康郁林

上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院腎臟風濕科（上海 200062）

抗中性粒細胞胞漿抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)是一類以中性粒細胞和單核細胞胞漿成分為靶抗原的自身抗體，是診斷系統(tǒng)性小血管炎的重要標記物。目前，ANCA 的檢測手段日趨先進，靈敏度和特異度較前大幅提高，為ANCA相關(guān)性血管炎(ANCA-associated vasculitis，AAV)的早期診治提供了可靠保障。為進一步了解ANCA 在兒科疾病中的臨床意義，本文將重點介紹ANCA的概況、檢測方法及其在兒科疾病中的應(yīng)用。

1 ANCA簡介

ANCA最早于1982年在節(jié)段壞死性腎小球腎炎患者的血清中被發(fā)現(xiàn)，但當時并未引起學界重視，直至1985年Van der Woude 發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性血管炎患者也存在類似的抗體[1]。然而，早年對ANCA 的臨床意義缺乏認識，例如1990年美國風濕病學會(American College of Rheumatology，ACR)制定的血管炎分類標準中，并未將ANCA 納入其中[2]。隨著對ANCA認識的加深，2012 年Chapel Hill 會議(CHCC)將ANCA 納入了血管炎分類標準，并提出了新的分類方法，將肉芽腫性血管炎 (granulomatosis with polyangiitis，GPA)、顯微鏡下血管炎 (microscopic polyangiitis，MPA) 和嗜酸性粒細胞肉芽腫性血管炎(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis，EGPA)歸屬為AAV[3]。在2022 年ACR/歐洲抗風濕病聯(lián)盟(EULAR)提出的MPA、GPA 和EGPA 分類標準中，ANCA已成為系統(tǒng)性小血管炎分類標準中的重要標志物[4-6]。

ANCA 的靶抗原包括蛋白酶3(proteinase 3)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)、彈性蛋白酶(elastase，ELA)、溶酶體(lysozyme，LYS)、天青殺素(azurocidin，AZU)和殺菌/通透性增高蛋白(bactericidal/permeability increasing protein，BPI)等等。ANCA 包括胞漿型(cytoplasmic ANCA，c-ANCA)、核周型(perinuclear ANCA，p-ANCA)和非典型(atypical ANCA，a-ANCA)。其中c-ANCA、p-ANCA的靶抗原分別是PR3和MPO。其中，PR 3 一種絲氨酸蛋白酶，相對分子質(zhì)量約為29 000，主要存在于中性粒細胞胞漿的嗜天青顆粒中，也可存在于中性粒細胞表面及其分泌的微囊泡中。MPO 是一種相對分子質(zhì)量150 000 的血紅素蛋白酶，由2條α鏈和2條β鏈組成，粒細胞進入循環(huán)之前在骨髓內(nèi)合成并貯存于嗜天青顆粒內(nèi)[7]。

2 ANCA的產(chǎn)生與致病機制

ANCA主要是IgG類抗體。c-ANCA和p-ANCA成熟演化過程可能經(jīng)歷了3 個階段：由于IgG 可變區(qū)編碼基因的變異使其與靶抗原的結(jié)合能力顯著增強；抗原表位拓展(epitope spreading) 使得靶器官更易受損；存在有利于MHC-II 形成的特殊等位基因[8-11]。迄今，關(guān)于ANCA的形成機制仍不明確，目前主要包括4 種學說。①抗PR 3 的c-ANCA 形成與自身抗原互補蛋白相關(guān)。該學說認為PR3編碼DNA的反義鏈，或者與編碼PR3反義鏈DNA序列相似的細菌刺激機體產(chǎn)生c-ANCA。②分子模擬學說。金黃色葡萄球菌和痢疾阿米巴的部分抗原與PR3、MPO類似，誘導機體產(chǎn)生自身抗體。③凋亡受阻學說。中性粒細胞自身凋亡受阻，導致細胞抗原暴露的機會增加，從而刺激B 細胞產(chǎn)生更多的抗體。④中性粒細胞胞外陷阱學說(neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs 是中性粒細胞釋放至胞外的纖維狀結(jié)構(gòu)，是一種抵抗微生物的免疫防御機制，該結(jié)構(gòu)上附有的顆粒蛋白PR3和MPO可被抗原遞呈細胞處理，從而促進自身抗體的產(chǎn)生。ACNA 相關(guān)性血管炎患者中，上述四種機制可能同時存在[7,12]。由此可知，ANCA的形成機制方面是值得進一步研究的方向。

迄今，AAV 中的發(fā)病機制仍未完全闡明，但目前研究提示ANCA參與了AAV的起病。體外研究發(fā)現(xiàn)ANCA可誘導中性粒細胞活化，發(fā)生呼吸爆發(fā)與脫顆粒，大量釋放氧自由基、蛋白酶等物質(zhì)損傷血管內(nèi)皮細胞。此外，活化的中性粒細胞可誘導產(chǎn)生NETs，進一步損傷血管[13]。

3 ANCA檢測方法

隨著免疫學技術(shù)的進展，國內(nèi)外目前檢測ANCA 的方法較多，主要包括間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、化學發(fā)光免疫法(chemiluminescent immuno-assays，CLIA)和熒光酶免疫法(fluorescent-enzyme immunoassays，F(xiàn)EIA)等，但目前國內(nèi)外臨床廣泛使用的檢測技術(shù)主要為IIF法和ELISA法。

IIF 法檢測ANCA，這是臨床上較早用于檢測ANCA 的手段，也是當今常用的檢測技術(shù)之一。乙醇或甲醛固定中性粒細胞后，IIF 法檢測p-ANCA、c-ANCA 和a-ANCA。p-ANCA 的特點是在多形細胞核周圍可見免疫熒光環(huán)繞，這是針對MPO 的抗體；c-ANCA 的免疫熒光呈顆粒狀分布于細胞的胞漿中，這是針對PR 3 的抗體；而a-ANCA 的免疫熒光在細胞核和胞漿中均可見，即同時具備p-ANCA和c-ANCA的熒光特點。IIF法檢測ANCA的靈敏度、特異度分別是67%～78%和93%[14]。由于人工判別免疫熒光強度帶有一定的主觀性，目前部分商業(yè)公司已開發(fā)了自動的閱片系統(tǒng)，即可避免主觀性，也可提高工作效率。但是，IIF 法的假陰性率較高，為了彌補其中的不足，ELISA 法已被開發(fā)應(yīng)用于臨床診斷，并已作為常用的檢測方法[15]。

由于p-ANCA和c-ANCA靶抗原的純化技術(shù)得到提高，因此，抗原檢測成了另一種可靠的檢測技術(shù)。經(jīng)歷30余年的發(fā)展，檢測ANCA的ELISA技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了第三代，相對于第一代和第二代，能更充分暴露抗原表位，有更高的表位結(jié)合效能，從而大幅提高了檢測方法的靈敏度(80%～97%)和特異度(約96%)。研究表明，同時開展IIF法和ELISA法檢測ANCA，其靈敏度和特異度將達到92%和99%[1]。因此，聯(lián)合兩種方法進行檢測，是當今眾多醫(yī)療機構(gòu)采用的ACNA 檢測方法。然而，隨著免疫學檢測手段的進步，2019年中國免疫學會臨床免疫學分會制定的《抗中性粒細胞胞漿抗體檢測方法在診斷肉芽腫性血管炎和顯微鏡下多血管炎中應(yīng)用的專家共識》推薦：可采用ELISA、化學發(fā)光免疫法和多重微珠流式免疫熒光法等先進的抗原特異度免疫學方法定量檢測MPO 和PR 3，作為針對疑似AAV 的篩查方法，如果檢查結(jié)果陰性或者弱陽性，但臨床仍高度懷疑AAV 時，可使用IIF 或其他抗原特異度免疫學方法做確認試驗[16]。

4 ANCA在兒科風濕免疫性疾病中的應(yīng)用

在兒科的日常臨床診治工作中，對于反復發(fā)作的鼻竇炎和耳炎、有系統(tǒng)特征的皮膚型血管炎、聲門下氣管狹窄、視網(wǎng)膜血管炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、視神經(jīng)炎、慢性上呼吸道破壞性疾病、肺出血、肺腎綜合征和急進性腎小球腎炎等疾病，或者反復不明原因的發(fā)熱，或多臟器累及性疾病，開展ANCA 檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)AAV[16]。

4.1 ANCA相關(guān)性血管炎

AAV 是一種寡或無免疫復合物沉積的壞死性血管炎，主要累及中小血管。2012 年CHCC 會議的血管炎分類標準將ANCA納入了診斷標準，并更新了血管炎的命名方法，將AAV 可分為3 類：GPA、EGPA和MPA，前兩者是肉芽腫性血管炎，后者為非肉芽腫性血管炎。為提高疾病診斷的靈敏度和特異度，2022年ACR/EULAR提出了新的血管炎分類標準，見表1。該標準通過評分的方式，賦予疾病臨床表現(xiàn)、影像學、病理和實驗室檢查結(jié)果一定的權(quán)重分值，為血管炎患者提供更加有力的分類標準。在這一分類標準中，ANCA在AAV中的診斷價值得到了充分顯現(xiàn)。該標準基于成人患者數(shù)據(jù)制定，但對兒童血管炎的診斷亦具有良好的參考價值。兒童AAV以GPA 和MPA 為主，關(guān)于兒童AAV 的流行病學資料較缺乏，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)主要來自歐洲：法國約為0.45/100萬，瑞典約為1.4/100萬，加拿大6.39/100萬。兒童AAV 多見于12～14 歲，女孩多見，腎臟受累較成人多見。AAV患兒起病急，進展快，臨床表現(xiàn)多樣化，停藥后疾病易復發(fā)[13]。

表1 2022年ACR/EULAR的AAV分類標準

4.1.1 GPA GPA曾被稱為韋格納肉芽腫(Wegener granulomatosis，WG)，兒童發(fā)病年齡常見于6.0～16.5歲，女孩多見，常累及上下呼吸道、腎臟和皮膚等臟器。上呼吸道病變多為鼻竇炎、鼻息肉和鼻中隔穿孔等，癥狀常表現(xiàn)為膿涕、鼻塞、鼻出血和咽痛。兒童GPA的上呼吸道癥狀尤為突出，部分患者還可伴有聽力下降[18]。下呼吸道受累的臨床特點主要為咳嗽、呼吸困難、喘息、咯血、肺部結(jié)節(jié)、肺部浸潤灶、肺空洞和胸膜炎。65%～88%的GPA 患者出現(xiàn)腎臟損害，表現(xiàn)為血尿、蛋白尿和腎功能損傷，腎臟病理多提示寡免疫復合物新月體性腎炎。肺部受累較腎臟損害更常見。累及皮膚時，可表現(xiàn)為觸痛性皮下結(jié)節(jié)、皮膚局灶性壞死、紫癜及紅斑等[13,19]。

在GPA分類標準的發(fā)展歷程中，ANCA 的診斷價值逐步得到了重視。2006年，EULAR/歐洲兒童風濕病協(xié)會(PRreS)提出兒童血管炎分類標準，將PR3或c-ANCA 陽性列為GPA 的診斷條目[20]。2008 年EULAR-PReS國際兒童風濕病學試驗組織(PRINTO)在Ankara 會議上制定的兒童GPA 分類標準，也提及了ANCA 在疾病診斷中的價值[21]。2022 年ACR/EULAR 制定的AAV 分類標準(表1)同樣將ANCA作為重要的分類標準依據(jù)。研究表明，80%～90%的GPA患者出現(xiàn)ANCA陽性，多為PR3異常升高或c-ANCA陽性(65%～75%)，MPO升高或p-ANCA陽性率為20%～30%[1,22]。此外，ANCA的滴度與AAV的病情活動呈正相關(guān)，然而，ANCA陰性亦不能排除AAV[16]。因此，診斷GPA時，要結(jié)合臨床癥狀、體征、實驗室檢查及影像學檢查進行綜合判斷。

4.1.2 EGPA EGPA 曾被稱為Churg -Strauss 綜合征(CSS)，組織器官中存在嗜酸性粒細胞浸潤和壞死性肉芽腫炎癥，主要累及中小血管。在兒童極為罕見，在兒童原發(fā)性血管炎中約占2%，可累及呼吸系統(tǒng)、腎臟、皮膚、消化道，心臟和神經(jīng)系統(tǒng)等多個臟器，伴有外周血嗜酸性粒細胞升高。呼吸系統(tǒng)損傷常表現(xiàn)為哮喘、過敏性鼻炎、鼻息肉等。皮膚損傷包括皮疹、皮下結(jié)節(jié)和網(wǎng)狀青斑(40%～52%)等。ANCA 陽性率較低，僅為30%～40%，多為MPO 升高或p-ANCA陽性[1,23]。因此，2022年ACR/EULAR提出了EGPA的新分類標準，ANCA在分類標準中，僅將c-ANCA 陽性列為減分標準，以便與其他類型AAV 進行區(qū)分。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，ANCA 陽性的EGPA患者更易出現(xiàn)皮膚和神經(jīng)系統(tǒng)損害[24]。ANCA陰性者則易出現(xiàn)心臟損傷[25]。

4.1.3 MPA MPA是一種主要累及小血管的壞死性血管炎，不存在肉芽腫性炎癥，寡或無免疫復合物沉積。腎臟是常受累及的器官(75%～100%)，可表現(xiàn)為腎功能異常、血尿和/或蛋白尿，病理特點表現(xiàn)為新月體性腎炎、寡免疫復合物沉積和纖維素樣壞死性血管炎。上呼吸道病變罕見，下呼吸道病變可表現(xiàn)為肺出血，該類患兒可出現(xiàn)紫癜樣皮疹，易被誤診為紫癜性腎炎。因此，開展ANCA 等生物學標記物檢查對MPA 的診斷至關(guān)重要[13,26]。在MPA患者中，ANCA 陽性率為65%～90%，多為MPO 升高或p-ANCA陽性(65%～75%)，c-ANCA陽性率為20%～30%[1,6]。從表1可知，2022年ACR/EULAR的MPA分類標準已將ANCA陽性作為一項重要的診斷標準。此外，有研究表明，ANCA陰性的MPA患兒腎功能損傷更嚴重[27]。因此，ANCA 不僅是分類標準的重要項目，檢測該指標還有助于指導疾病預后。

4.1.4 藥物誘導的AAV 臨床少數(shù)藥物可誘導AAV，如丙硫氧嘧啶、肼屈嗪和左旋咪唑[28-30]。丙硫氧嘧啶導致的AAV，主要表現(xiàn)為急性腎損傷、上下呼吸道癥狀、皮炎及粒細胞減少癥等，多為a-ANCA陽性，少數(shù)為p-ANCA，主要的靶抗原為MPO，少見的靶抗原則包括ELA、LF和BPI等。類似地，肼屈嗪和左旋咪唑?qū)е碌腁AV，也可出現(xiàn)皮疹、關(guān)節(jié)痛等多系統(tǒng)受累征象，ANCA檢查結(jié)果提示a-ANCA陽性為主，偶爾出現(xiàn)p-ANCA或c-ANCA陽性。此外，米諾環(huán)素、別嘌呤醇、柳氮磺吡啶、青霉胺和金制劑等藥物也可誘發(fā)AAV[1]。總體而言，藥物誘導的AAV 癥狀輕重不一，大部分臨床癥狀輕微，或輕度的壞死性血管炎，嚴重的急進性腎小球腎炎少見。ANCA檢測對于藥物誘導的AAV具有較好的診斷價值。

4.2 ANCA陽性的其他兒科疾病

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種非特異性慢性胃腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，診斷主要依賴于臨床癥狀、胃腸鏡及病理檢查結(jié)果。在IBD患兒中，p-ANCA陽性占比較高，但其并不是診斷標記物，也與疾病活動無關(guān)。如果c-ANCA或PR3陽性，則有助于潰瘍性結(jié)腸炎的診斷[31]。然而，IBD患者出現(xiàn)ANCA的原因及其應(yīng)用價值有待于進一步研究與探討。囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)患者亦可出現(xiàn)針對靶抗原BPI的ANCA，且與疾病的嚴重程度相關(guān)[32]。此外，原發(fā)性硬化性膽管炎患者亦可伴有p-ANCA陽性[33]。由上可知，除AAV之外，其他兒科疾病也可出現(xiàn)ANCA，但其診斷價值有待于進一步研究。

5 結(jié)語

ANCA是一類以中性粒細胞和單核細胞胞漿成分為靶抗原的自身抗體。ANCA 檢測技術(shù)主要包括間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學發(fā)光免疫法和多重微珠流式免疫熒光法等。AAV是一種主要累及小血管的的壞死性血管炎，寡或無免疫復合物沉積，兒童發(fā)病率低，但起病急，進展快，臨床表現(xiàn)多樣化，停藥后疾病易復發(fā)。ANCA 檢測有助于AAV的早期診治，從而改善疾病預后。