湯蔚峰，魏穎，張曉麗，王文倩，劉寶君

1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200040；2.復(fù)旦大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，上海 200040；3.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200040

支氣管哮喘是1 種氣道異質(zhì)性慢性炎癥性疾病，其患病率及發(fā)病率呈逐年增高趨勢［1-2］。據(jù)報(bào)道［3-4］，老年性哮喘的發(fā)病率僅次于兒童哮喘，我國已步入老齡化社會，老年性哮喘患者隨著年齡的增長而增加。哮喘屬于慢性呼吸系統(tǒng)疾病，病程長，需要長期接受糖皮質(zhì)激素和β2 受體激動劑治療，而長期使用糖皮質(zhì)激素常伴隨嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如白內(nèi)障、青光眼、高血壓以及骨質(zhì)疏松等，導(dǎo)致老年哮喘患者的生存質(zhì)量降低，同時(shí)也增加公共衛(wèi)生支出負(fù)擔(dān)［5］。因此，迫切需要尋求更有效的治療方法，控制哮喘急性發(fā)作，改善哮喘患者的生活質(zhì)量。

針灸在治療支氣管哮喘方面具有明顯的優(yōu)勢，其操作簡單、成本較低、療效顯著、不良反應(yīng)少，其臨床療效已經(jīng)得到國際公認(rèn)。“三穴五針法”是邵經(jīng)明教授積60 余年臨床經(jīng)驗(yàn)治療哮喘取穴的經(jīng)典處方，取穴位有：大椎、風(fēng)門（雙側(cè)）、肺俞（雙側(cè)）［6］。肺俞屬于足太陽膀胱經(jīng)，為主穴，具有調(diào)肺氣、止咳嗽、實(shí)腠理的作用；大椎屬督脈穴，為諸陽之會，有宣陽解表，宣肺平喘的作用；風(fēng)門屬于足太陽膀胱經(jīng)，有鎮(zhèn)咳平喘的作用［6］。既往研究［7］表明，“三穴五針法”針刺可以改善哮喘患者肺功能，降低氣道的高反應(yīng)性，但目前關(guān)于“三穴五針法”針刺治療哮喘的機(jī)制尚不清楚。有研究［8］報(bào)道，哮喘患者血漿中的鐵代謝水平發(fā)生了變化，鐵代謝在鐵死亡中發(fā)揮重要作用［9］，而本團(tuán)隊(duì)前期研究［10］，發(fā)現(xiàn)針刺治療哮喘機(jī)制或與鐵死亡具有相關(guān)性，但鐵代謝是否參與“三穴五針法”針刺治療哮喘的機(jī)制尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)通過“三穴五針法”針刺干預(yù)支氣管哮喘小鼠，觀察該療法的抗哮喘作用及對哮喘小鼠肺組織中鐵代謝紊亂的影響，旨在進(jìn)一步揭示“三穴五針法”針刺治療哮喘的作用機(jī)制，為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物健康雌性SPF 級BALB/c 小鼠40 只（采購于上海杰斯捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司），6～8 周齡，體質(zhì)量（18 ±2） g。所有小鼠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，在濕度（40%～70%）、溫度（20～25℃）的條件下，給予晝夜節(jié)律光照，自由飲食。

1．2 主要設(shè)備與試劑超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備公司），有創(chuàng)小鼠肺功能儀器（美國DSI 公司），離心機(jī)（美國BEKMAN 公司），冷凍組織研磨儀（上海必橫生物科技有限公司），制冰機(jī)（常熟市XUEKE電器有限公司），光學(xué)顯微鏡（日本尼康株式會社），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher 公司），高速梯度PCR 儀（德國耶拿公司），快速轉(zhuǎn)膜儀（南京金斯瑞生物科技有限公司），Western blot 電泳儀、SDS-PAGE 電泳設(shè)備、顯影儀（美國Bio-Rad 公司），卵清蛋白（美國Sigma 公司），組織裂解液（武漢塞維爾生物有限公司），RNA 抽提試劑盒（上?；勰钌锟萍加邢薰荆孓D(zhuǎn)錄試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］，擴(kuò)增試劑盒（武漢愛博泰克生物科技有限公司）。

1．3 動物分組及哮喘模型建立小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按數(shù)字表法隨機(jī)分為4 組，10 只/組：正常對照組（normal control group，NC），哮喘模型組（asthma group，A），針刺組（asthma ＋acupuncture group，AA），假針刺組（asthma ＋sham acupuncture group，ASA）。正常對照組小鼠不給予任何干預(yù)；哮喘模型組小鼠在第0 天及第7 天給予200 μL 致敏液（20 μg OVA ＋2 mg氫氧化鋁）腹腔注射，使小鼠處于致敏狀態(tài)。第14～16 天給予3%卵蛋白超聲霧化吸入，每次30 min左右，至激發(fā)液霧化盡為止，每次20 min；隔間7 d 后，第21～23 天再次給予3%卵蛋白超聲霧化吸入；針刺組小鼠在哮喘造模的基礎(chǔ)上于21～23 d 進(jìn)行針刺（大椎、雙側(cè)風(fēng)門、雙側(cè)肺俞）；假針刺組小鼠則在哮喘造模的基礎(chǔ)上于21～23 d 針刺雙側(cè)環(huán)跳穴［11-12］。穴位的定位依據(jù)參考了《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［13］、以及李辭蓉等［14］和劉海濤等［15］的相關(guān)研究。所有動物實(shí)驗(yàn)按照復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例進(jìn)行，經(jīng)由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1．4 肺功能檢測及動物樣本采集在末次激發(fā)24 h后，對小鼠進(jìn)行取材。按照50 mg/kg 戊巴比妥鈉用量對小鼠進(jìn)行麻醉，之后使用DSI 有創(chuàng)小動物肺功能儀檢測小鼠肺氣道阻力及肺順應(yīng)性，使用乙酰甲膽堿進(jìn)行激發(fā)，濃度梯度為：0、3.125、6.25、12.5 mg/mL；肺功能檢測后，對小鼠進(jìn)行脫頸處死，取右肺中葉，于4%的多聚甲醛中固定24 h，之后進(jìn)行石蠟包埋，切片，予HE 及PAS 染色；其余肺組織置于－80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 HE 染色及PAS 染色分析

1.5.1 HE 染色分析 每張切片選取3 個(gè)及以上視野進(jìn)行觀察，觀察氣道周圍的炎癥細(xì)胞浸潤，對氣道炎癥進(jìn)行評分，評分采用盲法（未知分組），由3 個(gè)人進(jìn)行獨(dú)立評分，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。評分標(biāo)準(zhǔn)分為0～4分，共5 個(gè)等級［16-17］，具體見表1。

表1 小鼠肺組織HE 氣道炎癥評分表

1.5.2 PAS 染色分析 每張切片選取3 個(gè)以上視野進(jìn)行觀察，用Image J 記錄氣道上PAS 陽性染色的細(xì)胞數(shù)，同時(shí)記錄整個(gè)氣道的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞占全部氣道細(xì)胞數(shù)的比值，以此比值為評估PAS 染色的參考數(shù)據(jù)［18］。

1．6 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測小鼠肺組織中鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)從－80 ℃冰箱中取出備用的肺組織，解凍后取20 mg，制備成終濃度為3 μg/μL 的蛋白樣品。蛋白樣品上樣量為30 μg，電泳（80 V，15 min；130 V，40 min）；電泳后使用快速轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（17 min）；轉(zhuǎn)膜后的PVDF 膜使用快速封閉液進(jìn)行封閉（室溫，20 min）；封閉完畢后，將PVDF 膜置于配制好的一抗溶液中進(jìn)行孵育（4 ℃，過夜）；一抗孵育完畢后，TBST 洗脫3 次（10 min/次），進(jìn)行二抗孵育（室溫，90 min）；TBST 洗脫3 次（10 min/次），將需要顯影的條帶浸潤于顯影液中，10 s 后將條帶放入顯影儀中顯色；顯影所得條帶用Image J 分析，計(jì)算各個(gè)目的條帶及內(nèi)參的灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值為最終統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)據(jù)?？贵w信息見表2。

表2 抗體信息

1．7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測鐵代謝相關(guān)蛋白編碼基因mRNA 水平從－80 ℃冰箱中取出備用肺組織，解凍后取20 mg，按照RNA 抽提試劑盒抽提肺組織總RNA，抽提完的RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，20 μL 體系，27 ℃，15 min；85 ℃，5 s；降溫至4 ℃。逆轉(zhuǎn)錄完畢，按照20 μL 體系進(jìn)行擴(kuò)增，95 ℃，3 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40 個(gè)循環(huán)。記錄CT 值后進(jìn)行分析。所使用的引物序列見表3。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用軟件GraphPad Prism 7 （Graph-Pad software，San Diego，Calif.）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 “三穴五針法”針刺改善哮喘小鼠的肺功能對小鼠的氣道阻力（Airway resistance，RL）及動態(tài)肺順應(yīng)性（Dynamic respiratory compliance，Cdyn）進(jìn)行檢測，以評估“三穴五針法”針刺對哮喘小鼠肺功能的影響。如圖1A 所示，與正常對照組小鼠比較，哮喘組小鼠氣道阻力顯著增高，在Mch 濃度為6.25 mg/mL 和12.5 mg/mL 時(shí)，存在顯著性差異；而如圖1B 所示，與正常對照組小鼠比較，哮喘組小鼠的肺順應(yīng)性顯著降低，在Mch 濃度為6.25 mg/mL 和12.5 mg/mL 時(shí)，存在顯著性差異，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明哮喘造模成功。在針刺干預(yù)后，與哮喘組小鼠相比較，針刺組小鼠的氣道阻力在Mch 濃度為6.25 mg/mL 和12.5 mg/mL 時(shí)顯著降低，而肺順應(yīng)性則在Mch 濃度為12.5 mg/mL時(shí)顯著增高。以上結(jié)果說明，“三穴五針法”針刺改善哮喘小鼠的肺功能。此外，假針刺組與哮喘模型組小鼠在RL及Cdyn 上無明顯差異。

圖1 “三穴五針法”針刺對小鼠肺功能的影響

2．2 “三穴五針法”針刺改善哮喘小鼠肺組織炎癥浸潤和杯狀細(xì)胞化生采用HE 染色對小鼠肺組織中炎癥浸潤程度進(jìn)行評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖2A 所示，與正常對照組比較，哮喘模型組氣道周圍存在明顯的炎癥浸潤，而針刺干預(yù)后，小鼠肺組織炎癥浸潤程度明顯減輕，假針刺組則與哮喘模型組無差異。對HE 染色的小鼠肺組織切片進(jìn)行炎癥評分，其數(shù)據(jù)也支持上述結(jié)果（圖2B）。采用PAS 染色評估小鼠肺組織中的杯狀細(xì)胞化生程度，結(jié)果如圖2A 及圖2C 所示，與正常對照相比較，哮喘模型組小鼠肺組織PAS 陽性細(xì)胞染色占比顯著增加，針刺干預(yù)后，小鼠肺組織的PAS 陽性細(xì)胞占比顯著降低，而假針刺組則與哮喘模型組無差異。以上結(jié)果提示，“三穴五針法”針刺改善哮喘小鼠肺組織炎癥浸潤和杯狀細(xì)胞化生。

圖2 “三穴五針法”針刺對哮喘小鼠肺組織病理的影響

2．3 “三穴五針法”針刺治療哮喘的作用與鐵代謝相關(guān)

2.3.1 肺組織鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（Transferrin receptor，TFR1）、二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（Divalent metal transporter 1，DMT1）、鐵蛋白（Ferritin）、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ferroportin，F(xiàn)PN）是存在于哺乳動物體內(nèi)與鐵代謝相關(guān)的蛋白。通過WB 技術(shù)對小鼠肺組織中的TFR1、DMT1、Ferritin、FPN 表達(dá)水平進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示：與正常對照組比較，哮喘模型組小鼠肺組織中TFR1、DMT1 和Ferritin 表達(dá)水平顯著增高，而FPN 的表達(dá)水平顯著降低；針刺干預(yù)后，與哮喘模型組比較，TFR1、DMT1 和Ferritin 的表達(dá)水平顯著降低，而FPN 的表達(dá)水平則顯著增高；而假針刺組則與哮喘模型組無明顯差異。以上結(jié)果提示，“三穴五針法”針刺治療哮喘的作用或與鐵代謝相關(guān)。

圖3 鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測

2.3.2 肺組織鐵代謝相關(guān)基因mRNA 水平檢測 為進(jìn)一步明確鐵代謝參與“三穴五針法”針刺治療哮喘的機(jī)制，采用qRT-PCR 技術(shù)對鐵代謝相關(guān)蛋白的編碼基 因TFR1、TFR2、ZIP14、FTL、FTH、NRAMP1、HEPC1 在小鼠肺組織中的mRNA 水平進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示如圖4所示，與正常對照組比較，哮喘模型組小鼠肺組織中的TFR1、TFR2、ZIP14、FTL、FTH、NRAMP1、HEPC1 mRNA 水平顯著增高；針刺干預(yù)后，與哮喘模型組比較，小鼠肺組織中的TFR1、TFR2、ZIP14、FTL、FTH、NRAMP1、HEPC1 mRNA 水平顯著降低；假針刺組與哮喘組無明顯差異。

圖4 鐵代謝相關(guān)蛋白編碼基因qRT-PCR 結(jié)果

3 討論

本研究首先通過小鼠肺功能檢測，小鼠肺組織HE 及PAS 染色法明確了“三穴五針法”針刺對哮喘的治療作用。結(jié)果表明“三穴五針法”針刺顯著改善了哮喘小鼠的肺功能，降低了哮喘小鼠肺組織的炎癥浸潤水平及杯狀細(xì)胞化生程度。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，“三穴五針法”針刺可以顯著減輕哮喘癥狀，改善哮喘小鼠肺組織的病理改變，其機(jī)制可能與調(diào)控鐵代謝相關(guān)分子的表達(dá)相關(guān)。

近年來的研究表明，鐵代謝在支氣管哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用。哮喘患者血漿的鐵水平與哮喘的癥狀具有相關(guān)性，且鐵螯合劑可以改善哮喘小鼠的呼吸道癥狀［8］。同時(shí)，鐵代謝也是鐵死亡相關(guān)的重要生物學(xué)進(jìn)程。機(jī)體內(nèi)的鐵主要由腸道吸收二價(jià)鐵（F2＋），F(xiàn)2＋轉(zhuǎn)化為三價(jià)鐵（F3＋）后，經(jīng)由轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，TF）及膜蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TFR1）轉(zhuǎn)入胞內(nèi)。胞內(nèi)的F3＋被還原成F2＋，經(jīng)由二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DMT1）或者鋅鐵調(diào)控蛋白14（ZRT/ IRT-like proteins 14，ZIP14）介導(dǎo)F2＋與鐵蛋白（Ferritin）結(jié)合，儲存在細(xì)胞內(nèi)，鐵蛋白由鐵蛋白重鏈（Ferritin heavy chain，F(xiàn)TH）和鐵蛋白輕鏈（Ferritin heavy chain，F(xiàn)TL）組成［19］。而多余的鐵將由膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FPN）輸出到血液中，參與鐵的再循環(huán)，F(xiàn)PN 是哺乳動物體內(nèi)唯一的鐵輸出蛋白［20］。F2＋不穩(wěn)定，可以通過芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生羥自由基（·OH），促進(jìn)脂質(zhì)過氧物和氫過氧化物的合成，造成細(xì)胞膜的破壞，進(jìn)而誘導(dǎo)鐵死亡［21］。既往研究表明，鐵超載條件下鐵調(diào)素（Hepcidin，HEPC1）的表達(dá)水平增高，而在鐵缺乏條件下，鐵調(diào)素的表達(dá)降低［22］，此外，其可以負(fù)向調(diào)節(jié)FPN 的表達(dá)［23］，是鐵穩(wěn)態(tài)的負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)制。天然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白1（Natural resistance-associated macrophage protein 1，NRAMP1）是二價(jià)鐵的吞噬酶體轉(zhuǎn)運(yùn)體，參與鐵的代謝［24］。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在OVA 誘導(dǎo)的哮喘模型中，鐵轉(zhuǎn)入蛋白TFR1、DMT1 和鐵儲存蛋白Ferritin 發(fā)生了高表達(dá)，鐵轉(zhuǎn)出蛋白FPN 發(fā)生了低表達(dá)，說明在哮喘模型中，肺組織發(fā)生了鐵過載。同時(shí)ZIP14、TFR1、TFR2、FTL、FTH、HEPC1、NRAMP1 mRNA 水平的增高也支持肺組織鐵水平的增高的結(jié)論。而既往的研究表明，哮喘患者體內(nèi)發(fā)生了鐵過載，哮喘患者血漿中的鐵水平顯著高于正常人［25］，鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1 可以通過抑制TFR1、DMT1 表達(dá)，改善哮喘的癥狀［26］。在針刺干預(yù)后，與哮喘模型組相比，小鼠肺組織中鐵轉(zhuǎn)入蛋白TFR1、DMT1 和鐵儲存蛋白Ferritin 發(fā)生了低表達(dá)，而鐵轉(zhuǎn)出蛋白FPN 發(fā)生了高表達(dá)，說明肺組織中鐵的攝入減少，鐵的排出增多，肺組織鐵水平下降［20］。qRT-PCR 結(jié)果顯示，針刺降低ZIP14、TFR1、TFR2、FTL、FTH、HEPC1、NRAMP1 mRNA 水平。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，“三穴五針法”針刺可以調(diào)節(jié)OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺組織鐵代謝紊亂，調(diào)控鐵代謝相關(guān)分子的表達(dá)水平，這可能是“三穴五針法”針刺治療哮喘的機(jī)制之一，為相關(guān)研究提供了新的思路?，F(xiàn)有的研究仍有不足之處，一是針刺調(diào)控小鼠肺組織的鐵代謝的途徑尚未明確；二是尚不清楚針刺是否通過調(diào)節(jié)肺組織的鐵代謝影響肺組織細(xì)胞的鐵死亡發(fā)揮治療哮喘的作用。在后續(xù)的研究中，計(jì)劃對鐵代謝調(diào)節(jié)分子的上游分子進(jìn)行檢測，同時(shí)增加鐵死亡的相關(guān)指標(biāo)檢測，以進(jìn)一步闡明“三穴五針法”針刺治療哮喘與肺組織鐵代謝紊亂調(diào)節(jié)的關(guān)聯(lián)。