孫紅霞,劉春旭,安學(xué)俊,崔光華,王靖宇,佟雙喜,楊曉秋

（1.北華大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室 吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，吉林 吉林 132011）

五味子為木蘭科多年生落葉木質(zhì)藤本植物，是我國常用的一種傳統(tǒng)中藥。北五味子多糖（Schisandra chinensispolysaccharide，SCP）提取自五味子，具有多種生物學(xué)活性，其主要成分為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖等。SCP具有保肝、增強免疫、抗氧化、抗衰老和抗腫瘤等作用［1-3］，特別是其抗腫瘤作用近年來受到廣泛關(guān)注。有關(guān)SCP對膀胱癌細胞生長抑制的作用目前國內(nèi)外尚未見報道，因此本研究探討SCP對體外生長膀胱癌T24細胞增殖和凋亡的作用及其對磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）、磷脂酰肌 醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，即Akt）信號通路相關(guān)蛋白表達的影響，闡明其作用的初步分子機制，為揭示SCP抗膀胱癌作用提供藥理學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人膀胱癌T24細胞株購自上海慧穎生物科技公司。SCP由吉林省五味子開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化科學(xué)研究中心制備，通過超臨界CO2流體萃取，將北五味子中水溶性成分和脂溶性成分分離，利用超聲波產(chǎn)生的強烈振動、高加速度、強烈空化效應(yīng)及攪拌作用，經(jīng)超聲波預(yù)處理40 min后進行浸提，采用酶法與三氯乙酸結(jié)合脫蛋白得北五味子粗多糖，提取率為77.6%，純度可達50%以上。細胞培養(yǎng)基DMEM和胰蛋白酶購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，β-actin、PTEN、磷 酸 化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、鼠抗人一抗和兔抗鼠二抗均購自美國Santa Cruz公司，MTT購自美國Sigma公司，AnnexinⅤ-FITC流式細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱購自上海賽默飛世爾公司，酶標儀購自深圳邁瑞生物公司，高速冷凍離心機購自上海土森視覺科技有限公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國美谷生物科技公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組人膀胱癌T24細胞株置于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗使用細胞均為接種后24 h處于對數(shù)生長期的細胞。實驗分為對 照 組（0 mg·L－1SCP）及50、100和200 mg·L－1SCP組。取對數(shù)生長期的T24細胞以3×104mL－1的密度接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，24 h后分別加入0、50、100和200 mg·L－1SCP，作用48 h后，胰酶消化離心，細胞懸浮于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中備用。

1.3 MTT法檢測各組細胞增殖抑制率取對數(shù)生長期膀胱癌T24細胞，以4×103/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，分別加入0、50、100和200 mg·L－1SCP，培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg·L－1MTT 20 μL，孵育4 h，棄上清液，每孔加二甲基亞楓（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μ L，避光振蕩10 min。采用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處檢測各組細胞的吸光度（A）值，計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=［1－（實驗孔A值－空白孔A值）/（對照孔A值－空白孔A值）］×100%。

1.4 Hoechst 33258熒光染色法檢測各組細胞凋亡情況將對數(shù)生長期T24細胞按3×105/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板，細胞貼壁融合至60%～70%，分別加入0、50、100和200 mg·L－1SCP繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入0.5 mL固定液，10 min后去固定液，PBS緩沖液洗滌2次，0.5 mL Hoechst 33258染色液避光染色5 min。于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)表現(xiàn)（激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm）和各組細胞凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.5 AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染法檢測各組細胞凋亡率各組T24細胞經(jīng)SCP處理48 h后，0.25%胰酶消化，收集細胞。PBS緩沖液洗滌3次，加入100 μL結(jié)合緩沖液懸液制備單細胞混懸液。加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL PI染液混勻。室溫下避光反應(yīng)10 min。采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.6 流式細胞術(shù)檢測各組不同細胞周期T24細胞百分率和凋亡率SCP作用24 h后，收集各組T24細 胞 懸 液，1 000 r·min－1離 心5 min，棄 上 清 液。PBS洗滌，細胞沉淀采用預(yù)冷70 %乙醇－20℃固定過夜。取固定后細胞，PBS緩沖液洗滌2次懸浮，加入50 mg·L－1核糖核酸酶A 36℃水浴30 min，800 μL PI染液至終濃度為50 mg·L－1，搖勻后4℃避光靜置30 min，200目尼龍網(wǎng)過濾。采用流式細胞儀檢測各組不同細胞周期T24細胞百分率和凋亡率。

1.7 Western bloting法檢測各組細胞中PTEN、p-PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平SCP作用48 h后收集各組T24細胞，提取各組細胞總蛋白，采用BCA法測定總蛋白含量。分別取各組40 μg總蛋白上樣，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉封閉后，加入適量稀釋PTEN（l∶1 000）、p-PI3K（l∶1 000）、Akt（l∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）和β-actin（l∶1 000）一抗，4℃孵育過夜，加入二抗（1∶500），室溫下?lián)u蕩孵育2 h，采用ECL發(fā)光液發(fā)光，充分反應(yīng)后，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組T24細胞增殖抑制率，細胞凋亡率，不同細胞周期細胞百分率，各組細胞中PTEN、p-PI3K、p-Akt和Akt蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較若方差齊采用LSD-t法，若方差不齊則采用Dunnett’s T3單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組T24細胞增殖抑制率與對照組比較，50、100和200 mg·L－1SCP組細胞增殖抑制率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 各組T24細胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of T24 cells in various groups （n=7，±s，η/%）

表1 各組T24細胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of T24 cells in various groups （n=7，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control SCP(mg·L－1)50 100 200 Inhibitory rate of proliferation 0 18.69±4.32*39.13±5.36**64.76±8.45**

2.2 各組T24細胞凋亡情況熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示：不同劑量SCP組出現(xiàn)細胞核內(nèi)染色質(zhì)的固縮和斷裂，呈現(xiàn)出典型的細胞凋亡表現(xiàn)形態(tài)。與對照組比較，隨SCP濃度升高，50、100和200 mg·L－1SCP組凋亡細胞數(shù)明顯增多。見圖1。

圖1 各組T24細胞凋亡情況(Hoechst 33258熒光,×400)Fig.1 Apoptosis of T24 cells in various groups(Hoechst 33258 fluorescence,×400)

2.3 各組T24細胞凋亡率AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，不同劑量SCP組T24細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2和表2。

表2 各組T24細胞凋亡率Tab.2 Apoptotic rates of T24 cells in various groups(n=7，±s，η/%）

表2 各組T24細胞凋亡率Tab.2 Apoptotic rates of T24 cells in various groups(n=7，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control SCP(mg·L－1)50 100 200 Apoptotic rate 13.47±2.25 30.32±5.21*37.69±4.35*45.68±3.38**

圖2 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測各組T24細胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of T24 cells in various groups detected by AnnexinⅤ-FITC/PI double staining method

2.4 各組不同細胞周期T24細胞百分率和凋亡率與對照組比較，50、100和200 mg·L－1SCP組G0/Gl期T24細胞百分率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），100和200 mg·L－1SCP組S期 和G2/M期T24細胞百分率明顯降低（P＜0.01）。與對照組比較，50、100和200 mg·L－1SCP組T24細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。見圖3和表3。

表3 各組不同細胞周期T24細胞百分率和凋亡率Tab.3 Percentages of T24 cells at different cell cycles and apoptotic rates in various groups (n=7，±s，η/%）

表3 各組不同細胞周期T24細胞百分率和凋亡率Tab.3 Percentages of T24 cells at different cell cycles and apoptotic rates in various groups (n=7，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control SCP(mg·L－1)50 100 200 Percentage of T24 cells G0/G1 27.43±2.56 38.62±4.75*65.39±4.21**80.71±6.57**S 48.54±3.82 40.21±4.75 30.77±2.85**16.91±2.96**G2/M 24.03±1.98 21.17±2.59 3.84±0.45**2.38±0.81**Apoptotic rate 5.87±0.97 28.73±4.56**38.35±5.73**60.52±7.48**

圖3 流式細胞術(shù)檢測各組不同細胞周期T24細胞百分率Fig.3 Percentages of T24 cells at different cell cycles in various groups detected by flow cytometry

2.5 各組T24細胞中PTEN和p-PI3K蛋白表達水平及p-Akt/Akt比值與對照組比較，50、100和200 mg·L－1SCP組T24細胞中PTEN蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），p-PI3K蛋白表達水平和p-Akt/Akt比值明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組T24細胞中PTEN、p-PI3K、p-Akt和Akt和蛋白表達電泳圖(A)和直條圖(B-D)Fig.4 Electrophoregram(A)and histogram(B-D)of expressions of PTEN,p-PI3K，p-Akt,and Akt proteins in T24 cells in various groups

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤中位列第一的惡性腫瘤，臨床上主要治療方法為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（transurethral resection of bladder tumour，TUR-BT），但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達60%～70%，且約25%的患者復(fù)發(fā)后會進展為浸潤性膀胱癌［4-6］。為防止患者術(shù)后復(fù)發(fā)輔以膀胱灌注的免疫抑制劑或化療藥物均存在不同程度的全身或局部不良反應(yīng)，且仍有約20%的患者經(jīng)膀胱灌注治療后腫瘤仍復(fù)發(fā)［7-9］。而根治性膀胱切除術(shù)聯(lián)合尿流改道術(shù)后仍有約50%的患者可能出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，且對轉(zhuǎn)移性膀胱癌患者采用的化療方案療效無法持久，患者5年生存率僅為20%～40%。針對目前膀胱癌灌注藥物及化療藥物療效的不穩(wěn)定性及其不良反應(yīng)，尋找安全有效、來源于天然產(chǎn)物的抗腫瘤藥物是近年來腫瘤藥物研發(fā)中的熱點。

SCP是北五味子的活性成分之一，隨著對SCP功能的不斷研究，其抗腫瘤的作用成為研究熱點，但有關(guān)SCP對膀胱癌作用的研究較少。本研究檢測不同劑量SCP對人膀胱癌T24細胞增殖和凋亡的作用，結(jié)果顯示：SCP能提高T24細胞增殖抑制率，抑制人膀胱癌T24細胞增殖，同時促進其凋亡，使S期細胞百分率降低，G0/G1期細胞百分率升高，G2/M期細胞百分率降低，表明SCP具有阻止T24細胞增殖的作用，使T24細胞阻滯于G0/G1期，從而誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究中AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法和Hoechst 33248熒光染色法檢測結(jié)果顯示：SCP能夠誘導(dǎo)T24細胞凋亡，與流式細胞術(shù)檢測結(jié)果一致。

Akt活化能阻止人膀胱癌T24細胞凋亡，而使用PI3K抑制劑LY 294002使Akt活性喪失，從而導(dǎo)致膀胱癌細胞凋亡［10-12］。PI3K抑制劑LY 294002可明顯抑制腫瘤細胞的生長［13-15］。研究［16］顯示：PI3K/Akt通路在膀胱癌細胞的增殖和凋亡過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示：SCP能抑制PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達，且隨著SCP劑量升高，該抑制作用明顯增強，提示SCP抑制膀胱癌細胞增殖和促進其凋亡的作用可能是通過對PI3K/Akt通路的負反饋調(diào)節(jié)實現(xiàn)的［17］。

PTEN是一種新發(fā)現(xiàn)具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，也是繼p53之后另一種較為廣泛地與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切的基因，PTEN蛋白在細胞生長、細胞凋亡、細胞黏附、細胞遷移和浸潤等方面具有重要作用［18-20］。PTEN參與化學(xué)通路傳導(dǎo)，將信號傳導(dǎo)給細胞，使細胞停止分裂并進入程序性死亡（即細胞凋亡），上述功能可以阻止非控制性細胞生長進而抑制腫瘤形成。PTEN表達下調(diào)間接刺激PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性從而促進腫瘤形成［18，21-22］。研究［23］顯示：男 性膀胱癌的發(fā)展與抑癌基因PTEN缺失引起細胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR信號通路的異常激活有關(guān)。研究［24-27］顯示：PI3K/Akt信號通路與膀胱癌的發(fā)生有密切關(guān)聯(lián)，該信號通路的激活是發(fā)生癌癥的主要原因，抑癌基因PTEN是負性調(diào)控基因，其表達下調(diào)引起PI3K和Akt激活，當PTEN基因缺失或突變時，PTEN無法有效拮抗PI3K/Akt/mTOR信號通路作用，致使該通路功能異常，從而誘發(fā)癌癥。

本研究探討SCP對人膀胱癌T24細胞中PTEN及p-PI3K和Akt蛋 白表達的影 響，SCP能明顯上調(diào)人膀胱癌T24細胞中PTEN蛋白表達，下調(diào)p-PI3K和p-Akt蛋白表達，且具有劑量依賴性，SCP對PI3K/Akt信號通路的抑制作用可能與其對PTEN的誘導(dǎo)效應(yīng)有關(guān)，但其是否通過調(diào)控PTEN/PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用有待進一步驗證。

綜上所述，SCP可能通過調(diào)控PTEN和PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達，即上調(diào)PTEN蛋白表達，抑制PI3K/Akt蛋白激活，進而調(diào)控細胞周期，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，抑制癌癥發(fā)生。