金 昭,王儒帥,王朝陽,何占彪,田復明,王睿君

（1.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院影像診斷科，內蒙古 呼和浩特 010050；2.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院胃腸外科，內蒙古 呼和浩特 010050；3.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經外科 內蒙古自治區(qū)神經系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心，內蒙古 呼和浩特 010050）

在我國，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染率始終居高不下，其為引發(fā)慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜淋巴瘤的主要原因。Hp為Ⅰ類致癌因子，與多種消化道疾病有密切關聯，同時其致病機理復雜而多樣，其感染引發(fā)胃黏膜病變的機制主要包括Hp的黏附定植、毒力因子的釋放和引發(fā)免疫炎癥反應［1-3］。蒙藥梅花草（Parnassia palustris Linn）（烏力地格）系虎耳草科梅花屬植物梅花草的干燥花朵，為蒙古族歷代和民間常用的特色蒙藥，其味甘、苦，無明顯毒性，具有破痞去滯、抑協(xié)日（清熱解毒）等功效。目前，關于梅花草對Hp作用的相關研究尚未見報道。本研究探討梅花草作為一種潛在應用于Hp根除和胃黏膜保護的蒙藥在體內外的抑菌消炎和黏膜保護作用，為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、菌株、藥物、主要試劑和儀器117只6周齡雄性昆明小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2017-0033。Hp菌株（Hp SS1）由北京大學第一醫(yī)院消化內科實驗室保存并惠贈。梅花草采集于內蒙古自治區(qū)赤峰市賽汗烏拉地區(qū)，采集后將整株藥品置于室內自然陰干。經內蒙古醫(yī)科大學蒙醫(yī)藥學院蒙藥鑒定教研室伊麗娜教授鑒定為虎耳草科梅花草屬植物梅花草，委托內蒙古醫(yī)科大學藥學院制劑室處理制備用于實驗。

Hp抗 體（MA5-36068）（美 國Invitrogen公司），白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）（北京達科為生物技術股份有限公司），白細胞介素8（interleukin-8，IL-8）（上海烜雅生物科技有限公司），腫 瘤 壞 死 因 子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（英國Abcam公司），雷貝拉唑鈉腸溶片［衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，規(guī)格10 mg×7粒］、克拉霉素片（上海雅培制藥有限公司，規(guī)格250 mg×8粒），阿莫西林膠囊（珠海聯邦制藥公司，規(guī)格500 mg×48粒），膠體果膠鉍膠囊（山西安特生物制藥有限公司，規(guī)格100 mg×48粒），尿素酶（上?；萏┽t(yī)療科技公司），RNA prep pure Cell/Bacteria Kit（北京天根生化科技有限公司），cDNA合成試劑盒（SYBR@primeScriptTMRTPCR Kit）（上海愛必信生物科技有限公司），HE染色試劑盒（C0105S）（上海碧云天生物技術有限公司），免疫組織化學試劑盒（深圳達盟生物科技有限公司）。

透射電鏡（Tecnai G2 20 S-TWIN）（美國FEI公司），ZN-1000A高速萬能粉碎機（中南制藥機械廠），Bruker AVAIVCEm-500型核磁共振波譜儀（北京布魯克科技有限公司），液相色譜儀（LC-20A）（日本島津公司），超純水機（GYJ1/2-40L-S）（重慶華創(chuàng)責任有限公司），旋轉蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司），電熱套（98-1B型）（天津市秦斯特儀器有限公司），超聲波清洗器（KQ-100型）（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-DⅢ）（鄭州長城儀器有限公司），1 100高效液相色譜議（美國Agilent公司），電子分析天平（AB135-S）（瑞士梅特勒托利多公司），SG1200H超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器廠），DL-1溶劑過濾器（天津市東康科技有限公司）。

1.2 梅花草提取物制備梅花草水提物：稱取30 g干燥梅花草，打粉機粉碎后，注入200 mL去離子水，于95℃水浴中浸提1 h后過濾，過濾后60℃減壓濃縮并量取濃縮液。濃縮液在75℃烘箱中烘干備用，作為梅花草水提物，水提物使用0.22 μm濾器除菌，備用。梅花草乙醇提取物：采用95%乙醇對梅花草加熱回流提取時，梅花草與乙醇的料液比為30 g∶150 mL，加熱溫度為95℃，每次提取4 h，共提取3次，合并3次所得的提取液為梅花草乙醇提取物。將上述梅花草乙醇提取物于噴霧干燥塔內干燥，噴霧干燥塔進風溫度為120℃～150℃，出 風 溫 度 為90℃～95℃，霧 化 頻 率為220～300 Hz，加料頻率為4.0～6.5 Hz，引風頻率為20～50 Hz，可較好保留梅花草固有的芳香物質和熱敏活性成分。梅花草提取物：梅花草乙醇提取物與梅花草水提物等質量混合，用于后期實驗。

1.3 Hp菌株培養(yǎng)采用微需氧培養(yǎng)法，氣體達到微需氧條件（85%氮氣，10%二氧化碳，5%氧氣）。Hp SS1菌株接種于含7%馬血清固體平板上，每100 mL固體Hp培養(yǎng)基中添加1 mL微生物添加劑，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，經快速尿素酶試驗（rapid urease test，RUT）、涂片革蘭染色和觸酶鑒定為陽性后，于上述條件下傳代增菌，接種至腦心浸液中，比濁法調整菌懸濁液濃度為4麥氏濁度，即12×108CFU·mL－1，所得菌株濃度為本研究灌胃所用的實驗濃度。

1.4 瓊脂稀釋法測定最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）采用瓊脂稀釋法測定梅花草提取物的MIC。刮取培養(yǎng)48～72 h的Hp接種于液體培養(yǎng)基中，采用無菌生理鹽水將其稀釋至1.5×108CFU·mL－1。滴加200 μL菌液于培養(yǎng)基表面，涂布棒均勻接種于含有不同濃度（1.25、2.50、5.00、10.00，20.00和40.00 g·L－1）梅花草提取物的平板上，37℃微需氧培養(yǎng)72 h后觀察，以未檢測出Hp生長的最低藥物濃度為MIC。MIC測定根據美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）標準判讀結果。

1.5 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測Hp定植黏附相關基因mRNA表達水平采用純水溶解梅花草水提物至終濃度為20 g·L－1。將培養(yǎng)的Hp菌液用PBS緩沖液重懸至1×107CFU·mL－1，取0.1 mL Hp PBS混懸液加入配好的梅花草溶液中，37℃震蕩微氧孵育24 h，離心棄上清，采用PBS緩沖液沖洗3次后，采用RNA prep pure Cell/Bacteria Kit分離總RNA。cDNA合成按試劑盒操作說明。引物序 列 見 表1。PCR反 應 體 系：cDNA 2 μL，UltraSYBR mixture 25 μL，10 μmol·L－1上 下 游 引物各1 μL，以去離子水補足至50 μL。反應條件：95℃、10 min；95℃、10 s，60℃、1 min，40個循環(huán)。采用2－△△Ct法計算目的基因mRNA表達水平。

表1 Hp定植相關基因引物序列Tab.1 Primer sequences of genes related to Hp colonization

1.6 小鼠體內Hp定植模型設計和干預93只小鼠用于造模，隔1 d灌胃1次，灌胃前禁食12 h，禁水0.5 h，以200 μL濃度為12×108CFU·mL－1Hp活菌，共灌胃6次；生理鹽水組12只，等量滅菌生理鹽水灌胃，隔1 d灌胃1次，每次200 μL，共灌胃6次；空白對照組12只，自然飼養(yǎng)，無任何干預。

在接種Hp 4周后，隨機處死3只小鼠，行RUT快速判斷Hp的感染情況，分析整體感染率；將剩余90只感染小鼠分為6組，分別為Hp組、三聯組、四聯組、梅花草組、三聯+梅花草組和四聯+梅花草組，每組15只。藥物干預參照臨床標準和成人與昆明小鼠體質量換算，包括雷貝拉唑0.02 mg·d－1、阿 莫 西 林1 mg·d－1和 克 拉 霉 素0.5 mg·d－1的三聯療法和四聯療法（外加膠體果膠鉍0.3 mg·d－1），梅花草提取物灌胃20 mg·d－1，每天禁食禁水12 h后灌胃給藥200 μL，給藥后30 min給水進食。連續(xù)灌胃5 d。停藥后第2天，對小鼠實施安樂死，留取血清和胃組織進行相關檢測。酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測各組小鼠血清中IL-2、IL-8和TNF-α水平。

Hp感染率檢測：對小鼠連續(xù)灌胃Hp 5 d，感染4周后，隨機選取3只，采用頸椎脫位法處死，解剖小鼠，沿幽門-賁門線由胃大彎側將胃剪開，參照桐城會議共識［4］，均為Hp陽性，計算Hp感染率。Hp感染率=HP檢測陽性小鼠數/處死小鼠數×100%。感染率＞85%即可滿足實驗要求。

Hp根除率檢測：在上述藥物治療后的第2天，各組處死3只小鼠，檢測感染情況，計算Hp根除率。Hp根除率=（Hp組感染率－治療組感染率）/Hp組感染率×100%。

1.7 透射電鏡觀察各組小鼠胃黏膜上皮組織超微結構將各組小鼠胃黏膜組織于2.5%磷酸鹽緩沖液-戊二醛（pH=7.4）和4℃預冷的1%四氧化鋨固定后迅速嵌入環(huán)氧樹脂中，制備超薄切片，乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，采用透射電鏡觀察小鼠胃黏膜上皮超微結構。

1.8 HE染色和免疫組織化學染色觀察各組小鼠胃黏膜組織病理形態(tài)表現及Hp感染情況按照HE染色試劑盒說明書進行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組小鼠胃黏膜組織病理形態(tài)表現。Hp免疫組織化學染色采用En vision法，Hp菌體陽性著色為黃色。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠Hp定植黏附相關基因mRNA表達水平和小鼠血清中炎癥因子水平均符合正態(tài)分布且方差齊，以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t檢驗；Hp感染率和Hp根除率以百分率（%）表示，組間比較采用Fisher精確檢驗法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 梅花草的MIC瓊脂稀釋法測定MIC結果顯示：于10和20 g·L－1梅花草含藥平板中均未檢測出Hp，即10 g·L－1為梅花草的MIC值。

2.2 Hp中定植黏附相關基因mRNA表達水平與Hp組比較，梅花草組Hp中Bab A、Cag A和Vac A mRNA表達水平降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

表2 Hp定植黏附相關基因mRNA表達水平Tab.2 Expression levels of Hp colonization-and adhesionrelated gene mRNA (n=15，±s）

表2 Hp定植黏附相關基因mRNA表達水平Tab.2 Expression levels of Hp colonization-and adhesionrelated gene mRNA (n=15，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs Hp group.

Group Hp Parnassia palustris Linn Bab A 15.6±0.61 5.93±2.21*Cag A 35.2±2.46 8.50±3.65**Vac A 22.4±0.92 8.14±3.37**

2.3 2組小鼠胃黏膜大體表現和免疫組織化學染色情況大體觀察，Hp組小鼠可見部分胃黏膜糜爛和潰瘍，出血和充血明顯，見圖1A；梅花草組小鼠胃黏膜表面光滑，未見糜爛、出血和潰瘍，胃體和胃竇部腺體完整，無萎縮及上皮瘤內變，見圖1B。免疫組織化學染色，Hp組小鼠胃黏膜上皮細胞表面定植Hp，為棕褐點棒狀或桿狀顆粒；梅花草組小鼠胃黏膜上皮細胞表面無Hp定植，Hp感染為陰性。見圖1C和D。

圖1 2組小鼠胃黏膜大體和組織病理形態(tài)表現Fig.1 Gross morphology and pathomorphology of gastric mucosa tissue of mice in two groups

2.4 各組小鼠Hp感染率和根除率RUT檢測結果顯示：與Hp組比較，梅花草組小鼠Hp感染率降低（P＜0.05）；與Hp組比較，三聯組和四聯組小鼠Hp感染率也均有不同程度的降低（P＜0.05）。梅花草組小鼠Hp根除率與三聯組或四聯組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與三聯組比較，三聯+梅花草組小鼠Hp根除率升高（P＜0.01）；與四聯組比較，四聯+梅花草組小鼠Hp根除率升高（P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠胃黏膜的RUT結果Tab.3 Results of RUT of gastric mucosa of mice in various groups (n=3，η/%）

2.5 各組小鼠胃黏膜組織病理形態(tài)表現和超微結構空白對照組小鼠胃黏膜結構清晰。Hp組可見小鼠胃黏膜脫落、糜爛，黏膜層變薄，結構不完整，有炎性細胞浸潤。三聯組和四聯組小鼠胃黏膜組織病理變化有一定改善。梅花草組小鼠胃黏膜組織厚度增加，三聯+梅花草組和四聯+梅花草組小鼠胃黏膜組織厚度明顯增加。見圖2。

圖2 各組小鼠胃黏膜組織病理形態(tài)表現（HE，×200）Fig.2 Pathomorphology of gastric mucosa tissue of mice in various groups（HE,×200）

透射電鏡觀察：空白對照組小鼠胃黏膜上皮細胞中線粒體結構完整，內嵴清晰；Hp組小鼠胃黏膜上皮細胞中線粒體結構破裂，內嵴紊亂；三聯組和四聯組小鼠胃黏膜上皮細胞中線粒體結構在一定程度上修復，梅花草組小鼠胃黏膜上皮細胞中線粒體結構得到改善，三聯+梅花草組和四聯+梅花組小鼠胃黏膜上皮細胞中線粒體功能得到有效保護。見圖3?？瞻讓φ战M小鼠胃黏膜上皮細胞微絨毛排列整齊，結構較長；Hp組小鼠胃黏膜上皮細胞微絨毛斷裂且消失；三聯組和四聯組小鼠胃黏膜上皮細胞微絨毛損傷均不同程度恢復；梅花草組小鼠胃黏膜上皮細胞微絨毛結構恢復較好，三聯+梅花草組和四聯+梅花組小鼠胃黏膜上皮細胞微絨毛結構整體較好。見圖4。

圖3 各組小鼠胃黏膜上皮細胞中線粒體結構（×10 000）Fig.3 Mitochondrial structures of gastric mucosal epithelial cells of mice in various groups（×10 000）

圖4 各組小鼠胃黏膜上皮細胞微絨毛結構(×10 000)Fig.4 Microvilli structures of gastric mucosal epithelial cells of mice in various groups（×10 000）

2.6 各組小鼠血清中炎癥因子水平與空白對照組和生理鹽水組比較，Hp組小鼠血清中IL-2水平降低（P＜0.01），IL-8和TNF-α水平均升高（P＜0.01）；與Hp組比較，三聯組、四聯組、梅花草組、三聯+梅花草組和四聯+梅花草組小鼠血清中IL-2水平均升高（P＜0.05），IL-8和TNF-α水平降低（P＜0.05或P＜0.01）；與三聯組和四聯組比較，三聯+梅花草組和四聯+梅花草組小鼠血清中TNF-α水平明顯降低（P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠血清中炎癥因子水平Tab.4 Levels of inflammatory factors in serum of mice in various groups [x±s，ρB/（ng·L-1）］

3 討 論

目前臨床治療Hp感染的方法為四聯療法，包括質子泵抑制劑加2種抗生素（如克拉霉素和阿莫西林）與膠體果膠鉍組合。近年來隨著Hp對抗生素的耐藥率不斷升高，Hp根除率在不斷降低。單純通過增加抗生素劑量和延長療程的方法已逐漸暴露出瓶頸，尋求一種安全、高效的抗Hp新藥，已成為現在臨床亟待解決的問題［5-7］。

梅花草在蒙醫(yī)臨床實踐中用于治療肝血痞、間熱痞、內熱痞、脈痞、腸協(xié)日痞和臟腑協(xié)日癥，在臨床上治療黃疸型肝炎、咽喉炎、腮腺炎、脈管炎和肺結核等。目前開展了梅花草提取物在多種實體瘤中的抗腫瘤效果評估［8-10］，采用常規(guī)柱色譜法由梅花草的抗腫瘤活性成分-二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物中分離得到11個單體化合物，如槲皮素、綠原酸、山奈酚、金絲桃苷、沒食子酸和山奈酚-3-O-β-云香糖苷［10］。上述成分均有不同程度抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗病原微生物的作用，也為梅花草提取物抗Hp的治療新途經提供了理論依據［11-14］。但其在抗菌消炎和胃黏膜保護中的作用尚未見相關報道。

中西醫(yī)結合抑制Hp感染的模式在臨床中可使患者受益最大化。Hp感染作為病因，基本等同于中醫(yī)學理論中的“火邪”和“熱邪”的概念。有研究［15-16］顯示：脾胃濕熱證的Hp感染患者與Hp陰性患者比較，其胃黏膜損傷程度明顯加重。脾胃濕熱證的人群由于濕熱邪交阻于中焦，病邪難以祛除，正氣日漸虛弱，久而久之滋生蟲邪，該病理過程類似于現代醫(yī)學中Hp定植和侵襲。Hp感染首先通過表達Bab A等外膜蛋白黏附于胃黏膜細胞上，通過表達Vac A和Cag A等蛋白誘發(fā)炎癥和細胞損傷，進而增加胃黏膜通透性，利于其遷移。Bab A是Hp外膜蛋白基因，可特異性結合宿主細胞受體，賦予Hp持久定植能力；高毒力Hp菌株參與Cag A轉運和宿主的炎癥反應。Vac A能夠破壞細胞內吞作用，抑制免疫細胞，導致免疫耐受和慢性感染。脾胃濕熱作為病理基礎，易于Hp感染，又可作為病理因素，進一步加劇胃黏膜的炎癥反應，因此在治療中注重除濕清熱的中醫(yī)思路，以觀察具有清熱除濕作用的梅花草對于Hp體內和體外的治療效果。

Hp可誘發(fā)多種胃部疾病，其機制可能與Hp產生多種酶、破壞黏膜結構、分泌毒素和損傷免疫等有關。臨床常采用鉍劑四聯對Hp感染者進行治療，但近年來隨著Hp耐藥性增加，療效逐漸降低。現階段聯合中醫(yī)治療可提高療效，如傳統(tǒng)三聯或四聯聯用荊花胃康、半夏瀉心湯和香砂六君子湯等，均呈現了一定的組合優(yōu)勢［17-20］。本研究結果顯示：梅花草可協(xié)同Hp根除和具有保護胃黏膜的作用，歸結為清熱解毒之效，可有效提高Hp的根除率。證實梅花草提取物可在體內外有效抑制Hp生長、定植和侵襲能力，保護和修復胃黏膜，降低Hp感染后IL-8和TNF-α水平，保護胃黏膜亞細胞器結構的完整性，如線粒體和微絨毛結構，當聯合三聯或四聯時，Hp根除和胃黏膜修復效果更佳。

綜上所述，梅花草提取物可以作為抗Hp治療的候選藥物，配合傳統(tǒng)三聯或四聯療法，可提高Hp根除效果，同時有效改善胃黏膜的炎癥狀態(tài)，促進黏膜修復，具有潛在的臨床轉化應用價值。