菌落總數(shù)反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對被檢樣品進行適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評價，因而菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣[1]。然而在實際實驗過程中，被檢樣品如綠豆糕等在滅菌生理鹽水中并不能完全溶解，導(dǎo)致在培養(yǎng)基中出現(xiàn)與菌落形態(tài)相似的樣品顆粒，使菌落計數(shù)增加了難度。這對于實驗新人或者經(jīng)驗不夠的實驗人員來說，很容易錯把樣品顆粒當(dāng)作菌落進行計數(shù)，造成實驗結(jié)果的不準(zhǔn)確。但通過查閱資料發(fā)現(xiàn)，可以在培養(yǎng)基中添加2,3,5-三苯基氯化四氮唑（又稱TTC）溶液，以區(qū)分平板上生長的菌落與樣品顆粒[2]?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》中添加的TTC濃度為5.0 mg/100 mL，但有相關(guān)學(xué)者研究認(rèn)為TTC濃度在2.0 mg/100 mL時為最佳[3]?，F(xiàn)將該方法引用至食品檢測中，然后選取TTC濃度在0～5 mg/100 mL，探討TTC在菌落總數(shù)檢測中的適宜濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

綠豆糕：超市自購；大腸埃希氏菌：ATCC25922；鼠傷寒沙門氏菌：ATCC14028；金黃色葡萄球菌：ATCC6538；蠟樣芽孢桿菌：ATCC11778；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌：ATCC19115。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

氯化鈉（廣東光華）；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（上海麥克林）；PCA培養(yǎng)基（陸橋）。

1.3 儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋：YXQ-100A（上海博訊）；電子天平：BP-622B-X（上海奔普）；均質(zhì)器：LC-08（寧波立誠）；培養(yǎng)箱：GHP-9160N型（上海一恒）；生物安全柜：BSC-1100ⅡA2-X（濟南鑫貝西）；立式冷凍柜：BD-330WEPTU1（青島海爾）。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌液制備

從4 ℃冰箱中取出大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的工作菌株，先挑取斜面菌苔于生理鹽水管中做成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，然后按?0倍系列稀釋法，使菌懸液濃度在104～105CFU·mL-1。

1.4.2 TTC溶液制備

取1 g TTC粉末溶于100 mL蒸餾水中，配制成1%TTC溶液，于121 ℃高壓滅菌15 min后冷藏備用。

1.4.3 實驗步驟

選擇滅菌后的綠豆糕作為樣品基質(zhì)，取25 g樣品加入到225 mL滅菌生理鹽水中，共制備6份。取一份樣品不添加任何菌液，作為樣品空白對照，觀察有無菌落生長。剩余5份樣品分別加入大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的菌懸液各1 mL。按照10倍系列稀釋法，對以上5份添加了菌懸液的樣品進行稀釋。每個樣品各做10組，并編號X0為對照組，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8和 X9為實驗組。

分別將0 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL和0.50 mL配制好的1%TTC溶液加入到冷卻至46 ℃的100 mL PCA瓊脂培養(yǎng)基中，然后傾注到 X0、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9等樣品平皿中并混合均勻。待瓊脂凝固后，將平板倒置，36 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落結(jié)果并計數(shù)[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 TTC對大腸埃希氏菌計數(shù)的影響

由表1可知，與不添加TTC溶液的對照組相比，添加TTC溶液的實驗組隨著TTC濃度的增加，菌落顏色逐漸加深，菌落數(shù)無明顯差異（以lg差絕對值表示）[5-6]。

表1 TTC對大腸埃希氏菌計數(shù)的影響表

2.2 TTC對鼠傷寒沙門氏菌計數(shù)的影響

由表2可知，與不添加TTC溶液的對照組相比，添加TTC溶液的實驗組隨著TTC濃度的增加，菌落顏色逐漸加深，菌落數(shù)無明顯差異。

表2 TTC對鼠傷寒沙門氏菌計數(shù)的影響表

2.3 TTC對金黃色葡萄球菌計數(shù)的影響

由表3可知，與不添加TTC溶液的對照組相比，隨著TTC濃度的增加，菌落顏色逐漸加深，但是TTC濃度≥3.5 mg/100 mL時，菌落數(shù)較對照組有明顯差異，且TTC濃度為5.0 mg/100 mL時，菌落不生長。

表3 TTC對金黃色葡萄球菌計數(shù)的影響表

2.4 TTC對蠟樣芽孢桿菌計數(shù)的影響

由表4可知，與不添加TTC溶液的對照組相比，隨著TTC濃度的增加，菌落顏色逐漸加深，菌落數(shù)無明顯差異，但TTC濃度≥4.0 mg/100 mL時，菌落不生長。

表4 TTC對蠟樣芽孢桿菌計數(shù)的影響表

2.5 TTC對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌計數(shù)的影響

由表5可知，與不添加TTC溶液的對照組相比，隨著TTC濃度的增加，菌落顏色逐漸加深，菌落生長不受影響。

表5 TTC對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌計數(shù)的影響表

3 結(jié)論與討論

TTC是一種氧化還原指示劑，溶于水中形成無色溶液[7-8]。如果添加TTC的培養(yǎng)基中有細(xì)菌存在，細(xì)菌在代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶可將無色的TTC還原為紅色的三苯甲臢，使菌落變成紅色[3]。

①在大腸埃希實驗中，TTC濃度為0.5 mg/100 mL時，菌落數(shù)與對照組無明顯差異，顯淺粉色；TTC濃度在1.0～5.0 mg/100 mL時，菌落數(shù)與對照組無差異，菌落顏色由淺紫色到深紫色。②在鼠傷寒沙門氏菌實驗中，TTC濃度為0.5～1.0 mg/100 mL時，菌落數(shù)與對照組無明顯差異，菌落顏色顯淺粉色；TTC濃度為1.5～5.0 mg/100 mL時，菌落數(shù)與對照組無差異，菌落顏色由淺紫色到深紫色。③在金黃色葡萄球菌實驗中，TTC濃度為0.5～1.0 mg/100 mL時，菌落數(shù)與對照組無明顯差異，菌落顏色顯淺粉色；TTC濃度在1.5～3.0 mg/100 mL時，菌落數(shù)與對照組無差異，菌落顏色由淺紫色到深紫色；TTC濃度在3.5～4.0 mg/100 mL時，菌落顏色呈深紫色，但菌落數(shù)與對照組有明顯差異；TTC濃度為5.0 mg/100 mL時，菌落不生長。④在蠟樣芽孢桿菌實驗中，TTC濃度為0.5～3.5 mg/100 mL時，菌落數(shù)與對照組無差異，菌落顏色由淺粉色到紫色；TTC濃度為4.0～5.0 mg/100 mL時，菌落不生長。⑤在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌實驗中，TTC濃度為0.5～1.5 mg/100 mL時，菌落數(shù)與對照組無明顯差異，菌落顏色為淺粉色；在2.0～5.0 mg/100 mL時，菌落數(shù)與對照組無差異，菌落顏色由淺紫色到深紫色。

綜上所述，當(dāng)TTC濃度在2.0～3.5 mg/100 mL時，可以既不影響菌落生長，又能使菌落顯色。

實驗中所選取的大腸埃希氏菌和鼠傷寒沙門氏菌均為革蘭氏陰性菌株，實驗發(fā)現(xiàn)TTC的添加對它們的生長影響不大；金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌、蠟樣芽孢桿菌為革蘭氏陽性芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為革蘭氏陽性桿菌，實驗發(fā)現(xiàn)TTC的添加對單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的生長影響不大，但對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的生長影響很大。所以，TTC濃度對球菌和芽孢菌的生長影響關(guān)系還待進一步的實驗驗證。