付 勇，俸艷英

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院心肺功能中心，南寧 530021）

阿霉素（doxorubicin，DOX）是第二代蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，廣泛用于淋巴瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、軟組織肉瘤、肺癌等血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤的治療[1]。然而，DOX 可誘發(fā)心臟毒性導(dǎo)致心肌病和心力衰竭，并且心肌病和心力衰竭是限制DOX臨床應(yīng)用的最主要不良反應(yīng)之一[2]。雖然當(dāng)前許多學(xué)者仍致力于防治DOX 誘導(dǎo)心臟毒性的新藥研究[3-4]。但迄今為止，仍然缺乏預(yù)防和管理DOX誘發(fā)心臟毒性的最佳策略。因此，尋找有效防治DOX心臟毒性的藥物對(duì)改善腫瘤患者化療后生活質(zhì)量具有重要臨床意義。

達(dá)格列凈（dapagliflozin，Dapa）屬于鈉—葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（sodium-glucose transporter 2，SGLT2）抑制劑類非胰島素依賴性降糖藥物。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，SGLT2 抑制劑除降糖作用外，還可顯著降低糖尿病或非糖尿病患者的心力衰竭住院率及心血管疾病死亡風(fēng)險(xiǎn)[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，Dapa對(duì)接受DOX 治療的患者有保護(hù)心肌功能的作用[6]。然而，Dapa 心肌保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制尚需要進(jìn)一步探索。因此，本研究探討Dapa 對(duì)DOX 所致心肌損傷的保護(hù)作用及可能相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H9c2 大鼠心肌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counter kit-8，CCK-8）購(gòu)自日本Dojindo Lab 公司；DOX購(gòu)自深圳萬(wàn)樂藥業(yè)有限公司；Dapa 購(gòu)自美國(guó)MedChemexpress（MCE）公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Corning公司；特級(jí)胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、DAPI染色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；肌酸激酶（CK）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；Bax（貨號(hào)：2772）、白細(xì)胞介素（IL）-6（貨號(hào)：12153）、GAPDH（貨號(hào)：5174）、HRP 結(jié)合二抗（貨號(hào)：7074）購(gòu)自美國(guó)CST 公司；Bcl-2（貨號(hào)：ab196495）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（貨號(hào)：ab6671）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

H9c2 大鼠心肌細(xì)胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，置于含10%FBS 和1%青鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞胰酶消化、傳代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測(cè)H9c2細(xì)胞增殖率并確定藥物最佳作用條件

將H9c2 細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔3 000 個(gè)，設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，以不加藥處理的H9c2 細(xì)胞為NC 組，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行以下處理：（1）采用濃度為（0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L）DOX 處理H9c2細(xì)胞12 h、24 h，以確定DOX 最佳實(shí)驗(yàn)研究條件；（2）采用濃度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L Dapa 處理H9c2 細(xì)胞24 h、48 h，以觀察Dapa 對(duì)H9c2 細(xì)胞增殖率影響。（3）采用濃度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L Dapa 預(yù)處理細(xì)胞24 h，除NC 組外，其余各組加入1 μmol/L DOX 處理24 h，以確定Dapa 最佳預(yù)處理?xiàng)l件。終止培養(yǎng)后，每孔加入10 μL CCK-8，混勻后于培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀（λ=450）記錄各孔吸光度（OD 值）。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式：細(xì)胞增殖率（%）=（處理組OD 值-空白孔OD 值）/（NC 組OD 值-空白孔OD 值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

將H9c2 細(xì)胞分為4 組：NC 組（不加藥處理）、DOX 組（用1 μmol/L DOX 處理24 h）、Dapa 組（用1 μmol/L Dapa預(yù)處理細(xì)胞24 h）、Dapa+DOX組（用1 μmol/L Dapa 預(yù)處理細(xì)胞24 h，換液后再加用1 μmol/L DOX處理24 h）。

1.5 TUNEL試劑盒檢測(cè)H9c2細(xì)胞凋亡

H9c2細(xì)胞按1.9×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中的細(xì)胞爬片上，待細(xì)胞貼壁恢復(fù)正常形態(tài)后，按“1.4項(xiàng)”分組處理細(xì)胞。各組細(xì)胞處理后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，用0.3%Triton X-100 通透細(xì)胞，TUNEL檢測(cè)液于37 ℃避光孵育60 min，DAPI染色5 min，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照。每組隨機(jī)選取3 個(gè)視野并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡率（%）計(jì)算公式=每個(gè)視野下凋亡細(xì)胞數(shù)/該視野下細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 CK試劑盒檢測(cè)CK活性

H9c2 細(xì)胞按9×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于直徑為100 mm 培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)分組如“1.4 項(xiàng)”所示。處理完成后，取細(xì)胞培養(yǎng)液按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定CK 活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blotting檢測(cè)心肌促炎因子TNF-α、IL-6和凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)水平

取各組H9c2 細(xì)胞加入RIPA 裂解液于冰上裂解，離心后取上清液，用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。蛋白上樣量30 μg/20 μL，以10%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，電壓80～120 V，電泳1～1.5 h，轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉2 h，加入TNF-α（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000），GAPDH（1∶1 500），4 ℃搖床孵育過(guò)夜。TBST 沖洗3 次，每次15 min。加入二抗（HRP 接合IgG，1∶1 500），室溫孵育2 h，配制ECL發(fā)光顯影液，于化學(xué)發(fā)光成像儀上顯影，攝片。用Image J 計(jì)算每個(gè)蛋白條帶的灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dapa對(duì)DOX誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞增殖率的影響

如圖1A所示，不同濃度（0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L）DOX 作用H9c2 細(xì)胞12 h、24 h 后，細(xì)胞增殖率隨DOX 作用濃度和時(shí)間增加而降低；與對(duì)照組比較，其中1 μmol/L DOX 作用H9c2細(xì)胞24 h時(shí)，細(xì)胞增殖率為[（78.81±4.91）%，P＜0.05]，與本課題組前期實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵恢耓7]，以該處理濃度和時(shí)間作為DOX誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞模型的處理?xiàng)l件。

如圖1B所示，不同濃度（0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L）Dapa作用H9c2細(xì)胞24 h、48 h后，當(dāng)Dapa濃度為1 μmol/L作用24 h時(shí)，細(xì)胞增殖率明顯提高（P＜0.05）。如圖1C 所示，與DOX 組H9c2 細(xì)胞增殖率比較，Dapa濃度 為1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L時(shí)可提高H9c2細(xì)胞增殖率（P＜0.01），且Dapa濃度為1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，選擇1 μmol/L Dapa預(yù)處理H9c2細(xì)胞24 h進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 Dapa對(duì)DOX誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞增殖率的影響

2.2 Dapa對(duì)DOX誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，與NC組比較，DOX組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.001），Dapa 組細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與DOX 組比較，Dapa+DOX 組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.01）。

圖2 Dapa對(duì)DOX誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞凋亡的影響

2.3 Dapa對(duì)DOX誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷的影響

如圖3 所示，與NC 組比較，DOX 組CK 活性升高（P＜0.001）；Dapa 組CK 活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與DOX組相比，Dapa+DOX組CK活性下降（P＜0.01）。

圖3 Dapa對(duì)DOX誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷的影響

2.4 Dapa 對(duì)DOX 誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的影響

如圖4 所示，與NC 組比較，DOX 組H9c2 細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.001），TNF-α、IL-6、Bax蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.001）；Dapa組TNF-α、IL-6、Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與DOX 組比較，Dapa+DOX 組H9c2 細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），TNF-α、IL-6、Bax蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.001）。

圖4 Dapa對(duì)DOX誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞炎癥反應(yīng)和凋亡的影響

3 討論

DOX作為實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤化療的基石，部分患者接受DOX治療后會(huì)出現(xiàn)心臟功能受損，且其心臟毒性呈現(xiàn)時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾囆訹1]，嚴(yán)重影響其腫瘤治療中的使用劑量及療效。由于過(guò)度氧化應(yīng)激導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，是DOX誘導(dǎo)心臟毒性的主要病理機(jī)制之一[8]。DOX可直接增加心臟組織中的活性氧生成而激活凋亡調(diào)節(jié)因子，通過(guò)激活內(nèi)源性凋亡通路誘導(dǎo)BCL-2 凋亡蛋白家族中，促凋亡蛋白Bax的上調(diào)[9]和抗凋亡蛋白Bcl-XL下調(diào)[10]。Wang等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，DOX 可引起患者全身性炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)促炎因子TLR4（Toll-like receptor 4）的表達(dá)，導(dǎo)致嚴(yán)重的心臟毒副作用，同時(shí)研究通過(guò)阻斷炎癥因子的表達(dá)可有效降低DOX 誘導(dǎo)的毒副作用。本研究亦顯示，DOX對(duì)心肌細(xì)胞的損傷中表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡率、促炎因子TNF-α、IL-6 和凋亡蛋白Bax 表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)降低。此外，DOX還可增加炎癥因子IL-6、TNF-α和NF-κB的表達(dá)[12]，亦可激活NF-κB 信號(hào)通路[13]，誘導(dǎo)心肌凋亡。因此，減輕心肌炎癥反應(yīng)抑制細(xì)胞凋亡亦可能是防治DOX所致心臟毒性的作用機(jī)制。

Dapa屬于SGLT2抑制劑，作為一種新型非胰島素依賴性降糖藥，在減少心血管不良事件方面的積極作用已經(jīng)得到證實(shí)[14-15]，歐洲心臟病學(xué)會(huì)最新指南中建議，該藥為心力衰竭或多心血管風(fēng)險(xiǎn)患者優(yōu)先選用藥物[5]。據(jù)報(bào)道，SGLT2 抑制劑對(duì)接受DOX治療的患者有保留心肌功能作用，推測(cè)其可能機(jī)制是通過(guò)改善心臟能量代謝、預(yù)防炎癥、抑制心臟Na+/H+交換器和降低氧化應(yīng)激[16]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Dapa通過(guò)RONS/STAT3 通路調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1 型向M2 型轉(zhuǎn)化，可顯著減輕野生型大鼠心肌梗死后心肌的炎癥反應(yīng)，減少心肌梗死面積，改善心肌重塑[17]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Dapa預(yù)處理后，DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡率降低，促炎因子TNF-α、IL-6和凋亡蛋白Bax表達(dá)降低，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)升高。表明Dapa 可能通過(guò)減輕H9c2 細(xì)胞中促炎因子和凋亡蛋白的表達(dá)，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞免受DOX毒性損傷作用。

綜上所述，Dapa可能通過(guò)降低心肌的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，對(duì)防治DOX誘導(dǎo)心肌細(xì)胞毒性起到保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)僅從細(xì)胞水平對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步研究，其涉及的信號(hào)通路仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。