付 榮，吳康卉，石翠翠，范建高，李光明

急性肝損傷(acute liver injury，ALI)是臨床常見的由肝炎病毒、藥物副作用、酒精濫用、代謝綜合征或細(xì)菌感染等引起的肝臟疾病。盡管病因有相當(dāng)大的差異，但這些病因均能激活免疫反應(yīng)，在最初的損傷后增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，并可能導(dǎo)致肝細(xì)胞過度死亡，進(jìn)而導(dǎo)致肝功能衰竭[1]。目前，尚無針對ALI的特異性臨床治療方法。溴結(jié)構(gòu)域(bromodomains，BRDs)是一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用模塊，具有表觀遺傳調(diào)控作用。通過特異性的結(jié)合組蛋白和其他蛋白上的乙?；嚢彼嵴{(diào)控基因表達(dá)。根據(jù)結(jié)構(gòu)/序列相似性，人類基因組中的61個(gè)BRD聚類為8個(gè)家族[2,3]。在這8個(gè)家族中，溴域和末端外結(jié)構(gòu)域(bromodomain and extra-terminal，BET)蛋白家族最為突出。BET家族由BRD2、BRD3、BRD4和BRDT結(jié)構(gòu)域組成[4,5]。BET蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的多個(gè)層面，在表觀遺傳方面展現(xiàn)出了重要的作用。BET家族蛋白功能失調(diào)參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展。靶向抑制BET已經(jīng)被報(bào)道可以應(yīng)用于多種炎癥相關(guān)性疾病和腫瘤的治療[6-9]。研究表明，炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)在肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，抑制肝臟炎癥反應(yīng)能夠有效地緩解肝損傷[10,11]。38號化合物作為選擇性的BET抑制劑，能夠選擇性地抑制組織BRD2、BRD3、BRD4和BRDT表達(dá)[12]，推測它也可以通過緩解炎癥反應(yīng)對ALI起保護(hù)作用。CCl4誘導(dǎo)的小鼠ALI模型被廣泛應(yīng)用于評價(jià)保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，因?yàn)镃Cl4通過細(xì)胞色素P450代謝形成中間體，進(jìn)而能產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化和肝損傷，與人類急性化學(xué)性肝損傷的發(fā)生機(jī)制相似[13]。本研究旨在使用CCl4誘導(dǎo)的小鼠ALI模型，探究了38號化合物對ALI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物和主要試劑 8～10周齡雄性C57BL/6小鼠24只，由中科院藥物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，自由食水。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)操作均通過中科院上海藥物研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。LPS(EColi，菌株O111.B4)購自美國Sigma公司。羥丙基甲基纖維素(HPMC)、CCl4、橄欖油均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司。38號化合物由中科院上海藥物研究所惠贈(zèng)。RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄劑購自諾唯贊南京生物技術(shù)有限公司。HE、F4/80+和 LY-6G+免疫組化染色試劑盒購自武漢谷歌生物。檢測ALT和AST試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞炎癥模型的建立 取鼠源的巨噬細(xì)胞系Raw264.7細(xì)胞(中科院上海藥物研究所)，培養(yǎng)于含1%鏈霉素和青霉素的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，加10%血清(Gibco澳洲胎牛血清)，培養(yǎng)于CO2體積分?jǐn)?shù)為0.05的、恒溫37℃的培養(yǎng)箱。以每孔1×106的密度接種于六孔板中。待細(xì)胞貼壁后，加入LPS(1 μg/mL)[14,15]和38號化合物(濃度分別為80 nM、40 nM、20 nM、10 nM)共刺激培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)條件同前。去上清，采用Trizol法提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用qRT-PCR法檢測IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA水平。以Gapdh為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT分析數(shù)據(jù)。引物序列為：反向IL-1β ：TGGATGCTCTCATCAGGACAG；GAPDH：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA；IL-6：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG；TNF-α：CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG；正向IL1-β ：GAAATGCCACCTTTTGACAGTG；GAPDH：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG；IL-6：CTGCAAGAGACTTCCATCCAG；TNF-α：CAGGCGGTGCCTATGTCTC。

1.3 ALI小鼠模型的建立 取C57BL/6小鼠，飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房。取CCl4，溶于橄欖油，配成10% 的CCl4溶液。取38號化合物，溶解于0.5%HPMC、1%DMSO和PBS溶劑中配制成溶液。取24只小鼠，隨機(jī)分為對照組、模型組和干預(yù)組，每組8只。在對照組，給予溶劑橄欖油2 ml.kg-1，腹腔注射，0.5%HPMC、1%DMSO和PBS溶劑灌胃；在模型組，給予10% CCl4溶液2 ml.kg-1，腹腔注射1次[16]，0.5%HPMC、1%DMSO和PBS溶劑灌胃；在干預(yù)組，給予化合物溶液10 mg.kg-1，灌胃，提前給藥2次。在第2次給藥后2 h，給予10% CCl4溶液2 ml.kg-1,腹腔注射。在CCl4注射后48 h，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，給予異氟烷吸入麻醉、經(jīng)眼球取血，處死。全血經(jīng)4℃、3000 r/m離心15 min，取上層血清，保存于-80℃冰箱。取肝組織，部分保存于-80℃冰箱，另一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定。在固定48 h后，常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色。用抗F4/80 (1:100，MAB5580，RD)、抗Ly-6G(1:100，MAB1037-100，RD)行免疫組化染色。

1.4 血清檢測 使用日立全自動(dòng)Hitachi 7020生化分析儀 檢測血清ALT和AST。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA水平比較 與對照組比，模型組細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA水平顯著升高(P<0.05)，而干預(yù)組顯著下降(P<0.05)，且呈現(xiàn)出濃度依賴性(表1)。

表1 各組細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA水平比較

2.2 各組血生化指標(biāo)比較 模型組血清ALT和AST水平顯著高于對照組(P<0.05)，而干預(yù)組血清ALT和AST水平顯著低于模型組(P<0.05，表2)。

表2 各組血清ALT和AST水平比較

2.3 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn)比較 模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥反應(yīng)明顯，肝細(xì)胞壞死，正常小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，提示造模成功；在藥物干預(yù)處理后，肝組織壞死面積減少，結(jié)構(gòu)紊亂和小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕(圖1)；與對照組比，模型組小鼠肝組織間隙巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞大量聚集，炎癥反應(yīng)明顯，而經(jīng)過38號化合物干預(yù)處理后，肝組織間隙浸潤的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯減少(圖2、圖3)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)①對照組；②模型組；③干預(yù)組

圖2 各組小鼠肝組織LY-6G+中性粒細(xì)胞表現(xiàn)①對照組；②模型組；③干預(yù)組

圖3 各組小鼠肝組織F4/80+巨噬細(xì)胞表現(xiàn)①對照組；②模型組；③干預(yù)組

3 討論

炎癥反應(yīng)在急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中至關(guān)重要。在肝組織受損后，肝組織巨噬細(xì)胞啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子，導(dǎo)致旁分泌激活肝細(xì)胞保護(hù)或者凋亡相關(guān)信號通路，招募更多與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞進(jìn)入受損部位，形成級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步加重肝損傷[17-20]。因此，調(diào)控炎癥反應(yīng)可能對肝損傷起到保護(hù)作用[21,22]。在LPS刺激構(gòu)建的巨噬細(xì)胞炎癥模型實(shí)驗(yàn)證明，不同濃度38化合物干預(yù)處理能明顯降低巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA水平，且該作用呈現(xiàn)出濃度依賴性。進(jìn)一步構(gòu)建體內(nèi)模型評價(jià)38號化合物在體內(nèi)的抗炎作用，用CCl4腹腔注射一次構(gòu)建ALI小鼠模型，結(jié)果模型組小鼠出現(xiàn)了明顯的ALI病理學(xué)表現(xiàn)，包括肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞壞死，正常肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，大量炎癥細(xì)胞聚集等，而藥物干預(yù)組上述病理學(xué)表現(xiàn)均顯著減輕。本實(shí)驗(yàn)從血清生化水平和組織病理學(xué)表現(xiàn)等方面進(jìn)行了較全面的評價(jià)，表明該化合物在體內(nèi)外具有良好的抗炎效果。

本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)體外兩方面分別評價(jià)了38號化合物(其分子結(jié)構(gòu)式見圖4)的抗炎效果，證明了該化合物可以緩解CCl4注射引起的ALI小鼠肝損傷，其機(jī)制可能與減少炎癥因子的釋放和炎癥細(xì)胞的聚集有關(guān)。ALI經(jīng)常伴隨著較高的死亡率，目前并沒有特異的治療藥物，38號化合物所呈現(xiàn)的保護(hù)作用提示其可能作為一個(gè)潛在的候選藥物而應(yīng)該得到進(jìn)一步的驗(yàn)證。

圖4 38號化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)