杜聯(lián)江，李京濤，崔 杰

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球常見(jiàn)的癌癥之一，具有死亡率高、進(jìn)展快、預(yù)后差的特點(diǎn)，占原發(fā)性肝癌(PLC)的90%[1，2]。HCC的病因和發(fā)生機(jī)制目前尚未完全明確，其發(fā)生發(fā)展受多種因素、多個(gè)步驟病變的影響，如病毒性肝炎、酗酒、黃曲霉毒素污染等均是HCC發(fā)病的危險(xiǎn)因素[3]。在發(fā)病過(guò)程中，還可能存在細(xì)胞分裂和細(xì)胞增殖相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)異常[4]。半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific protease-3，caspase-3)是caspase蛋白酶家族中的一類(lèi)，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程?；罨腸aspase分子可催化裂解眾多效應(yīng)分子，參與肝癌細(xì)胞的凋亡過(guò)程[5]。誘捕受體3(decoy receptor 3，DcR3)蛋白是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的一員，參與機(jī)體抗凋亡和細(xì)胞調(diào)節(jié)過(guò)程，擾亂免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，促進(jìn)肝癌的發(fā)生[6]。小分子核仁宿主基因12 (small nucleolar host gene 12，SNHG12)是一種具有重要調(diào)控作用的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，既往研究顯示其在腫瘤組織呈異常高表達(dá)[7]。本文檢測(cè)了HCC患者癌組織caspase-3和DcR3蛋白表達(dá)及SNHG12 mRNA水平變化，并分析了檢測(cè)的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年5月～2019年5月我院收治的HCC患者68例，男性39例，女性29例；年齡為49～68歲，平均年齡為(55.3±5.2)歲。經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查診斷，其中血管浸潤(rùn)39例，無(wú)血管浸潤(rùn)29例。納入患者既往無(wú)經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞或放療治療史，預(yù)計(jì)生存期>6個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)其他類(lèi)型的肝癌；(3)存在自身免疫性疾病。所有患者簽署知情同意書(shū)，本研究符合《赫爾辛基宣言》和其附錄準(zhǔn)則。

1.2 肝癌組織和癌旁組織caspase-3和DcR3蛋白表達(dá)和SNHG12 mRNA水平檢測(cè) 所有HCC患者均在我院行手術(shù)切除治療，在肝癌組織和癌旁組織取樣，置入液氮中，再移入超低溫冰箱凍存。取癌組織和癌旁組織，石蠟包埋、切片。采用EnVision法(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Active Motif公司)檢測(cè)caspase-3和DcR3蛋白表達(dá)，以試劑盒提供的已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。將切片脫蠟至水，高壓修復(fù)抗原，加一抗4℃孵育24 h，洗滌，加二抗37℃孵育1 h，PBS沖洗，加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色10～30 s，蘇木精復(fù)染3 min，用PBS洗滌、返藍(lán)15 min，封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。caspase-3和DcR3蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)染色為棕黃色為陽(yáng)性。采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)法檢測(cè)SNHG12 mRNA，取癌組織和癌旁組織各100 mg，使用Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，PCR反應(yīng)體系為20 μl，SNHG12上游引物：5’-TGGCGCCTTGTACT-TCTACC-3’，下游引物：5’-AGACGGAAAAATCCGGTCCC-3’。 95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；55 ℃ 30 s；70 ℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。經(jīng)電泳后觀察結(jié)果，計(jì)算SNHG12 mRNA水平。

1.3 隨訪(fǎng) 采用門(mén)診或電話(huà)隨訪(fǎng)2年，第一年每3個(gè)月隨訪(fǎng)1次，第二年每6個(gè)月隨訪(fǎng)1次，隨訪(fǎng)終點(diǎn)為患者全因死亡或截至到2021年6月15日，記錄生存情況。

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁組織caspase-3和DcR3蛋白表達(dá)及SNHG12 mRNA水平比較 癌組織caspase-3陽(yáng)性率顯著低于癌旁組織(P<0.05)，而DcR3陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織(P<0.05)，SNHG12 mRNA水平也顯著高于癌旁組織(P<0.05，表1)。

表1 癌組織與癌旁組織caspase-3和DcR3蛋白表達(dá)(%)及SNHG12 水平比較

2.2 不同臨床和病理學(xué)特征癌組織caspase-3和DcR3蛋白表達(dá)及SNHG12 mRNA水平比較 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HCC組織caspase-3陽(yáng)性率顯著低于，而DcR3蛋白陽(yáng)性率顯著高于，SNHG12 mRNA水平也顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(P<0.05，表2)，>5 cm癌組織SNHG12 mRNA水平顯著高于<5 cm癌組織(P<0.05，表2)。

表2 不同臨床和病理學(xué)特征癌組織蛋白表達(dá)(%)和SNHG12水平比較

2.3 影響HCC患者死亡的危險(xiǎn)因素分析 截止到隨訪(fǎng)終點(diǎn)，本組68例HCC患者生存30例(44.1%)，死亡38例(55.9%)；Log-rank分析顯示，42例caspase-3低表達(dá)、40例DcR3高表達(dá)和45例SNHG12 mRNA高水平(>2.1)HCC患者中位生存時(shí)間分別為21.0(16，25)、21.0(16，24)和20.0(17，25)個(gè)月，而相對(duì)應(yīng)的高表達(dá)、低表達(dá)和低水平患者則分別為31.0(25，35)、32.0(26，36)和34.0(27，37)個(gè)月(P<0.05，圖1)；多元Logistic回歸分析顯示，腫瘤直徑大、合并肝硬化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Caspase-3低表達(dá)、DcR3蛋白高表達(dá)和SNHG12高水平是HCC患者死亡的危險(xiǎn)因素(P<0.05，表3)。

圖1 不同蛋白表達(dá)和基因水平患者生存曲線(xiàn)A：高與低caspase-3表達(dá)HCC患者生存曲線(xiàn)；B：高與低DcR3蛋白表達(dá)HCC患者生存曲線(xiàn)；C：高與低SNHG12 mRNA水平HCC患者生存曲線(xiàn)

表3 多元Logistic回歸分析HCC患者死亡的危險(xiǎn)因素

3 討論

有研究表明[8-11]，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞的非正常凋亡有關(guān)。腫瘤細(xì)胞通過(guò)破壞正常細(xì)胞凋亡，逃避凋亡進(jìn)而生長(zhǎng)、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)化[12]。caspase-3是caspase家族中的重要成員之一，是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶之一，其介導(dǎo)的凋亡與多種癌癥發(fā)生有關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，68例肝細(xì)胞癌組織caspase-3陽(yáng)性率為47.1%，顯著低于癌旁組織的77.9%，并且其在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HCC患者癌組織表達(dá)有顯著差異，提示caspase-3表達(dá)降低可能參與了腫瘤的進(jìn)展和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，因?yàn)閏aspase-3在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。隨著HCC進(jìn)展，caspase-3活性受到抑制，引起細(xì)胞凋亡障礙，可能進(jìn)一步引起腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。除此之外，生存分析也顯示caspase-3低表達(dá)的HCC患者中位生存期顯著短于高表達(dá)組，提示caspase-3表達(dá)減少或者不表達(dá)可能會(huì)引起腫瘤細(xì)胞凋亡減少，而腫瘤細(xì)胞增殖增加，加速肝癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，縮短患者生存時(shí)間。

DcR3蛋白是可溶性腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體超家族的一員，是分泌型蛋白的一種。它可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FasL和LIGHT，抑制FasL和LIGHT介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生過(guò)程中起抗細(xì)胞凋亡作用[14]。除此之外，DcR3蛋白還有較強(qiáng)的抑制T細(xì)胞分化的作用，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，有利于癌細(xì)胞生長(zhǎng)[15]。DcR3蛋白的抗凋亡和細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制可能導(dǎo)致宿主免疫功能調(diào)節(jié)障礙，在一定程度上有助于肝癌細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)[16]。本研究結(jié)果顯示，HCC患者癌組織DcR3蛋白陽(yáng)性率為61.8%，顯著高于癌旁組織，并且其在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織陽(yáng)性表達(dá)顯著增強(qiáng)。生存分析也顯示，DcR3蛋白高表達(dá)的HCC患者中位生存期顯著短于低表達(dá)組，提示DcR3蛋白高表達(dá)的患者預(yù)后差。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表明腫瘤惡性程度高，預(yù)后差。通過(guò)對(duì)DcR3蛋白表達(dá)率的篩查可在一定程度上反映腫瘤組織的惡性程度，對(duì)預(yù)后判斷有一定的積極意義。

非編碼RNAs是不具有蛋白編碼功能的RNAs，SNHG12是其中一類(lèi)具有調(diào)控作用的長(zhǎng)鏈非編碼RNAs。有研究表明[17]，SNHG12可上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白表達(dá)水平，有促進(jìn)血管生成的作用。本研究顯示，HCC患者癌組織SNHG12 mRNA水平顯著高于癌旁組織，其在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤直徑長(zhǎng)患者水平也顯著升高，提示隨著肝癌進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞不斷分化增殖，腫瘤直徑隨之增加，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，SNHG12水平也升高。肝臟是人體最大的代謝器官，肝臟內(nèi)血供豐富。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)需要豐富的血供，SNHG12水平升高則促進(jìn)肝癌的進(jìn)展、惡化[18]。生存分析顯示，SNHG12高水平的HCC患者中位生存期顯著短于低水平組，提示SNHG12高水平患者預(yù)后差。

本研究經(jīng)多元Logistic回歸分析顯示，腫瘤直徑較大、合并肝硬化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、caspase-3低表達(dá)、DcR3蛋白高表達(dá)和SNHG12高水平是HCC患者死亡的危險(xiǎn)因素。隨著癌癥進(jìn)展，伴隨肝硬化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的HCC患者，腫瘤惡性程度高，預(yù)后差。caspase-3是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵“執(zhí)行者”，而DcR3蛋白被發(fā)現(xiàn)具有抗凋亡作用，在肝癌組織表達(dá)上調(diào)，能幫助腫瘤細(xì)胞分化增殖。SNHG12在許多癌組織表達(dá)增強(qiáng)，如胃癌和膽管細(xì)胞癌等[19，20]。結(jié)合本研究發(fā)現(xiàn)，可推論caspase-3表達(dá)降低、DcR3蛋白表達(dá)增強(qiáng)和SNHG12水平升高在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起重要作用。通過(guò)積極治療原發(fā)和伴隨疾病，提高caspase-3表達(dá)，抑制DcR3蛋白表達(dá)或降低SNHG12水平可能成為治療肝癌新的靶點(diǎn)，對(duì)改善患者預(yù)后，提高生存率有幫助。