何萍 沈佳 徐丹 王紫燕

蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科（江蘇蘇州 215003）

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）是一組針對中性粒細(xì)胞胞漿顆粒中主要表達(dá)蛋白的自身抗體，通過間接免疫熒光可以區(qū)分ANCA 的不同模式，即細(xì)胞質(zhì)模式、核周模式和不典型模式[1]。不同模式常對應(yīng)不同的靶抗原，如髓過氧化物酶（MPO）與核周型ANCA（p-ANCA）相關(guān)，蛋白酶3（PR 3）與胞漿型ANCA（c-ANCA）相關(guān)。自身抗體，如抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體和抗可提取核抗原（ENA）抗體，以及補(bǔ)體活性的變化可反映系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）疾病活動(dòng)或治療效果[2]。ANCA主要與ANCA相關(guān)血管炎（ANCA-associated vasculitis，AAV）有關(guān)，對于具有臨床特征的AAV患者，ANCA 陽性提供了較高的診斷價(jià)值（約95%的敏感性和90%的特異性）。許多SLE 患者ANCA可以陽性，尤其是p-ANCA。然而ANCA 對于兒童SLE 臨床癥狀、疾病活動(dòng)性和預(yù)后轉(zhuǎn)歸的預(yù)測作用尚不清楚。與成人發(fā)病的SLE 相比，兒童SLE 更具侵襲性，疾病活動(dòng)性更高，診斷時(shí)癥狀更嚴(yán)重，腎臟、心血管和神經(jīng)精神受累的發(fā)生率更高[3]。本研究主要分析p-ANCA 陽性對于兒童SLE 的其他自身抗體、免疫功能、腎功能以及腎臟病理結(jié)果的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2016年1月至2021年7月在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院就診的SLE患兒的臨床資料。研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡1 個(gè)月至18 歲；②依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)制訂的《系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷及治療指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]確診為SLE；③完成血清ANCA 及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查；④排除感染、腫瘤和其他結(jié)締組織病。

SLE 患兒根據(jù)p-ANCA 檢測結(jié)果分為p-ANCA陽性組和p-ANCA陰性組。

本研究通過蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2015LW005），并獲得家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集患兒年齡、性別，自身抗體包括抗雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）抗體、抗史密斯（Smith，Sm）抗體、抗干燥綜合征抗原A（Sj?gren's syndrome antigen A，SSA）抗體、抗硬皮病-70（scleroderma-70，Scl-70）抗體、抗著絲點(diǎn)蛋白B（centromere protein B，CENP-B）抗體、抗干燥綜合征抗原B（Sj?gren's syndrome antigen B，SSB）抗體、抗組氨酰tRNA 合成酶（Jo-1）抗體、抗U1-n核糖核蛋白抗體/史密斯抗體（抗U 1-nRNP/Sm 抗體）、抗組蛋白抗體、抗核糖核蛋白（anti-ribosome ribonucleoprotein，rRNP）抗體、抗核小體抗體、抗Ro-52 抗體、抗多發(fā)性肌炎/硬皮?。╬olymyositis-scleroderma，PM-Scl）抗體、抗增殖細(xì)胞核抗原抗體（proliferating-cell nuclear antigen antibody，PCNA）、抗線粒體抗體-M 2 型（antimitochondrial antibody-M2，AMA-M2）抗體，及免疫功能和腎功能相關(guān)指標(biāo)、腎臟病理檢查結(jié)果。

1.2.2 檢測指標(biāo)及方法 研究對象入院時(shí)抽取9～12 mL靜脈血，以離心力3 000×g離心15 min后，分離血清?？购丝贵w（antinuclear antibodies，ANA）、抗dsDNA 抗體及ANCA采用間接免疫熒光法（IIF）在歐蒙全自動(dòng)熒光酶聯(lián)免疫分析一體機(jī)Sprinter XL檢測，EUROPattern 全自動(dòng)熒光顯微鏡判讀結(jié)果。通過三基質(zhì)ANCA判讀順序排除ANA的干擾。第一張基質(zhì)粒細(xì)胞（乙醇固定）判斷ANCA 陰性或陽性以及cANCA或pANCA。第二張基質(zhì)粒細(xì)胞（甲醛固定）判斷pANCA甲醛敏感或抗性。第三張為Hep-2與粒細(xì)胞混合包被基質(zhì)，①當(dāng)僅存在ANCA時(shí)，可見粒細(xì)胞熒光著色，而Hep-2未見熒光或僅有微弱熒光，在同一視野下粒細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于相鄰的Hep-2細(xì)胞；②當(dāng)同時(shí)存在ANA和ANCA時(shí)可見Hep-2與粒細(xì)胞混合包被基質(zhì)上Hep-2和粒細(xì)胞均有熒光著色，且同一視野下粒細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于相鄰的Hep-2 細(xì)胞；③當(dāng)只存在ANA 時(shí)，Hep-2 與粒細(xì)胞混合包被基質(zhì)上可以觀察到所有細(xì)胞核均有熒光著色，Hep-2和粒細(xì)胞上的熒光強(qiáng)度相似。ANCA相關(guān)特異性靶抗原包括過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、蛋白酶 3（proteinase 3，PR3）和抗腎小球基底膜（glomemlar basement membrane，GBM）抗體檢測采用免疫印跡法在歐蒙EUROLineMaster Plus自動(dòng)免疫印跡AN 儀上測定。所有標(biāo)本均嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行檢測。體液免疫相關(guān)項(xiàng)目包括補(bǔ)體（C3、C4）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM），采用免疫比濁法用西門子ADVIA 2400 全自動(dòng)生化分析儀檢測。尿肌酐（UCr）、尿IgG（UIgG）、α 1 微球蛋白（α 1-MG）、β 1 微球蛋白（β 1-MG）、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白（U-TRF）、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）和尿微量白蛋白（UMA）采用免疫投射比濁法在日立全自動(dòng)生化分析儀7180 上檢測。尿蛋白、尿隱血在尿液分析儀AUTION MAX UrilyzerAuto上檢測。尿隱血紅細(xì)胞≥50個(gè)/μL和尿蛋白＞50 mg/dL為陽性。ANA滴度≥1:320為陽性，dsDNA≥1:32為陽性。免疫印跡法測定抗核抗體譜及ANCA 特異性抗體結(jié)果，灰度值15～20為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的以中位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

共納入191 例SLE 患兒，女160 例、男31 例，平均年齡（12.0±3.5）歲。pANCA 陽性組81 例（42.4%），男13例、女68例，平均年齡（12.7±3.2）歲；pANCA 陰性組110 例，男14 例、女96 例，平均年齡（11.4±3.6）歲。兩組間性別（χ2=0.42，P=0.515）、年齡（t=1.84，P=0.070）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

81例pANCA陽性患兒中，pANCA（甲醛抗性）陽性26例（32.1%），pANCA（甲醛敏感）陽性55例（67.9%）；抗髓過氧化物酶（MPO）抗體陽性29例，占pANCA 陽性患兒35.8%?？鼓I小球基底膜抗體和抗MPO抗體同時(shí)陽性1例。

2.2 pANCA陽性和陰性組一般實(shí)驗(yàn)室及自身抗體指標(biāo)比較

與pANCA 陰性組相比，pANCA 陽性組血沉較高，Hb 較低，自身抗體中ANA、抗dsDNA 抗體、抗SSA抗體、抗CENP-B抗體、抗組蛋白抗體、抗rRNP抗體、抗核小體抗體以及抗Ro-52 抗體陽性率均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 pANCA陽性和陰性組一般實(shí)驗(yàn)室及自身抗體指標(biāo)比較

2.3 pANCA陽性和陰性組免疫功能及腎功能比較

與pANCA 陰性組相比，pANCA 陽性組C 3 和C4較低，UCr、UIgG/UCr、α1-MG/UCr、β1-MG/UCr、NAG/UCr、UMA/UCr 較高，尿隱血和尿蛋白陽性比例較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 pANCA陽性和陰性患兒免疫功能和腎功能相關(guān)指標(biāo)比較

2.4 pANCA陽性和陰性組腎臟病理結(jié)果比較

共112 例SLE 患兒進(jìn)行腎穿刺活檢，其中pANCA陰性患兒63例，pANCA陽性49例。光鏡下腎臟病理改變提示，pANCA陽性患兒有3例新月體形成。與pANCA 陰性組相比，pANCA 陽性組系膜增生比例較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫熒光標(biāo)記檢查提示，與pANCA陰性組相比，pANCA陽性組腎小球系膜和毛細(xì)血管袢IgG、IgM、IgA、C 1 q 和C 3 沉積比例較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 pANCA陽性和陰性組腎臟病理結(jié)果比較[n (%)]

3 討論

兒童SLE是一種較少見但能引起全身各器官系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害的自身免疫性疾病。和普通人群相比，兒童SLE的總體標(biāo)準(zhǔn)化死亡率（SMR）更高，特別是＜18 歲的住院患者，SMR（6.5）大約為正常人（所有年齡段SMR為2.2）的3倍[5]。發(fā)病年齡越小（＜5歲）患兒癥狀越不典型，并發(fā)癥和不良預(yù)后發(fā)生率越高[6]。由于個(gè)體間顯著的異質(zhì)性，兒童SLE 的診斷復(fù)雜，治療更為困難。

本研究SLE患兒中pANCA陽性率為 42.4%，相關(guān)靶抗原以MPO為主，陽性率占pANCA的35.8%，與成人報(bào)道一致[7]。原因可能為：①與pANCA 甲醛抗性的主要相關(guān)靶抗原為MPO，而pANCA 甲醛敏感的相關(guān)靶抗原有乳鐵蛋白、彈性蛋白酶、組織蛋白酶和溶菌酶及其他未知抗原[8]，需要更多的研究來發(fā)現(xiàn)這些未知的抗原；②pANCA 檢測及其相關(guān)靶抗原檢測的方法學(xué)不同使其檢測的陽性率有差異；③MPO 與p-ANCA 相關(guān)主要發(fā)生在AAV 患者中，而在ANCA的其他相關(guān)疾病這樣的相關(guān)性不明顯。

pANCA 在SLE 及其并發(fā)癥中的作用及其機(jī)制仍不明確。狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）患者體內(nèi)可能通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒和激活中性粒細(xì)胞，增加細(xì)胞表面 MPO 的表達(dá)，從而促進(jìn)ANCA形成[9]。中性粒細(xì)胞可能在不同形式的細(xì)胞死亡過程中釋放中性粒細(xì)胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs），NETs參與多種促進(jìn)自身反應(yīng)和組織損傷的自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制，包括SLE 和ANCA相關(guān)血管炎。NETs上的自身抗體導(dǎo)致更多的C1q沉積，導(dǎo)致無效的凈降解和促炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)。同時(shí)，抗dsDNA抗體和抗ENA抗體陽性患者的凈降解效率受損，這與活動(dòng)性SLE 患者疾病活動(dòng)和腎臟受累有關(guān)[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，和pANCA 陰性組相比，pANCA陽性SLE 患兒Hb 降低并伴有血沉增快，表明pANCA可以反映SLE 活動(dòng)情況。而Hb 降低可能與ANCA相關(guān)的血尿有關(guān)[11]。ANA 滴度和抗dsDNA 抗體陽性率在pANCA陽性組明顯高于pANCA陰性組，與既往的成人研究一致[7，12]。ENA的相關(guān)指標(biāo)在大多數(shù)情況下隨著ANA 各種不同核型和滴度的變化而改變。因此ENA相關(guān)指標(biāo)在一般情況下也能反映疾病進(jìn)展和活動(dòng)趨勢?？筪sDNA抗體被廣泛認(rèn)為是用于診斷SLE 和評估疾病活動(dòng)性的一項(xiàng)重要指標(biāo)，同時(shí)也可以促使LN的發(fā)生?？筪sDNA抗體和ANA的致病性主要由免疫復(fù)合物形成引起，免疫復(fù)合物通過組織沉積或誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放引起全身性免疫細(xì)胞紊亂。目前篩查策略建議ANA 和抗dsDNA 抗體同時(shí)檢測，以識(shí)別所謂的“活動(dòng)性、自身抗體陽性SLE”患者。由于疾病的自然史或治療的影響，ANA反應(yīng)會(huì)隨著時(shí)間的推移而減少。對于已經(jīng)確診SLE的患者，定期ANA血清學(xué)檢測可闡明與發(fā)病機(jī)制和疾病狀態(tài)相關(guān)的變化[13]。

本研究SLE 患兒pANCA 陽性組補(bǔ)體C 3 和C 4水平低于pANCA陰性組，與國外研究結(jié)果一致[14]。但也有文獻(xiàn)報(bào)道，SLE患者C3和C4在pANCA陽性組和陰性組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[9]。這可能因?yàn)檠芯繉ο蟮哪挲g不同，同時(shí)也提示pANCA在兒童SLE中的作用不同于成人。國內(nèi)文獻(xiàn)也提及補(bǔ)體下降在臨床上可作為SLE 和疾病進(jìn)展的重要診斷線索，同時(shí)也是免疫功能紊亂的指標(biāo)[15]；補(bǔ)體C 3 持續(xù)降低也是SLE腎臟損害的預(yù)測指標(biāo)[16]?？赡苁怯捎诿撗鹾颂呛怂崦?1 (deoxyribonuclease-1，DNase-1）抑制劑和NETs 抗體的存在阻止了DNase-1 進(jìn)入NETs，DNase-1功能失效及NETs降解受損與腎臟受累、疾病活動(dòng)性以及血液中C3和C4水平低有關(guān)。

pANCA對腎功能的影響尚無定論。有研究發(fā)現(xiàn)p-ANCA與LN相關(guān)[10]。也有研究報(bào)道在LN患兒中，ANCA陽性與血肌酐、腎小球?yàn)V過率、血尿、尿蛋白等腎損傷指標(biāo)無關(guān)，但與腎臟病理改變有關(guān)[17]。本研究pANCA 陽性SLE 患兒比陰性患兒更容易發(fā)生系膜增生，而且p-ANCA 陽性組腎功能相關(guān)指標(biāo)均高于陰性組，提示pANCA會(huì)加重腎功能和腎臟病理的損傷。不同研究結(jié)論的差異可能與SLE患者的年齡差異、疾病進(jìn)展時(shí)期不同有關(guān)。

本研究兒童SLE 樣本較少，由于臨床病例資料不全，只收集腎臟病理的光鏡結(jié)果，并未對腎臟的病理資料進(jìn)行分型，因此無法對pANCA與不同類型腎臟病理進(jìn)行相關(guān)性分析。兒童SLE的臨床表現(xiàn)各不相同，pANCA可能與兒童SLE的疾病活動(dòng)性和腎臟損害密切相關(guān)。