張夢師，黃奕璇，李潔蓮，易敏銘，肖 敏，郭 超，黃春英△，楊 斌△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021；2.玉林市中醫(yī)院肝病科，玉林 537000；廣西醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院，貴港 537100）

全球每年有200 萬人死于肝臟疾病，因肝硬化和肝癌死亡的人數(shù)占疾病總死亡人數(shù)的3.5%[1]。肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌的必經(jīng)病理環(huán)節(jié)。若能及時(shí)醫(yī)治，將有助于減輕肝硬化和肝癌的發(fā)生。棒柄花葉為大戟科植物棒柄花Cleidion brevipetiolatumPax et Hoffm 的干燥枝葉。為廣西壯藥，民間用于治療黃疸、急慢性肝炎、痢疾、熱淋等[2]。研究表明棒柄花方可明顯改善肝炎患者肝功能、降低患者膽紅素，對肝炎肝膽濕熱證患者的臨床癥候有好轉(zhuǎn)作用，并發(fā)現(xiàn)棒柄花可改善肝功能、表征等各項(xiàng)指標(biāo)[3-4]。本研究使用棒柄花葉水提物干預(yù)肝纖維化大鼠，旨在探究棒柄花葉水提物對肝纖維化的干預(yù)效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性SD 大鼠60 只，SPF 級(jí)，體重（180±20）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2020-0004；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2020-0003）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要藥品與試劑 棒柄花葉水提物，由廣西玉林市中醫(yī)醫(yī)院鑒定并提供，濃度：1.55 g（生藥量）/mL。秋水仙堿片，西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，0.5 mg×20 片，批號(hào)：20 190422；生理鹽水，貴州天地藥業(yè)有限公司，批號(hào)：D19 092901；四氯化碳（CCl4），成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20 190605；花生油，山東魯花集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20 190504；腫瘤壞死因子-α（TNF-α），江蘇晶美生物科技有限公司，批號(hào)：201912；三型膠原（COL-Ⅲ），武漢華美生物科技有限公司，批號(hào)：N20 019515；四型膠原（COL-Ⅳ），武漢華美生物科技有限公司，批號(hào)：N16 019516；分子生物級(jí)超純水，HyClone，批號(hào)：SH30538.02；反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒，Thermo，K1622。

1.3 模型建立與給藥[5]SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將其隨機(jī)分為6 組：正常對照組，模型對照組，秋水仙堿組和棒柄花葉水提物高、中、低劑量組。除正常對照組外，各組大鼠灌胃50%CCl4花生油溶液1 mL/kg，每周2次，連續(xù)6周。造模同時(shí)，秋水仙堿組灌胃0.2 mg/kg的秋水仙堿溶液，棒柄花葉水提物高、中、低劑量藥物組分別灌胃4.8 g/kg、2.4 g/kg、1.2 g/kg 的棒柄花葉水提物，模型對照組灌胃蒸餾水，1 次/d。為精確的給藥量，每次給藥前均進(jìn)行稱重。

1.4 給藥劑量 棒柄花人臨床擬用劑量12 g/d（生藥量），參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》的傳統(tǒng)經(jīng)典的等效劑量直接折算法。換算出大鼠給藥低劑量、中劑量、高劑量分別為1.2 g/kg、2.4 g/kg、4.8 g/kg（生藥量/體重）。

1.5 肝臟系數(shù)檢測及肝組織病理學(xué)檢查 處死大鼠后；取出胸腺、肝臟，精密電子天平稱取胸腺、肝臟重量，計(jì)算臟器系數(shù)；取每一只大鼠肝大葉的同一位置約1 cm×1 cm 大小，用10%福爾馬林溶液固定，用于蘇木精—伊紅（HE）染色和Masson 染色病理學(xué)檢查。

1.6 肝功能、膠原指標(biāo)檢測 6周給藥結(jié)束后，大鼠12 h 禁食不禁水。水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min 離心30 min 取血清。全自動(dòng)生化分析儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的含量，根據(jù)ELISA操作說明書，檢測血清中COL-Ⅲ、COL-Ⅳ的表達(dá)水平。

1.7 炎癥指標(biāo)檢測 取“1.6 項(xiàng)”下的血清，根據(jù)ELISA說明書操作，分別加入抗體和顯色劑，終止顯色反應(yīng)后15 min 內(nèi)檢測吸光度，計(jì)算TNF-α、白細(xì)胞介素（IL）-1的表達(dá)水平。

1.8 RT-PCR 測定大鼠肝組織PDGF、FAK、AktmRNA的表達(dá) 取各組大鼠肝臟組織100 mg，提取RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，分別檢測PDGF、FAK、AktmRNA 水平，程序設(shè)置：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，共40 次循環(huán)。相關(guān)引物序列如下：PDGF上游引物序列為5’-AGACCTCGTGGGCTTCAGTTAC-3’，下游引物序列為5’-AGGTGGTGTAGAGGCTGTTGAAG-3’；FAK上游引物序列為5’-AAAGCAGTAATGAGCCAACCAC-3’，下游引物序列為5’-TGAGGCGAAATCCATAGCAG-3’；Akt上游引物序列為5’-TCTCAGTGGCACAATGTCAGC-3’，下游引物序列為5’-TGGGTGAACCTGACCGGAAG-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5’-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3’，下游引物序列為5’-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3’。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。當(dāng)組間數(shù)據(jù)比較方差齊時(shí)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；組間數(shù)據(jù)比較方差不齊時(shí)，采用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對肝纖維化大鼠肝臟系數(shù)的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠體重減輕，胸腺指數(shù)降低，肝臟指數(shù)增加（P＜0.01）。與模型對照組比較，棒柄花葉水提物各劑量組和秋水仙堿組體重和胸腺指數(shù)具有上升趨勢（P＞0.05）；肝臟指數(shù)具有降低的趨勢（P＞0.05），見表1。

表1 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠臟器指數(shù)的影響，n=10

表1 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠臟器指數(shù)的影響，n=10

與正常對照組比較，##P＜0.01。

2.2 對肝纖維化大鼠血清生化指標(biāo)的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠的AST、ALT 的含量升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，秋水仙堿組和棒柄花葉水提物高、中劑量組能降低大鼠的AST、ALT的含量（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

表2 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠肝功能的影響，n=10

表2 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠肝功能的影響，n=10

與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 對肝纖維化大鼠血清膠原的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠的COL-Ⅲ、COL-Ⅳ含量升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型對照組比較，棒柄花葉水提物高、中劑量組與秋水仙堿組的肝纖維化指標(biāo)COL-Ⅲ、COL-Ⅳ的含量顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），見表3。

表3 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠纖維化指標(biāo)的影響，n=10

表3 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠纖維化指標(biāo)的影響，n=10

與正常對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 對肝纖維化大鼠炎癥反應(yīng)的影響 與正常對照組相比，模型對照組大鼠血清中TNF-α、IL-1含量明顯升高（P＜0.01）。與模型對照組相比，棒柄花葉水提物高、中劑量組和秋水仙堿組顯著降低血清中TNF-α、IL-1 的含量（P＜0.05 或P＜0.01），棒柄花水提物低劑量組能降低血清中IL-1的含量（P＜0.05），見表4。

表4 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠炎癥反應(yīng)的影響，n=10

表4 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠炎癥反應(yīng)的影響，n=10

與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.5 對肝纖維化大鼠肝組織病理的影響（1）HE染色結(jié)果：正常對照組，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈和肝索呈放射狀排列，肝組織未見病變；模型對照組肝小葉正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞嚴(yán)重腫脹，排列紊亂，肝組織內(nèi)有廣泛的脂肪變性，伴有纖維組織增生和部分組織壞死；秋水仙堿組和棒柄花葉水提物高、中、低劑量組可見減輕肝細(xì)胞組織損傷，見圖1；（2）Masson染色結(jié)果：正常對照組肝小葉內(nèi)、匯管區(qū)見少量纖維組織。模型對照組肝小葉和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)破壞，并且有大量的纖維組織增生，有較多的炎性細(xì)胞浸潤。秋水仙堿組及棒柄花葉水提物高、中、低劑量組可見肝組織中纖維增生有減少，棒柄花葉水提物對肝纖維組織增生的情況有改善作用，見圖2。

圖1 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠肝組織病理影響（HE染色，×200）

圖2 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠肝組織病理影響（Masson 染色，×100）

2.6 對肝纖維化大鼠PDGF-FAK/Akt信號(hào)通路的影響 與正常對照組相比，模型對照組顯著上調(diào)肝組織中PDGF、FAK、AktmRNA 表達(dá)水平（P＜0.01）；與模型對照組相比，秋水仙堿組及棒柄花葉水提物高、中劑量組的肝組織PDGF、FAK、AktmRNA表達(dá)水平降低（P＜0.01），見表5。

表5 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠PDGF-FAK/Akt信號(hào)通路的影響，n=10

表5 棒柄花葉水提物對肝纖維化大鼠PDGF-FAK/Akt信號(hào)通路的影響，n=10

與正常對照組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 討論

肝纖維化是肝臟對各種致病因素的損傷進(jìn)行修復(fù)時(shí)，引起以膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）合成與降解失衡，導(dǎo)致肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常堆積的病理過程。肝纖維化的發(fā)展過程是由多種細(xì)胞、細(xì)胞因子、信號(hào)通路等參與、相互作用、相互調(diào)控的結(jié)果。盡管肝纖維化的發(fā)生機(jī)制尚不明確，但目前認(rèn)為其發(fā)病可能與以下幾種因素有關(guān)：免疫炎癥反應(yīng)、肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell,HSC）的活化（中心環(huán)節(jié)）、細(xì)胞因子及其信號(hào)途徑和細(xì)胞外基質(zhì)的合成增多降解減少等。

ALT 存在于細(xì)胞胞質(zhì)，AST 存在于細(xì)胞器中，當(dāng)肝細(xì)胞損傷，肝細(xì)胞膜通透性改變，ALT、AST 會(huì)大量進(jìn)入到血液，血清中AST、ALT 被廣泛應(yīng)用于判斷肝損傷的敏感和重要的指標(biāo)[6-7]。Ⅲ、Ⅳ型膠原是構(gòu)成基底膜膠原的主要成分[8]，正常情況下Ⅲ、Ⅳ膠原的合成和降解是一個(gè)平衡的狀態(tài)，當(dāng)肝臟發(fā)生纖維化時(shí)，肝星狀細(xì)胞大量合成，降解下降，血清Ⅲ、Ⅳ膠原含量水平顯著上升。本研究結(jié)果顯示，相對于模型對照組的大鼠，灌胃給予棒柄花葉水提物，大鼠的肝損傷指標(biāo)AST、ALT 活性降低和肝纖維化指標(biāo)Ⅲ膠原、Ⅳ膠原含量降低。組織病理學(xué)結(jié)果表明，棒柄花葉水提物可以顯著改變肝細(xì)胞松弛及脂肪變性，減少肝細(xì)胞的炎癥、壞死以及假小葉形成，減輕肝纖維化增生程度。表明棒柄花葉水提物對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化損傷具有較好的改善作用。炎癥損傷是諸多病因引起肝損傷向肝纖維化發(fā)展的中間環(huán)節(jié)[9-13]。肝細(xì)胞損傷導(dǎo)致大量炎癥因子的釋放，炎癥加劇機(jī)體損傷，進(jìn)一步促進(jìn)肝臟膠原合成、積累。IL-1是機(jī)體內(nèi)一種促炎因子，TNF-α是機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)重要的介質(zhì)[13]。本研究結(jié)果顯示，給予不同劑量棒柄花水葉水提物處理后，肝纖維化大鼠血清中IL-1、TNF-α 的含量有不同程度降低，提示棒柄花葉水提物可能通過減輕炎癥損傷進(jìn)而影響肝纖維化的發(fā)生。

PDGF是重要的有絲分裂源[14-15]，是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的HSC 活化激活因子之一，大量研究證實(shí)它能通過多種信號(hào)途徑促進(jìn)HSC 的增殖、膠原纖維形成[16]。FAK-Akt就是其中一條信號(hào)通路。FAK是一種非受體酪氨酸激酶，具有酪氨酸蛋白激酶活性，作為整合素蛋白的下游信號(hào)分子，F(xiàn)AK蛋白的N端可以和整合素分子的胞質(zhì)端結(jié)合，將整合素信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、黏附等生物學(xué)作用。姜慧卿[17]研究發(fā)現(xiàn)FAK 可激活HSCs 的活化，致纖維化發(fā)生。白瑞丹等[18]、張坤[19]研究發(fā)現(xiàn)抑制FAK 的表達(dá)，可以抑制LX-2 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，進(jìn)而減輕肝纖維化程度。Akt 為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B，是FAK 信號(hào)通路中的下游細(xì)胞因子之一。其可通過磷酸化機(jī)體內(nèi)含有絲氨酸/蘇氨酸殘基的底物，激活mTOR 和p70S6K 等多種激酶而發(fā)揮它的促進(jìn)增殖、抑制凋亡等各種生物學(xué)效應(yīng)[20]。研究發(fā)現(xiàn)在慢性肝纖維化患者中Akt 表達(dá)水平升高，抑制Akt的活性可抑制HSCs的增殖，增加HSCs凋亡，對Akt 活化抑制可抑制肝纖維化信號(hào)路徑[21-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型對照組比較，棒柄花葉水提物高、中劑量組均能下調(diào)PDGF、FAK、AktmRNA的表達(dá)，表明棒柄花葉水提物抗肝纖維化的作用機(jī)制可能與調(diào)控PDGF-FAK/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)表明棒柄花葉水提物可能通過抑制肝臟膠原纖維生成、減輕肝臟炎癥刺激、抑制PDGFFAK/Akt信號(hào)通路來逆轉(zhuǎn)大鼠的肝功能和肝纖維化。本研究為進(jìn)一步探索棒柄花葉治療肝纖維化的潛在作用機(jī)制和對棒柄花葉的進(jìn)一步制劑開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。