膠中80 V、分離膠中120 V 進(jìn)行蛋白電泳。電泳完成后使用0.25 μm NC 膜（Milipore）轉(zhuǎn)膜，恒流300 mA，75 min。轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉1 h，然后用0.1%TBST 潤(rùn)洗NC 膜3 次，每次5 min。使用SRXN1（Mouse，Santa Cruz，sc-514940）抗體孵育，4 ℃下?lián)u床過夜。0.1%TBST 潤(rùn)洗NC 膜3 次，每次5 min。二抗（Anti-mouse IgG，HRP-linked Antibody，CST，7076S）孵育2 h，0.1%TBST 潤(rùn)洗NC 膜3 次，每次5 min。使用TANON 5200 顯影儀進(jìn)行顯影。

1．4 質(zhì)譜分析將免疫共沉淀后的產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE 膠分離，考馬斯亮藍(lán)染色，純水脫色后，切取目的膠帶，胰蛋白酶消化。后于Q Exactive instrument（Thermo Fisher Scientific）質(zhì)譜儀上進(jìn)行質(zhì)譜分析。使用MaxQuant 軟件（版本1.6.5.0）在肽和蛋白質(zhì)水平上搜索人SwissProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（20 427 個(gè)蛋白質(zhì)）的原始文件，假陽性率＜1%。為實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記定量，使用MaxQuant LFQ 算法對(duì)質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行定量，并使用基于蛋白質(zhì)強(qiáng)度的絕對(duì)定量方法iBAQ 表示蛋白質(zhì)的強(qiáng)度。隨后將每個(gè)樣本的iBAQ 換算為FOT（1 個(gè)蛋白質(zhì)的iBAQ 除以所有識(shí)別出的蛋白質(zhì)的總iBAQ）。使用FOT 乘以106 來表示每個(gè)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化豐度，以3 個(gè)重復(fù)序列的平均值計(jì)算折疊變化，并用t檢驗(yàn)來檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1．5 數(shù)據(jù)分析利用在線網(wǎng)站Ualcan（http：/ /ualcan.path.uab.edu/）分析SRXN1 在CRC 患者中的mRNA水平，利用在線網(wǎng)站GEPIA 2（http：/ /gepia2.cancerpku.cn/）對(duì)微衛(wèi)星穩(wěn)定型CRC 患者進(jìn)行預(yù)后生存分析，通過在線網(wǎng)站科研者之家（www.home-for-researchers.com）從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：/ /portal.gdc.com）獲得了CRC 患者的RNAseq 數(shù)據(jù)和臨床信息。收集相應(yīng)通路中包含的基因，通過R 軟件GSVA包進(jìn)行分析，選擇參數(shù)method＝‘ssgsea’，最后通過斯皮爾曼相關(guān)性分析來分析基因與通路得分的相關(guān)性。以上所有分析方法和R 軟件包均使用v4.0.3 版R軟件執(zhí)行。P＜0.05 被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 SRXN1 在老年CRC 患者組織中高表達(dá)且與預(yù)后不良相關(guān)利用在線網(wǎng)站Ualcan 對(duì)SRXN1 在CRC 患者癌旁組織（n＝41）和腫瘤組織（n＝374）中的表達(dá)水平進(jìn)行差異分析，結(jié)果如圖1a 所示，CRC 患者組織中SRXN1 的mRNA 表達(dá)水平高于癌旁組織（P＝1E－12）。進(jìn)一步分析SRXN1 在不同年齡段中的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1b 所示，SRXN1 的mRNA 水平在大于60 歲患者的CRC 組織中上調(diào)（61～80 歲，P＝1.62E－12；81～100 歲，P＝1.72E－05）。利用在線網(wǎng)站GEPIA 2 對(duì)微衛(wèi)星穩(wěn)定型老年CRC 患者進(jìn)行預(yù)后生存分析發(fā)現(xiàn)（圖1c），SRXN1 高表達(dá)與老年CRC 患者預(yù)后不良顯著正相關(guān)（P＝0.026）。以上發(fā)現(xiàn)提示SRXN1 在老年CRC 中是潛在的抗腫瘤分子靶點(diǎn)。

圖1a CRC 患者組織中SRXN1 的mRNA 表達(dá)水平高于正常組織

圖1b 老年（≥60 歲）CRC 患者組織中SRXN1 的mRNA表達(dá)水平升高

圖1c SRXN1 高表達(dá)與老年CRC 患者預(yù)后不良呈正相關(guān)

2．2 SRXN1 在CRC 中與多種腫瘤信號(hào)通路存在相關(guān)性利用TCGA 數(shù)據(jù)庫，收集相關(guān)通路中包含SRXN1 的基因集合，根據(jù)ssGSEA 算法，依次計(jì)算每條通路上每個(gè)樣本的富集分?jǐn)?shù)，從而得到樣本和通路之間的聯(lián)系，通過斯皮爾曼相關(guān)分析計(jì)算SRXN1 表達(dá)與通路得分相關(guān)性。如圖2所示，SRXN1 在CRC中富集到9 個(gè)相關(guān)功能通路，包括ROS 通路（P＝2.66E－16，Spearman＝0.32）、IL-10 抗炎通路（P＝0.013，Spearman＝0.10）、EMT 標(biāo)記基因（P＝0.011，Spearman＝0.10）、P53 信號(hào)通路（P＝0.001，Spearman＝0.13）、膠原蛋白形成（P＝0.001，Spearman＝0.13）、ECM 降解（P＝1.08E－05，Spearman＝0.18）、DNA 復(fù)制（P＝0.022，Spearman＝0.09）、血管生成（P＝0.011，Spearman＝0.10）、炎性反應(yīng)（P＝0.029，Spearman＝0.09）。其中ROS 通路相關(guān)性最高（Spearman＝0.32），表明SRNX1 與氧化應(yīng)激功能關(guān)系最密切。

圖2 SRXN1 在CRC 中所富集的信號(hào)通路

2．3 利用質(zhì)譜分析SRXN1 相互作用蛋白為進(jìn)一步探索SRXN1 在老年CRC 發(fā)生發(fā)展中的功能，揭示其作用機(jī)制，本研究進(jìn)一步鑒定其相互作用蛋白。在SW480 細(xì)胞系中進(jìn)行免疫共沉淀，取部分最終純化樣品進(jìn)行Western blotting 驗(yàn)證。如圖3所示，加入IgG組作為對(duì)照組，可見加入內(nèi)源性SRXN1 抗體富集到目標(biāo)SRXN1 蛋白，而對(duì)照組位置未出現(xiàn)條帶，表明成功富集到內(nèi)源性SRXN1 蛋白。

圖3 免疫共沉淀成功富集到SRXN1 蛋白

進(jìn)一步利用質(zhì)譜分析篩選出新的可能與SRXN1相結(jié)合的蛋白75 個(gè)（P＜0.05），將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中蛋白豐度比值由高到低排列，前15 個(gè)相互作用蛋白如表1所示，分析發(fā)現(xiàn)，15 個(gè)蛋白中ARMC8、GID8、MAEA 和MKLN1 均為CTLHE3 泛素連接酶復(fù)合體的組成亞基。上述分析提示SRXN1 與CTLH 復(fù)合體間可能存在相互作用。

表1 質(zhì)譜分析篩選出與SRXN1 相互作用的15 個(gè)主要蛋白

3 討論

已有研究表明，SRXN1 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在肝癌中，SRXN1 通過ROS/p65/BTG2信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移［8］；在宮頸癌中，SRXN1 通過Wnt/β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［9］。在結(jié)直腸癌中，SRXN1 可以通過激活EGFR通路及調(diào)控mi143-Fascin 軸促進(jìn)CRC 的侵襲轉(zhuǎn)移［10-11］。本研究利用在線生信網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，SRXN1在老年CRC 患者中高表達(dá)，并且SRXN1 的高表達(dá)與老年CRC 患者預(yù)后不良密切相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SRXN1 在CRC 中與多種腫瘤信號(hào)通路存在相關(guān)性，提示SRXN1 可作為一個(gè)潛在的老年CRC 的治療靶標(biāo)和有前景的腫瘤標(biāo)志物［12-13］。因此，去尋找SRXN1 相互作用蛋白進(jìn)一步揭開它的蛋白網(wǎng)絡(luò)，為了解SRXN1的功能及其功能調(diào)控提供相關(guān)信息，有可能成為老年CRC 治療的突破口。

質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，SRXN1 潛在的75 個(gè)相互作蛋白中有7 個(gè)為CTLH E3 泛素連接酶復(fù)合體的構(gòu)成亞基。該復(fù)合體包括11 個(gè)已知成員：ARMC8、GID4、GID8、MAEA、MKLN1、RMND5A、RMND5B、RANBP9、RANBP10、WDR26 和YPEL5，并且已顯示出E3 泛素連接酶活性［14］。CTLHE3 泛素連接酶所調(diào)控的底物降解與各種細(xì)胞生理和病理過程均密切相關(guān)，包括增殖、生存、程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞粘附和遷移等［15］。有研究報(bào)道，在CRC 細(xì)胞系HCT116 和HT29 中下調(diào)CTLH 復(fù)合體中的核心亞基RANBP9 顯示出對(duì)腫瘤增殖和遷移的促進(jìn)作用［16-17］，提示CTLH 復(fù)合體可能在CRC 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌蛋白作用。因而本研究鑒定到的CTLH 復(fù)合體極有可能通過其泛素連接酶活性介導(dǎo)SRXN1 的泛素化降解從而抑制CRC 的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響CRC 患者的生存預(yù)后。鑒定到的蛋白是否能與SRXN1 蛋白特異結(jié)合及其調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。此外，在鑒定到的SRXN1 潛在的75 個(gè)相互作用蛋白中，HMGA1 也被報(bào)道可促進(jìn)CRC的增 殖 和侵襲轉(zhuǎn)移［18］，HMGA1 與SRXN1 在調(diào)控CRC 的發(fā)生發(fā)展中是否發(fā)揮協(xié)同作用及相關(guān)機(jī)制還有待研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)提示，SRXN1 在老年CRC 發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，是有應(yīng)用前景的治療靶標(biāo)和預(yù)后標(biāo)志物。通過篩選SRXN1 在CRC 中的相互作用蛋白，將為進(jìn)一步闡明SRXN1 在CRC 中的功能提供參考，為老年CRC 患者的靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。