孫二燦，肖巧玲，夏飛飛，劉 喆，徐 江，黎昌學(xué)

口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是以組織浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移傾向?yàn)樘卣鞯膼盒阅[瘤，其發(fā)病率在所有癌癥中排名第六，全球每年新增OSCC病例超過20萬例[1]。手術(shù)聯(lián)合化療可以提高OSCC患者的總生存期，術(shù)前化療可縮小腫瘤，術(shù)后化療可預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。因此，進(jìn)一步研究OSCC的發(fā)病機(jī)制，尋找OSCC預(yù)后和靶向治療的有效分子標(biāo)志物，具有重要的臨床意義。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號(hào)通路調(diào)節(jié)許多不同的細(xì)胞過程。該通路的異常激活常見于肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌[2]。尿激酶纖溶酶原激活劑(urokinase plasminogen activator，PLAU)編碼一種絲氨酸蛋白酶，該蛋白酶與其受體結(jié)合后促進(jìn)蛋白質(zhì)水解，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞間質(zhì)的降解[3]。因此，PLAU在腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，關(guān)于PLAU和蛋白激酶B1(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1，AKT1)在OSCC中的關(guān)系的報(bào)道較少。該研究通過檢測(cè)AKT1和PLAU在OSCC及正常組織中的表達(dá)，探討其與OSCC臨床病理及預(yù)后特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2008—2012年在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院治療的106例OSCC和73例正常組織(對(duì)照組)。課題組選取術(shù)前未接受任何治療和不存在其他癌癥的患者，最終獲取臨床病理資料和隨訪信息完整的70例OSCC組織(OSCC組)和50例正常組織制成組織(對(duì)照組)芯片，隨訪截止日期為2020年7月30日。本研究經(jīng)石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色采用EnVision兩步法，將組織芯片切成4 μm吸附在載玻片上去脂水合，在EDTA緩沖液中熱誘導(dǎo)提取抗原，在3%過氧化氫中阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，用3%的牛血清阻斷非特異性抗原的染色，孵育一抗PLAU(1 ∶50，貨號(hào)ab133563)和AKT1(1 ∶100，貨號(hào)ab81283)(英國Abcam公司)在4 ℃下培養(yǎng)過夜，DAB顯色液顯色1 min后蘇木精復(fù)染封片。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由2名病理醫(yī)師采用雙盲方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，免疫反應(yīng)總分(immunoreactive score，IRS)計(jì)算為陽性細(xì)胞百分比乘以細(xì)胞著色強(qiáng)度(表1)。根據(jù)IRS值，結(jié)果分為兩組，其中≤6分為低表達(dá)組，>6分為高表達(dá)組。

表1 免疫組織化學(xué)評(píng)分表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)分析PLAU和AKT1的表達(dá)水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性，使用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，采用Spearman秩和檢驗(yàn)分

總分=陽性細(xì)胞所占百分比分值×著色強(qiáng)度分值

別確定PLAU和AKT1在OSCC和正常組織表達(dá)的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證為了提高實(shí)驗(yàn)的可信度，使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證。GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)是一個(gè)在線分析網(wǎng)站，其包含數(shù)據(jù)來自TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫的9 736個(gè)腫瘤樣本和8 587個(gè)正常樣本的數(shù)據(jù)[4]。課題組首先使用GEPIA來研究OSCC和正常組織中PLAU和AKT1的表達(dá)差異，隨后課題組評(píng)估PLAU和AKT1在OSCC中高低表達(dá)與患者預(yù)后之間的聯(lián)系。最后使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分別驗(yàn)證PLAU和AKT1的表達(dá)在OSCC和正常組織的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 PLAU和AKT1在OSCC中表達(dá)情況及與臨床病理特征的關(guān)系PLAU主要分布在OSCC細(xì)胞胞質(zhì)或(和)細(xì)胞膜上，AKT1主要分布在OSCC細(xì)胞細(xì)胞核或(和)細(xì)胞胞質(zhì)，均呈棕黃色或黃褐色(圖1)。PLAU和AKT1在OSCC組織陽性表達(dá)率高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，見表2，PLAU和AKT1表達(dá)與OSCC患者年齡、性別、TNM分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、吸煙史、飲酒史等均無關(guān)(P>0.05)，見表3。

表2 OSCC及正常組織中PLAU和AKT1的表達(dá)(n)

表3 OSCC中PLAU和AKT1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

圖1 PLAU和AKT1在OSCC和正常組織中表達(dá)情況A1、A2：PLAU在OSCC組織中表達(dá)；A3、A4：PLAU在正常組織中表達(dá)；B1、B2:AKT1在OSCC組織中表達(dá)；B3、B4：AKT1在正常組織中表達(dá)；A1、A3、B1、B3：×100；A2、A4、B2、B4：×400

2.2 OSCC中PLAU和AKT1表達(dá)與患者的預(yù)后關(guān)系采用Kaplan-Meier分析PLAU和AKT1表達(dá)是否可以作為預(yù)測(cè)OSCC預(yù)后的指標(biāo)，并繪制生存曲線檢測(cè)了70例有完整隨訪資料的OSCC患者的PLAU和AKT1表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系。分析結(jié)果顯示PLAU和AKT1高表達(dá)組患者術(shù)后生存時(shí)間短于低表達(dá)組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 PLAU和AKT1表達(dá)與OSCC患者預(yù)后的生存分析

2.3 OSCC中PLAU和AKT1表達(dá)的關(guān)系相關(guān)性分析顯示，在OSCC組織樣本中PLAU和AKT1呈明顯相關(guān)性(r=0.357，P=0.002)，見表4。在正常組織樣本中PLAU和AKT1無明顯相關(guān)性(r=0.24，P=0.094)，其中r為相關(guān)系數(shù)，見表5。

表4 OSCC織中PLAU與AKT1表達(dá)的關(guān)系

表5 正常組織中PLAU與AKT1表達(dá)的關(guān)系

2.4 PLAU和AKT1在生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫中驗(yàn)證結(jié)果生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證結(jié)果顯示PLAU和AKT1在OSCC中表達(dá)高于正常組織(P<0.05)，見圖3A、B。同樣，在OSCC中，PLAU和AKT1高表達(dá)的生存時(shí)間短于PLAU和AKT1低表達(dá)患者生存時(shí)間(P<0.05)，見圖3C、D。最后，PLAU和AKT1相關(guān)性分析顯示，在OSCC中，PLAU和AKT1表達(dá)有明顯相關(guān)性(r=0.35，P<0.001)，在正常組織中，PLAU和AKT1表達(dá)之間沒有相關(guān)性(r=0.26，P=0.088)，見圖3E、F。

圖3 GEPIA數(shù)據(jù)庫對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證A、B：OSCC和正常組織中PLAU和AKT1的表達(dá)差異；T：OSCC組織；N：正常組織；與正常組織比較：*P<0.05；C、D：PLAU和AKT1的表達(dá)與OSCC患者預(yù)后的生存分析；E、F：OSCC和正常組織中PLAU和AKT1表達(dá)的關(guān)系

3 討論

OSCC是一種常見的發(fā)生于口腔部位的惡性腫瘤，約90%的口腔惡性腫瘤都是OSCC[5]。PI3K/AKT信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和凋亡等具有不同的作用，特別是在促進(jìn)細(xì)胞存活和抑制細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用[6]。AKT蛋白家族是PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，其包括AKT1、AKT2和AKT3三個(gè)亞型[7]，雖然各亞型在結(jié)構(gòu)上有顯著的相似性，但其功能卻存在很大差異[8]。研究[9]顯示AKT1在細(xì)胞存活、增殖、腫瘤發(fā)育、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。PLAU是一種能將纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶的絲氨酸蛋白酶，其在喉癌、胃癌和肝癌表達(dá)升高，同時(shí)PLAU的表達(dá)升高與其不良預(yù)后有關(guān)[10-11]。此外，PLAU可促進(jìn)纖維蛋白溶解和細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移與PLAU表達(dá)密切相關(guān)。然而，PLAU和AKT1在OSCC中的功能和機(jī)制依然需要進(jìn)一步探討。

本研究結(jié)果顯示，PLAU和AKT1在OSCC中表達(dá)高于正常組織,表明PLAU和AKT1高表達(dá)在OSCC的發(fā)生發(fā)展起重要作用。隨后課題組對(duì)PLAU和AKT1在OSCC中的表達(dá)與腫瘤分化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、性別、年齡、腫瘤大小、飲酒史和吸煙史等臨床資料進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示與上述臨床資料無明顯相關(guān)性，這可能與課題組收集樣本過少和隨訪時(shí)間較短有關(guān)，需要繼續(xù)收集病例和不斷隨訪。另外，PLAU和AKT1單獨(dú)不能影響OSCC的發(fā)展和分化，需和其他分子一起作用，這可以做進(jìn)一步研究探索。Kaplan-Meier法對(duì)患者生存分析顯示PLAU和AKT1高表達(dá)組的術(shù)后生存時(shí)間明顯短于低表達(dá)組，證明了PLAU和AKT1可以用來判斷OSCC患者預(yù)后。

課題組還研究了OSCC中PLAU和AKT1之間的關(guān)系。PI3K/AKT信號(hào)通路參與腫瘤生長(zhǎng)和血管生成，并能反映腫瘤的惡性程度[12]。此外，有研究[13]表明PLAU可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成。這些表明PI3K/AKT通路與PLAU存在相關(guān)性。與報(bào)道一致，課題組發(fā)現(xiàn)在OSCC中PLAU和AKT1之間存在顯著關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果提示PLAU和AKT1共同促進(jìn)了OSCC的發(fā)生，PLAU和PI3K/AKT信號(hào)通路在OSCC中存在著某種聯(lián)系。

為了提高本研究的可信度，使用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對(duì)PLAU和AKT1在OSCC和正常組織的差異性表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，在OSCC中，PLAU和AKT1表達(dá)明顯升高，且高表達(dá)PLAU和AKT1患者生存時(shí)間明顯縮短，PLAU和AKT1在OSCC和正常組織中相關(guān)性分析進(jìn)行驗(yàn)證，生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示著PLAU和AKT1在OSCC中具有潛在的研究?jī)r(jià)值。