羅 強，韋吳迪,,3，王 剛，何錦豪，張 洪，包秀麗，陳麗香，蔣俊俊,,3，葉 力,,3，梁 浩,,3△

（1.廣西醫(yī)科大學生命科學研究院，再生醫(yī)學與醫(yī)用生物資源開發(fā)應用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，廣西艾滋病防治研究重點實驗室，南寧 530021；3.中國（廣西）-東盟新發(fā)傳染病聯(lián)合實驗室，南寧 530021）

馬爾尼菲籃狀菌（talaromyces marneffei，TM）是一種溫度依賴型二相真菌，作為一種機會性的致病性真菌，可在免疫系統(tǒng)功能低下人群中引起感染性疾病，尤其是在HIV/AIDS 人群[1]。HIV/AIDS 合并TM感染可導致高復發(fā)率與病死率[2]，是一種嚴重危害人類健康的病原體。目前的研究主要聚焦于TM與宿主間的相互作用[3]，但關于TM潛伏感染與復發(fā)的機制尚未闡明。傳統(tǒng)真菌相關研究主要涉及細胞與動物感染模型構建，而動物實驗需在特定時間處死小鼠并取材，觀察臟器變化和真菌負荷等指標，進而評估TM的感染進程[4-6]。然而，該手段無法實現(xiàn)對TM感染全過程的動態(tài)監(jiān)測。因此建立一種可追蹤的工具菌來實時評估TM的感染進程尤為重要。

生物發(fā)光成像作為一種非侵入性的成像方法，廣泛的應用于細胞、細菌、真菌及病毒的實時追蹤。其中，基于螢火蟲熒光素—熒光素酶（firefly luciferase，Luc）的報告系統(tǒng)研究最為廣泛，該方法涉及腫瘤進展的監(jiān)測、疾病診斷與治療、病原微生物感染的實時監(jiān)測等多個方面[7-10]。該技術已應用在白色念珠菌的研究中，以基因組學技術將Luc 基因整合至真菌基因組，實現(xiàn)對真菌的標記，可視化真菌在宿主體內的定植部位以及評價藥物對真菌的清除效果[11]。然而，尚未有利用Luc標記TM菌株的報道。本研究采用農桿菌介導轉化（agrobacteriun tumefaciens-mediated transformation，ATMT）將Luc基因插入TM基因組，使TM菌株可穩(wěn)定表達Luc基因，并在形態(tài)與功能上與TM標準株比較，探究TMLuc作為工具菌的效果及潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與菌株 TM 標準株ATCC18224，購買于美國ATCC；pASP-hyg 質粒購于武漢銳志魔方生物科技有限公司；農桿菌感受態(tài)細胞EHA105 購于上海維地生物技術有限公司；THP-1 細胞系購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.1.2 主要試劑 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase（NEB），2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）（Vazyme），ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit（Vazyme），HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme），EHA105（pSoup）（唯地生物），LB培養(yǎng)基（海博生物），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（青島海博），卡那霉素（索萊寶），利福平（索萊寶），As 乙酰丁香酮（索萊寶），潮霉素B（索萊寶），DMEM basic 高糖培養(yǎng)液（Gibco），RPMIMedium 1640 basic培養(yǎng)液（Gibco）。

1.1.3 主要儀器 PCR 儀（ABI），北京六一電泳儀（DYY-7C），哈東聯(lián)恒溫搖床（DLHR-X250），化學成像系統(tǒng)（Bio-Rad Chem Doc），冷凍離心機（Beckman Microfuge 20R），微量移液器（瑞寧），微量分光光度計（Thermo Nanodrop 2000），活體成像動物儀（PerkinElmer），Cyto FLEX2 流式細胞儀（Beckman Coulter）。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdALuc的構建 以pGL3-basic質粒為模板，設計Luciferase 引物進行擴增，引物序列見表1。對pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP載體骨架進行雙酶切。37 °C 反應1 h，80 °C 失活10 min，之后通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收酶切后的載體骨架，將回收的PCR 產物與酶切后回收的pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP 載體骨架進行重組連接。37°C 反應30 min 后迅速置于冰上冷卻；隨后將重組產物轉化至TranT1感受態(tài)細胞，涂布于含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB 培養(yǎng)基上，37°C 培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h；挑取重組反應轉化平板上若干個克隆進行菌落PCR 鑒定，引物見表1。擴增后進行電泳驗證，隨后對目標菌落擴大培養(yǎng)，進行小質粒提取并進行測序。

表1 Luciferase引物序列

1.2.2 潮霉素濃度篩選 將TM標準株涂布于含有不同濃度潮霉素（0 μg/mL，20 μg/mL，40 μg/mL，60 μg/mL，80 μg/mL，100 μg/mL）沙氏葡萄糖培養(yǎng)基平板中，在37°C溫箱中培養(yǎng)3 d，篩選出無菌落生長的最低潮霉素濃度。

1.2.3 農桿菌轉化培養(yǎng)及TM-Luc轉化子的構建 取適量重組質粒與EHA105 感受態(tài)細胞，加入無抗生素的LB 液體培養(yǎng)基在28°C 環(huán)境下培養(yǎng)2～3 h，離心留取上清，將上清涂布于含50 μg/mL 卡那霉素，20 μg/mL 利福平的LB 平板繼續(xù)培養(yǎng)2 d，挑取陽性克隆株于含20 mg/LAs 的LB 液體培養(yǎng)基，28°C震蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.8左右待用。將含有質粒的EHA105感受態(tài)細胞與TM標準株按比例進行共培養(yǎng)24 h，收集懸液涂布至含潮霉素的沙氏葡萄糖培養(yǎng)基平板上，放入37°C 溫箱培養(yǎng)至有菌落產生，隨后挑取菌落至新的含潮霉素的沙氏葡萄糖培養(yǎng)基平板進行擴大培養(yǎng)，提取基因組進行PCR 鑒定，引物見表2。

表2 TM-Luc引物序列

1.2.4 TM 標準株與TM-Luc 生長形態(tài)對比 根據(jù)說明書配比配置PDA與BHI培養(yǎng)基，121°C，20 min高壓后，倒入培養(yǎng)皿中，待其冷卻后分別在培養(yǎng)皿中央滴加10 μL TM 標準株菌液或TM-Luc 菌液，PDA和BHI培養(yǎng)基分別放入27°C和37°C培養(yǎng)箱，持續(xù)培養(yǎng)18 d；每日取出培養(yǎng)皿進行拍照，采用十字交叉法量取菌落直徑。

1.2.5 細胞培養(yǎng)與感染模型構建 使用RPMIMedium 1640 basic（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液）完全培養(yǎng)液培養(yǎng)THP-1 細胞，并置于37 °C、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。使用含有PMA的DMEM（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液）完全培養(yǎng)液刺激48 h，即可轉化為THP-1 來源的巨噬細胞。隨后用TM標準株與TM-Luc感染THP-1巨噬細胞，感染復數(shù)為1∶3，分別收集感染后24 h、48 h的總RNA進行后續(xù)炎癥因子檢測，同時收集24 h、48 h和72 h的細胞懸液進行細胞死亡情況的檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8與SPSS Statistics 26軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（），假設檢驗采用Student t檢驗與雙因素重復測量方差分析檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdALuc的構建及驗證

使 用NcoI、BstEII酶切pCAMBIA1303-TrpCHygro-gpdA-GFP 質粒（圖1A），經瓊脂糖凝膠電泳回收后與擴增的Lucifera 產物（圖1D）進行重組連接，構建pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-Luc 重組質粒（圖1B），挑取重組反應產物進行PCR 鑒定，在12 個單克隆菌落中發(fā)現(xiàn)3 個菌落在目的位置出現(xiàn)條帶（圖1C）。隨后挑選其中一個單克隆菌落（泳道7）進行擴大培養(yǎng)，提取少量質粒進行測序比對，比對結果證明重組質粒構建成功。

圖1 Luc質粒和轉化產物的構建與驗證

2.2 TM標準株對潮霉素的敏感性篩選

在早期研究結果的基礎上[12]，本課題組摸索了TM標準株在含不同濃度的潮霉素培養(yǎng)基上的生長情況。結果顯示TM 標準株在含有80 μg/mL 的潮霉素培養(yǎng)基上不生長，見圖2。

圖2 潮霉素濃度對TM標準株的生長影響

2.3 農桿菌侵染TM標準株

通過ATMT 法將Luc 基因插入TM 標準株的基因組中，對轉化子進行PCR 擴增和Luciferase 的檢測，電泳結果在500～750 bp 之間出現(xiàn)條帶（圖3A）；成像結果見圖3B，在D-熒光素鉀鹽底物存在時，TM-Luc 可發(fā)出明顯的熒光，證明TM-Luc 構建成功。

圖3 TM-Luc的驗證

2.4 TM-Luc 與TM 標準株生長形態(tài)與生長速率的對比

兩種菌株分別放置于27°C 與37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)14 d記錄菌落生長情況。二者在PDA培養(yǎng)基生長形態(tài)均為扁平絨毛狀，可在菌落底部觀察到特征性紅色素擴散現(xiàn)象（圖4A）；在BHI培養(yǎng)基上呈深褐色，表面光滑（圖4A）。培養(yǎng)14 d后，在PDA培養(yǎng)基中，TM 標準株生長直徑為（6.54 ± 0.22）cm，TM-Luc 生長直徑為（6.45 ± 0.23）cm，兩者之間的生長曲線（P=0.273）與生長速率曲線（P=0.49）比較，差異均無統(tǒng)計學差異（圖4B、圖4C）。熒光顯微鏡下觀察二者形態(tài)相似，均可發(fā)現(xiàn)經典的帚狀枝形態(tài)（圖4A）。

圖4 TM標準株與TM-Luc生長情況

2.5 TM標準株與TM-Luc對THP-1巨噬細胞的影響

在比較了二者的生長情況后，本課題組探索了兩種菌株對THP-1巨噬細胞的影響。TM標準株和TM-Luc 與THP-1 來源的巨噬細胞共培養(yǎng)后，檢測24 h 和48 h 的炎癥因子TNFA、IL1B和IL10的表達水平，差異無統(tǒng)計學意義（圖5A）；在細胞死亡的檢測中，觀察到TM-Luc 對于THP-1 巨噬細胞的殺傷稍少于TM 標準株（圖5B），雖在48 h 時有差異，但隨著時間延長，二者對細胞殺傷效果趨于一致。

圖5 TM標準株與TM-Luc感染THP-1巨噬細胞

3 討論

本研究采用ATMT 法將Luc 基因轉入TM 的基因組，從而構建穩(wěn)定轉化的TM-Luc。農桿菌介導的轉化法受體材料廣泛，分生孢子、原生質體、菌絲體等材料都可進行遺傳轉化。相較于原生質體轉化、脂質體轉化等方法，ATMT 轉化難度低、轉化效率高、轉化子遺傳穩(wěn)定高，并且T-DNA 隨機整合至基因組，這些優(yōu)點讓ATMT廣泛應用于動植物的真菌疾病病理研究中[13]。在TM基因組插入誘變的研究中，發(fā)現(xiàn)T-DNA在TM基因組的整合方式為隨機整合，并且部分突變體表現(xiàn)出形態(tài)方面的異質性，如可溶性紅色素產生缺陷、分生孢子較少甚至無分生孢子等現(xiàn)象[14]。這表明T-DNA 的插入可能會對宿主的基因組造成影響，從而影響宿主的形態(tài)或功能。

本課題組將農桿菌LB 與RB 序列間的T-DNA替換為Luc 基因，從而將Luc 基因整合至TM 基因組，因其在整合過程中的隨機性，筆者針對TM-Luc與TM標準株之間的形態(tài)與部分功能特征進行了對比，結果發(fā)現(xiàn)TM-Luc 可產生特征性的可溶性紅色素，并且菌落形態(tài)、生長直徑等與TM 標準株無差異。TM-Luc 和TM 標準株與THP-1 來源的巨噬細胞共培養(yǎng)后，TNFA、IL10等炎癥因子的表達趨勢一致；在TM 殺傷巨噬細胞實驗中，發(fā)現(xiàn)TM-Luc 對巨噬細胞的殺傷較弱于TM 標準株，在48 h 時差異具有統(tǒng)計學意義，而72 h時細胞死亡趨勢趨于一致。

Luc 在動物活體成像領域的應用十分廣泛，同一批次的動物可得到所有動物的橫向實驗數(shù)據(jù)，也可得到單個動物的縱向實驗數(shù)據(jù)，避免了批次間的誤差，實驗數(shù)據(jù)更加真實。本研究構建的TM-Luc目前僅用于細胞感染模型的構建，和TM 標準株進行了部分形態(tài)與功能學特征進行了對比。后續(xù)將TM-Luc應用于動物感染模型的構建，可為TM的體內機制研究提供新的手段。