邵 笑，魏從文，閔 敏，董瑞華,4

胃癌(gastric cancer，GC)是五大常見腫瘤之一，目前中國(guó)已經(jīng)成為胃癌發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)均居高位的國(guó)家[1]。探尋新的治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高胃癌療效，改善預(yù)后有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值[2]。

環(huán)指蛋白43 (ring finger 43，RNF43)具有環(huán)狀的泛素連接酶結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)，屬于跨膜的E3泛素連接酶[3-4]。研究[5]表明RNF43可以與Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的受體蛋白Frizzled結(jié)合，泛素化卷曲受體蛋白并誘導(dǎo)該蛋白降解，進(jìn)而抑制Wnt信號(hào)通路的活性發(fā)揮抑癌作用。前期研究[6]表明RNF43在胃癌中的表達(dá)較高，其作為胃癌中的生物標(biāo)志物具有較高的研究?jī)r(jià)值。目前針對(duì)RNF43泛素化底物蛋白的研究較少，該實(shí)驗(yàn)通過對(duì)RNF43作用新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證，進(jìn)一步明確RNF43在胃癌細(xì)胞中的分子機(jī)制，為胃癌的靶向治療提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒人胃腺癌細(xì)胞AGS由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院八所四室保存；不同標(biāo)簽的RNF43質(zhì)粒(Flag-RNF43、HA-RNF43、GFP-RNF43)、第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN)質(zhì)粒Flag-PTEN、HA-PTEN購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)責(zé)任有限公司；泛素(Ubiquitin, Ub)質(zhì)粒Myc-Ub及泛素48位、63位特異性泛素化的質(zhì)粒Myc-Ub(K48)、Myc-Ub(K63)由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑RPIM-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gbico公司；α-tubulin抗體購(gòu)于美國(guó)Cell signaling technology公司；抗RNF43、PTEN抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于法國(guó)Ployplus公司；PTEN選擇性抑制劑bpV (Hopic)、蛋白酶體抑制劑MG132購(gòu)于美國(guó)Selleck公司；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購(gòu)于日本東仁化學(xué)科技有限公司；ANNEXIN V- FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Solarbio公司。

1.3 主要儀器恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號(hào)：3111)、超凈工作臺(tái)(型號(hào)：1384)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)于尼康儀器上海有限公司；恒壓恒流電泳儀(型號(hào)：164-5052)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；快速轉(zhuǎn)膜儀(型號(hào)：NovexTM)、流式細(xì)胞儀(型號(hào)：Attune NxT)購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)：Spark 20M)購(gòu)于瑞士TECAN公司。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清的RIPM-1640細(xì)胞培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)AGS細(xì)胞。注意觀察培養(yǎng)基顏色以及顯微鏡下細(xì)胞密度，及時(shí)給細(xì)胞更換培養(yǎng)基、傳代。

1.4.2細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 準(zhǔn)備四皿人胃腺癌細(xì)胞AGS，其中一皿作為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染前更換細(xì)胞培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度為80%左右時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。分別準(zhǔn)備3個(gè)1.5 ml EP管，管中分別加入2、4、8 μg RNF43綠色熒光質(zhì)粒和200 μl buffer緩沖液，震蕩15 s后靜置5 min；再分別加入4、8、16 μl轉(zhuǎn)染試劑，震蕩15 s后靜置10 min。將混合液分別轉(zhuǎn)移至3皿AGS細(xì)胞中，4～6 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)基，24 h后顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光或收集細(xì)胞樣品，觀察細(xì)胞熒光前用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行藍(lán)色熒光染色。

1.4.3Western blot分析 準(zhǔn)備四皿AGS細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染0、1、2、4 μg的Flag-RNF43。收集不同處理組細(xì)胞，裂解后離心收集上清液。用BCA法測(cè)定蛋白樣品濃度并加入SDS高溫煮沸制備蛋白樣品。用SDS-PAGE分離膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉；一抗4 ℃孵育過夜(α-tubulin抗體稀釋比例為1 ∶5 000；HA、Flag、Myc標(biāo)簽抗體稀釋比例為1 ∶2 000；RNF43、PTEN抗體稀釋比例為1 ∶1 000)，TBST洗滌后二抗孵育1～2 h(山羊抗兔、山羊抗小鼠抗體稀釋比例為1 ∶5 000)，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。以α-tubulin條帶為內(nèi)參對(duì)照，Image J軟件分析RNF43及PTEN的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.4免疫共沉淀分析 準(zhǔn)備六皿AGS細(xì)胞，其中三皿中同時(shí)過表達(dá)HA-RNF43、Flag-PTEN和Myc-UB(WT、K48、K63)；另外三皿中分別過表達(dá)HA標(biāo)簽的空載體質(zhì)粒：HA-Vector、Flag-PTEN和Myc-UB(WT、K48、K63)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理24 h后，加入NP40裂解液冰上裂解30 min，離心取上清液。上清液分成兩部分：一部分直接加入SDS，水浴煮沸制備Input細(xì)胞蛋白樣品；另一部分加入Flag標(biāo)簽的磁珠，4 ℃搖床孵育過夜，離心棄去上清液，NP40洗液反復(fù)清洗磁珠3次后制備IP細(xì)胞蛋白樣品。注意細(xì)胞收樣前8 h加入40 nmol/ml的蛋白酶體抑制劑MG132。

1.4.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 Bisperoxovanadium (HOpic)[bpV (HOpic)]是一種有效的和具有選擇性的PTEN抑制劑，其IC50為14 nmol/L[7]。將AGS細(xì)胞分組，分別用bpV (HOpic)、RNF43處理。將不同處理組的AGS細(xì)胞接種至96孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后6、12、24、36、48、72 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)的吸光度值，繪制增殖曲線來評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。

1.4.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將AGS腫瘤細(xì)胞分為Control組、RNF43組、bpV (HOpic)組及RNF43+bpV (HOpic)組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣品。48 h后將不同處理組的AGS細(xì)胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化，PBS清洗2次，收集細(xì)胞。加入150 μl結(jié)合液將細(xì)胞重懸轉(zhuǎn)移至流式管中，分別加入5 μl AnnexinV-FITC、PI避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)AGS細(xì)胞凋亡情況(Q3為早期凋亡細(xì)胞，Q2為晚期凋亡細(xì)胞，通過計(jì)算Q2與Q3細(xì)胞分布總和，計(jì)算細(xì)胞凋亡總比例)。

1.4.7劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將AGS腫瘤細(xì)胞分成Control組、RNF43組、bpV (HOpic)組及RNF43+bpV (HOpic)組，在6孔板中培養(yǎng)、處理AGS，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞密度達(dá)到100%后用200 μl無菌移液槍頭垂直與板面劃痕，每孔劃痕PBS洗滌3次后加入不含血清的培養(yǎng)基，在顯微鏡下觀察劃痕兩側(cè)細(xì)胞在0、12、24 h的遷移情況，拍照記錄，Image J軟件分析劃痕寬度變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次。多組樣本間比較采用單、雙因素方差分析，兩兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNF43在AGS細(xì)胞中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染隨著RNF43轉(zhuǎn)染量的增加，細(xì)胞綠色熒光增加。藍(lán)色熒光為DAPI對(duì)AGS細(xì)胞核的染色。見圖1。

圖1 GFP-RNF43在AGS中的表達(dá) ×40a: DPAI藍(lán)色染細(xì)胞核；B: 綠色熒光標(biāo)記2 μg RNF43蛋白表達(dá)；C: 綠色熒光標(biāo)記4 μg RNF43蛋白表達(dá)；D: 綠色熒光標(biāo)記8 μg RNF43蛋白表達(dá)；藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核

2.2 RNF43對(duì)PTEN蛋白表達(dá)水平的影響Western blot結(jié)果顯示，隨著RNF43的表達(dá)量增加，內(nèi)源PTEN的蛋白表達(dá)量也隨之增加，其中過表達(dá)2、4 μg RNF43時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.38，P<0.01，P<0.001)，見圖2A、B。免疫共沉淀結(jié)果顯示RNF43與PTEN存在相互作用，見圖2C。

圖2 AGS中RNF43與PTEN的相互作用A：RNF43對(duì)AGS細(xì)胞內(nèi)源PTEN蛋白表達(dá)水平的影響；B：PTEN的內(nèi)源蛋白水平變化；C：RNF43與PTEN的蛋白相互作用；a～d:Flag-RNF43的轉(zhuǎn)染量0、1、2、4 μg；與Control組(0 μg)比較：**P<0.01，***P<0.001

2.3 RNF43對(duì)PTEN的蛋白表達(dá)泛素化修飾的影響Western blot結(jié)果顯示，在AGS過表達(dá)RNF43之前，AGS細(xì)胞內(nèi)即存在蛋白水平的泛素化調(diào)控，而當(dāng)AGS中RNF43蛋白水平高表達(dá)后，細(xì)胞的泛素化水平增強(qiáng)，PTEN蛋白表達(dá)增強(qiáng)。其中以泛素分子K63位點(diǎn)進(jìn)行特異性泛素化修飾的蛋白水平顯著增加：Ub(K63)+ RNF43組與Ub(K63)對(duì)照組的Ub蛋白水平存在差異(t=5.081，P=0.037)；Ub(K63)+ RNF43組與Ub(WT)+ RNF43組的Ub蛋白水平存在差異(t=6.945，P=0.020)。見圖3。說明RNF43主要通過K63的泛素化方式靶向修飾PTEN并增加PTEN的蛋白表達(dá)水平。

圖3 RNF43對(duì)PTEN的泛素化修飾A：AGS不同處理組的RNF43、PTEN及Ub的蛋白表達(dá)情況；B：AGS不同處理組中Ub的蛋白相對(duì)表達(dá)量；a:AGS高表達(dá)Ub組；b:AGS高表達(dá)Ub(K48)組；c:AGS高表達(dá)Ub(K63)組；d:AGS高表達(dá)Ub和RNF43組；e:AGS高表達(dá)Ub(K48)和RNF43組；f:AGS高表達(dá)Ub(K63)和RNF43組；與AGS高表達(dá)Ub(K63)組比較：*P<0.05；與AGS高表達(dá)Ub和RNF43組比較：#P<0.05

2.4 RNF43通過增加PTEN的表達(dá)對(duì)AGS細(xì)胞增殖的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于Control組，RNF43組AGS腫瘤細(xì)胞增殖能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.46，P<0.01)；而相較于RNF43組，bpV (HOpic)+RNF43組AGS腫瘤細(xì)胞增殖能力提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.26，P<0.05)。見圖4。表明RNF43可通過增加PTEN的表達(dá)來抑制AGS腫瘤細(xì)胞的增殖。

圖4 CCK-8檢測(cè)AGS細(xì)胞增殖變化與RNF43組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.5 RNF43通過增加PTEN的表達(dá)對(duì)AGS細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果中Q2、Q3比例之和為腫瘤細(xì)胞凋亡的比例。Control組凋亡細(xì)胞占總腫瘤細(xì)胞數(shù)量的16.95%；bpV (HOpic)組48 h之后凋亡細(xì)胞比例為8.79%；RNF43組凋亡細(xì)胞比例為43.66%，細(xì)胞凋亡比例增加；bpV (HOpic)+RNF43組細(xì)胞凋亡比例為35.29%。與Control組相比，RNF43組AGS腫瘤細(xì)胞凋亡比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.87，P=0.000 4)；與RNF43組相比，bpV (HOpic)+RNF43組AGS腫瘤細(xì)胞凋亡減少，活細(xì)胞數(shù)量增加(t=3.341，P=0.028 8)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。說明加入RNF43之后加強(qiáng)了AGS腫瘤細(xì)胞內(nèi)源PTEN的表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞活性抑制加強(qiáng)，使腫瘤細(xì)胞凋亡增加。

圖5 AGS細(xì)胞凋亡變化A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)AGS不同處理組細(xì)胞凋亡情況；B：AGS腫瘤細(xì)胞活性情況直方圖；a:Control組；b:bpV (HOpic)組；c:RNF43組；d: bpV (HOpic)+RNF43組；與RNF43組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.6 RNF43通過增加PTEN的表達(dá)對(duì)AGS遷移的影響細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞劃痕之間間隙逐漸縮?。慌cControl組相比，RNF43組AGS腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)速度緩慢(t12 h=45.65，t24 h=88.03，P<0.000 1)；與RNF43組相比，bpV (HOpic)+RNF43組AGS腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)速度較快(t12 h=14.71，t24 h=39.70，P<0.000 1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間遷移能力的變化差異表明RNF43對(duì)PTEN的表達(dá)起到了增強(qiáng)作用,并抑制了AGS的遷移。見圖6。

圖6 AGS細(xì)胞遷移能力的變化A：AGS不同處理組細(xì)胞遷移能力變化；B：AGS不同處理組細(xì)胞遷移率直方圖；與RNF43組比較：***P<0.001

3 討論

胃癌患者臨床前期癥狀無特異性，確診時(shí)大多已進(jìn)入進(jìn)展期或晚期，預(yù)后較差。尋找胃癌新的分子靶點(diǎn)，對(duì)改善胃癌患者的臨床療效具有重要意義[8]。近年來RNF43被認(rèn)為是胃癌的發(fā)生發(fā)展中重要的生物標(biāo)志物，研究[9]表明RNF43是Wnt信號(hào)通路經(jīng)典的拮抗劑，其主要通過與卷曲蛋白frizzled結(jié)合并對(duì)其進(jìn)行泛素化降解來抑制信號(hào)通路的活性，RNF43也可以通過影響T細(xì)胞因子4在細(xì)胞內(nèi)的聚集來發(fā)揮Wnt信號(hào)通路拮抗劑的作用[10]。PTEN作為抑癌基因在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)[11]，而泛素化是影響PTEN蛋白表達(dá)的重要調(diào)控機(jī)制——PTEN的單泛素化可以促進(jìn)PTEN的核轉(zhuǎn)移，使其在細(xì)胞中表達(dá)增加，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[12]。

該研究探討了在人胃腺癌細(xì)胞AGS中RNF43的蛋白表達(dá)、對(duì)細(xì)胞內(nèi)源PTEN蛋白表達(dá)以及對(duì)AGS細(xì)胞功能的影響。RNF43在腫瘤中的作用是多樣的：它在結(jié)直腸癌、胃癌、大腸癌等消化道腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，而在肝癌中則可以加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這種不同腫瘤中抑癌與促癌作用的差異，推測(cè)與RNF43特異性的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。泛素化是蛋白質(zhì)修飾的重要方式之一，而E3連接酶在這一過程中發(fā)揮重要作用。從結(jié)構(gòu)上來說，RNF43屬于E3連接酶，可以通過對(duì)不同的底物蛋白進(jìn)行泛素化修飾，使蛋白降解或表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而加速細(xì)胞的凋亡或增殖。本研究中的泛素化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PTEN是RNF43泛素化修飾的底物蛋白，RNF43的蛋白高表達(dá)會(huì)使AGS細(xì)胞內(nèi)源PTEN蛋白表達(dá)增加。實(shí)驗(yàn)中AGS細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)均證明了RNF43對(duì)PTEN蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用會(huì)進(jìn)一步影響細(xì)胞功能。然而，研究[13]已知PTEN主要在PI3K/AKT通路中發(fā)揮重要調(diào)控作用，所以RNF43對(duì)PTEN蛋白表達(dá)水平的影響是否會(huì)間接影響PI3K/AKT信號(hào)通路的活性仍需要繼續(xù)探究。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)表明，在人胃腺癌細(xì)胞AGS中，RNF43蛋白表達(dá)增加會(huì)使PTEN蛋白表達(dá)水平升高，并且PTEN是RNF43泛素化修飾的底物蛋白。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)RNF43會(huì)通過影響PTEN的蛋白表達(dá)抑制AGS腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移并加速其凋亡。因此，RNF43不僅可以作為胃癌患者預(yù)后指標(biāo)，同時(shí)它可通過調(diào)控不同蛋白的表達(dá)發(fā)揮抑癌作用，是重要的抑癌靶點(diǎn)，具有一定的深入研究?jī)r(jià)值。