王文杰,舒 升,徐珊珊,徐煜彬

（1.浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院 臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 臺(tái)州 318000；2.浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院 臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院科研處，浙江 臺(tái)州 318000；3.浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院 臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，浙江 臺(tái)州 318000）

腦卒中是由腦血管閉塞導(dǎo)致流向腦組織血流量減少而引起，是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)病之一，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)，是全球可預(yù)防性死亡的第二大原因和長(zhǎng)期致殘的第三大原因，減少腦缺血-再灌注損傷是治療腦卒中的關(guān)鍵［1-4］。本課題組前期研究［5］顯示：菊科草本植物牛蒡重要藥理活性成分牛蒡苷元（100 mg·kg－1）可以通過(guò)改善腦缺血-再灌注損傷模型大鼠腦局灶性缺血，提高缺血半暗帶腦組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，抑制丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白 細(xì) 胞 介 素6（interleukin-6，IL-6）和 腫 瘤 壞 死 因 子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）釋放，發(fā)揮抗腦缺血-再灌注損傷作用。然而，關(guān)于牛蒡苷元抗腦缺血-再灌注分子代謝機(jī)制尚未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究通過(guò)非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)牛蒡苷元抗腦缺血-再灌注損傷大鼠的血清代謝物進(jìn)行分析，探討牛蒡苷元抗腦缺血-再灌注損傷的分子機(jī)制，為腦缺血-再灌注損傷機(jī)制及牛蒡苷元作為腦缺血-再灌注損傷治療藥物的潛在應(yīng)用研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物、主要試劑和儀器SD大鼠18只，SPF級(jí)，雌性，體質(zhì)量（300±20）g，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001，以常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，12 h晝夜節(jié)律；大鼠購(gòu)入后在SPF動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

牛蒡苷元（純度＞98%）（北京索萊寶科技有限公司）。蘇木素染液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），伊紅染色液（北京索萊寶科技有限公司），甲醇和乙腈等試劑均為色譜純。－80℃冰箱（BDF-86V348）（山東博科控股集團(tuán)有限公司），微型離心機(jī)（D1008E）（美國(guó)SCJLOGEX公司），旋渦混合器（XH-C）（常州越新儀器制造有限公司），全自動(dòng)樣品快速研磨儀（Tiss-12）（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司），超高效液相色譜儀（ExionLC）和高分辨質(zhì)譜儀（Triple TOF 5600）（美國(guó)AB SCIEX公司），天平（BSA124S-CW）（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 局灶性腦缺血模型的制備和分組處理18只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和牛蒡苷元組，每組6只。牛蒡苷元組大鼠灌胃給予100 mg·kg－1牛蒡苷元，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃給予相同劑量的生理鹽水，灌胃量為10 mL·kg－1，連續(xù)灌胃給藥14 d。最后1次給藥干預(yù)后模型組和牛蒡苷元組大鼠采用改良線栓法造模，造模方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［6］，假手術(shù)組大鼠采用相同方式進(jìn)行手術(shù)，但釣魚線的插入深度僅為0.5～1.0 cm，不對(duì)大鼠造成實(shí)質(zhì)性栓塞。再灌注24 h后，采用戊巴比妥鈉對(duì)大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈穿刺采集動(dòng)脈全血5 mL，靜置30 min，分離血清，－80℃保存?zhèn)溆?，之后迅速于冰面上取出完整大腦組織，分離大腦皮層腦梗死周圍半暗帶組織，固定于4%多聚甲醛溶液保存待檢測(cè)。假手術(shù)組大鼠取相應(yīng)部位的腦組織進(jìn)行檢測(cè)。造模24 h期間如有大鼠死亡，則取大鼠重新補(bǔ)齊，保證每組6只大鼠。

1.3 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分再灌注24 h后，參照Longa評(píng)分法［7］對(duì)各組大鼠的神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：正常無(wú)癥狀記為0分；對(duì)側(cè)前爪完全伸展記為1分；行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈記為2分；行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒記為3分；不能自主行走，喪失意識(shí)記為4分。

1.4 HE染色觀察各組大鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)將固定于4%多聚甲醛溶液的缺血半暗帶組織切為2～3 mm厚切片，采用自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行脫水后常規(guī)石蠟包埋并制作3 μm石蠟切片，干燥后的切片采用二甲苯脫蠟，依次采用100%酒精、90%酒精、80%酒精和蒸餾水進(jìn)行水化，之后將切片依次用水和酒精洗滌2～3次，采用伊紅和蘇木素染色，二甲苯透明和封片，采用普通光學(xué)顯微鏡觀察大腦皮層腦梗死周圍半暗帶組織的形態(tài)學(xué)改變。

1.5 代謝組學(xué)分析將血清樣品200 μL，加入600 μL乙腈中，渦旋30 s混勻，4℃、12 000 r·min－1離心15 min沉淀蛋白，取上清400 μL，真空干燥；加入200 μL 50%乙腈復(fù)溶，4℃、12 000 r·min－1離心15 min，取50 μL上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)；所有樣品另取10 μL上清混合為質(zhì)控（quality control，QC）樣品上機(jī)檢測(cè)。

通過(guò)ExionLC超高效液相色譜儀使用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1×100 mm，1.7 μm）色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相為含25 mmol·L－1乙 酸 銨 和25 mmol·L－1氨 水 的水（A）和 乙 腈（B）。梯 度 洗 脫 條 件 如 下：0～0.5 min，5% A、95% B；0.5～7.0 min，5%～35% A、95%～65% B；7.0～8.0 min，35%～60% A、65%～40% B；8.0～9.0 min，60% A、40% B；9.0～9.1 min，60%～5% A、40%～95% B；9.1～12.0 min，5% A、95% B。流 動(dòng) 相 流 速為0.5 mL·min－1，柱溫設(shè)置為25℃，進(jìn)樣體積為2 μL。

質(zhì)譜分析在Triple TOF 5 600高分辨質(zhì)譜儀中進(jìn)行，采用正離子和負(fù)離子模式，通過(guò)IDA模式進(jìn)行高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。每個(gè)循環(huán)選取12個(gè)強(qiáng)度最強(qiáng)且大于100的離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，碰撞誘導(dǎo)解離的能量為30 eV，循環(huán)時(shí)間為0.56 s，離子源參數(shù)如下：GS1：60 psi；GS2：30 psi；CUR：35 psi；TEM：600℃；DP：60 V；ISVF：5 000 V（Pos）/－4 000（Neg）。

使用ProteoWizard軟件將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)為mzXML格式。再使用XCMS做保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分和峰對(duì)齊等工作。同時(shí)通過(guò)R程序包和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定。然后使用Simca v.14.1軟件包（瑞典Umetrics公司）導(dǎo)出處理后的數(shù)據(jù)列表，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），通過(guò)GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)各組之間峰積分的顯著差異進(jìn)行t檢驗(yàn)并進(jìn)行聚類分析，使用MetaboAnalyst 4.0軟件對(duì)差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析。取各代謝物的平均峰強(qiáng)度作為定量依據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分和血清中代謝物峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以-x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分與假手術(shù)組（0.00分±0.00分）比較，模型組大鼠神經(jīng)缺損功能評(píng)分（2.87分±0.51分）明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，牛蒡苷元組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分（1.17分±0.41分）明顯降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織病理形態(tài)表現(xiàn)假手術(shù)組大鼠腦組織中神經(jīng)元胞體橢圓，有突起，胞核圓形，核仁清晰，位于細(xì)胞中心，細(xì)胞質(zhì)染色為淺藍(lán)色，無(wú)明顯病理改變。模型組大鼠腦組織中神經(jīng)元多數(shù)呈三角形，固縮紅染，部分神經(jīng)元脫失，組織稀疏，可見(jiàn)少量膠質(zhì)細(xì)胞增生。牛蒡苷元組大鼠缺血半暗帶組織中神經(jīng)元損傷較模型組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠缺血半暗帶組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE）Fig.1 Pathomorphology of ischemic penumbra tissue of rats in various groups(HE)

2.3 各組大鼠血清PCA對(duì)各組大鼠血清代謝組學(xué)正離子和負(fù)離子模式下代謝物峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，發(fā)現(xiàn)3次重復(fù)的QC樣品緊密地聚合在一起，有良好的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性，證明模型比較可靠。假手術(shù)組、模型組和牛蒡苷元組組間數(shù)據(jù)分離，組內(nèi)數(shù)據(jù)緊密靠攏在一起，表明3組間大鼠血清代謝物水平有明顯變化。見(jiàn)圖2。

圖2 正離子（A)和負(fù)離子(B)模式下樣品PCAFig.2 PCA of samples in positive(A)and negative(B)ion modes

2.4 各組大鼠OPLS-DA在OPLS-DA中，對(duì)于正離子模式，R2X（cum）=0.452，R2Y（cum）=0.994，Q2（cum）=0.900；對(duì)于負(fù)離子模式，R2X（cum）=0.482，R2Y（cum）=0.988，Q2（cum）=0.909；2種模式下R2Y和Q2均超過(guò)0.5，說(shuō)明該統(tǒng)計(jì)模型具有良好的擬合性和預(yù)測(cè)能力。見(jiàn)圖3。

圖3 正離子（A）和負(fù)離子(B)模式下樣品OPLS-DAFig.3 OPLS-DA of samples in positive(A)and negative(B)ion modes

2.5 血清差異代謝物篩選根據(jù)OPLS-DA處理后生成的可變重要性閾值（variable importance in the projection，VIP）對(duì)代謝物進(jìn)行篩選，將其設(shè)置為VIP＞1.2。顯著差異代謝物的P值設(shè)置為0.05。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，本研究通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜鑒定并選擇了26個(gè)有顯著差異的代謝物進(jìn)行進(jìn)一步研究，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中14個(gè)代謝物包括卵磷脂（38∶7）、6-氨基嘧啶-2（1H）-酮鹽酸鹽、γ-谷氨酰纈氨酸、1-神經(jīng)酰胺甘油酰磷酸膽堿、磷脂酰絲氨酸（38∶1）、gigantetronenin、辛二酰甘氨酸、雙酚酸、4-咪唑酮-5-丙酸、丙氨酰谷氨酰胺、β-D-葡萄糖胺、3，3′，4′，5-四羥基二苯乙烯、1H-嘧啶-2，4二酮和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等 水 平 明 顯 降 低（P＜0.05），12個(gè)代謝物包括N-A-乙酰-L-精氨酸、N′-羥甲基降煙堿、煙酰胺核苷酸、1，5-二咖啡?？鼘幩帷⒘姿峒◆?、4-O-咖啡酰莽草酸、丙炔酸、蘋果酸、十八碳二酸、乳清酸、2-酮基丙酸和肌肽等水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，牛蒡苷元組大鼠血清中26個(gè)代謝物變化趨勢(shì)明顯逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 26個(gè)代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)Tab.1 Mass data of 26 metabolites

2.6 差異代謝物聚類分析將上述26個(gè)差異代謝物分為正離子模式和負(fù)離子模式進(jìn)行聚類分析，牛蒡苷元組與假手術(shù)組顏色評(píng)分較為接近，表明牛蒡苷元可以通過(guò)調(diào)控這26個(gè)差異代謝物起到抗腦缺血-再灌注的作用。見(jiàn)圖4。

圖4 26個(gè)差異代謝物聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis diagram of 26 differential metabolites

2.7 差異代謝物通路分析通過(guò)MetaboAnalyst 5.0（https：//www.metaboanalyst.ca/）對(duì)26個(gè) 差 異代謝物進(jìn)行通路分析，結(jié)果顯示：上述代謝物參與組氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、三羧酸循環(huán)、煙酸和煙酰胺代謝、β-丙氨酸代謝、糖酵解/糖異生和丙酮酸代謝等代謝通路，其中組氨酸代謝（P＜0.05）、精氨酸代謝（P＜0.05）和脯氨酸代謝（P＜0.05）是牛蒡苷元抗腦缺血-再灌注作用的主要通路。見(jiàn)圖5。

圖5 26個(gè)差異代謝物通路分析圖Fig.5 Pathway analysis diagram of 26 differential metabolites

3 討 論

腦缺血-再灌注損傷是腦卒中的一個(gè)主要并發(fā)癥，其病理生理機(jī)制存在損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括炎癥損害、氧化應(yīng)激和興奮性氨基酸毒性等［8-9］。其中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激是腦缺血-再灌注損傷的主要原因。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低，大鼠腦組織神經(jīng)元損傷明顯，結(jié)合前期研究［4］結(jié)果，模型組大鼠梗死組織呈白色，與假手術(shù)組（相應(yīng)位置呈玫瑰紅色）比較，模型組大鼠梗死組織面積明顯擴(kuò)大，表明腦缺血-再灌注損傷模型復(fù)制成功；而牛蒡苷元可以明顯改善上述癥狀，表明牛蒡苷元對(duì)腦缺血-再灌注損傷具有較好的保護(hù)作用。對(duì)其保護(hù)腦缺血-再灌注損傷分子機(jī)制進(jìn)一步研究顯示：牛蒡苷元可以通過(guò)調(diào)控氨基酸代謝、能量代謝、糖代謝和脂質(zhì)代謝等減輕腦損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究共發(fā)現(xiàn)26個(gè)重要的差異代謝物參與牛蒡苷元保護(hù)腦缺血-再灌注損傷的分子調(diào)控機(jī)制，其中DHA（VIP=1.49）最值得關(guān) 注。研究［10-13］表明：DHA可以減少缺血性行為障礙、腦梗死、水腫和血腦屏障破壞，對(duì)缺血性缺陷具有神經(jīng)保護(hù)和抗炎作用，該作用與DHA能降低氧化應(yīng)激和c-Jun氨 基 末 端 激 酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/激活蛋白1（activator protein-1，AP-1）信號(hào)及增強(qiáng)核因子紅細(xì)胞系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）表達(dá)有關(guān)。牛

蒡苷元能明顯提升腦缺血-再灌注損傷模型大鼠中DHA水平。其次，牛蒡苷元可以升高3，3′，4′，5-四羥基二苯乙烯（VIP=1.45）水平，3，3′，4′，5-四羥基二苯乙烯是一種抗氧化劑，具有較高的抗氧化活性和清除自由基的能力，可以起到抗缺血-再灌注 損 傷 的 作 用［14］。另 有 研 究［15-16］顯 示：肌 肽（VIP=1.32）在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和神經(jīng)保護(hù)中均起著重要的作用。因此，本研究推測(cè)DHA、3，3′，4′，5-四羥基二苯乙烯和肌肽在牛蒡苷元保護(hù)腦缺血-再灌注損傷分子調(diào)控機(jī)制中起著重要的作用，可以作為生物標(biāo)志物，而其他差異代謝物則需進(jìn)一步的研究。

此外，本研究對(duì)26個(gè)差異代謝物進(jìn)行了通路分析，結(jié)果顯示：26個(gè)差異代謝物主要參與組氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝。已知腦缺血-再灌注損傷模型大鼠組胺釋放增加，組氨釋放增加會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)炎癥的發(fā)生，組胺與L-組氨酸和肌肽等均有密切關(guān)聯(lián)，共同組成組氨酸代謝通路［17］。WANG等［18］研究顯示：組氨酸代謝參與了天麻抗腦缺血-再灌注損傷的分子機(jī)制。此外，精氨酸和脯氨酸代謝也是腦缺血-再灌注損傷分子調(diào)控機(jī)制中的重要通路，已有研究［19-20］顯示：丹紅注射液和銀杏葉提取物均可以通過(guò)調(diào)控精氨酸和脯氨酸代謝起到抗腦缺血-再灌注損傷作用。

綜上所述，本研究通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)探討牛蒡苷元對(duì)大鼠腦缺血-再灌注損傷的分子作用機(jī)制。通過(guò)對(duì)腦缺血-再灌注損傷大鼠差異代謝物通路的分析，表明其主要參與腦缺血-再灌注損傷大鼠組氨酸、精氨酸和脯氨酸代謝。DHA、3，3′，4′，5-四羥基二苯乙烯和肌肽水平在腦缺血-再灌注及牛蒡苷元干預(yù)后有差異，推測(cè)上述代謝物是牛蒡苷元治療腦缺血-再灌注損傷的潛在生物標(biāo)志物，本研究結(jié)果為缺血性疾病的治療提供了參考依據(jù)。