韋麗玲，羅云鵬，賴 堅，趙 漾，周 剛，陳美云紫，余 悅，劉敬臣

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科，南寧 530021）

椎管內麻醉廣泛應用于臨床，尤其在基層醫(yī)院仍然是最主要的麻醉方式之一。但椎管內麻醉已經被證實具有潛在的神經毒性[1]，比如短暫性神經綜合征、馬尾神經綜合征等[2-4]，雖然椎管內麻醉并發(fā)癥發(fā)生率不高，然而一旦發(fā)生將救治困難。因此，探索椎管內麻醉發(fā)生神經毒性的機制具有重要意義。本課題組前期探索發(fā)現(xiàn)，局麻藥神經毒性發(fā)生的機制可能與局麻藥誘導細胞凋亡有關[5-6]。右美托咪定是臨床麻醉中最見的麻醉藥物之一，近年來其器官保護作用是一個很重要的研究方向。相關文獻報道右美托咪定具有抑制大鼠海馬神經細胞凋亡而起到腦保護作用[7-8]，而右美托咪定是否能通過抑制椎管內神經元的凋亡而起到神經保護作用，目前尚缺乏相關報道。Pi3k/Akt 是細胞中一個經典的信號通路，參與體內細胞的生長、增殖、分化、凋亡等，維持機體正常的免疫、代謝，是生命體不可缺少的重要通路之一[9]。以往研究表明右美托咪定可以通過激活Pi3k/Akt通路而起到抗凋亡的作用。因此本研究擬探索右美托咪定是否可以通過激活Pi3k/Akt 信號通路減少脊髓神經細胞凋亡，從而減少布比卡因脊髓神經毒性。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和實驗器材

PE-10 導管購自Smith Medical 公司（英國）；布比卡因（貨號：B5274）和右美托咪定鹽酸鹽（貨號SML0956）；YLS.A12A鼠尾光照測痛儀購自淮北正華生物儀器設備有限公司；GAPDH、Bax和Cleavedcaspase3抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；Bcl-2 購自沈陽萬類科技有限公司；Akt、p-Akt、Pi3k、p-Pi3k 抗體均購自艾比馬特生物醫(yī)藥上海有限公司；488 熒光二抗購自Abcam 公司；RIPA 蛋白酶裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF、5×蛋白上樣緩沖液、BCA檢測試劑盒均購自碧云天生物科技有限公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自沈陽萬類科技有限公司；Odessey 紅外熒光掃膜儀器購自Licor公司。

1.2 實驗動物

SPF級成年雄性SD大鼠260～280 g購于廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，動物生產許可證號SCXK 桂2020-0004，實驗動物使用許可證號SYXK-桂2020-0004，對大鼠進行分籠進行飼養(yǎng)，水和食物充足，20～25℃恒溫環(huán)境，固定晝夜各12 h 交替循環(huán)周期。本動物實驗已經獲得廣西醫(yī)科大學動物實驗中心倫理委員會批準。

1.3 動物分組以及干預方法

按隨機數字表法將24 只SPF 級SD 大鼠分為3組：生理鹽水組（S組）、布比卡因組（B組）、右美托咪定預處理組（D 組）。3 組SD 大鼠進行鞘內置管后分別進行以下處理：S 組鞘內注射0.12 μL/g 的生理鹽水，連續(xù)3 次每次間隔90 min，B 組鞘內注射0.12 μL/g的5%的布比卡因，連續(xù)3次每次間隔90 min，D組腹腔注射50 μg/kg的右美托咪定[1]，30 min后連續(xù)3 次鞘內注射5%布比卡因每次間隔90 min。置管前，給藥后0 d、1 d、2 d、3 d 取材前分別測大鼠甩尾反應潛伏期（TFL）和進行運動功能評分（BBB）評分。給藥后3 d取大鼠脊髓腰膨大處組織。

1.4 蛛網膜下腔置管

采用改良Yasksh 法[10]給SD 大鼠進行鞘內置管，預先用生理鹽水充滿PE-10導管，選取L5～L6腰椎間隙向頭部置管，置管長度為1.5～2.0 cm。置管時大鼠出現(xiàn)甩尾反應和導管有生理鹽水溢出，表示置管成功。將PE-10 導管固定于背部肌肉，皮下埋管導管遠端從頸部穿出，并固定于頸部皮膚，火燒封管。置管后單籠飼養(yǎng)3 d，鞘內給10 μL 利多卡因，30 s內出現(xiàn)雙下肢麻痹，且30 min內恢復表明蛛網膜下腔置管成功。雙下肢出現(xiàn)運動功能受損者剔除出實驗。

1.5 檢測指標

1.5.1 感覺功能和運動功能評價 大鼠TFL 評價大鼠感覺功能，分別在置管前測基礎值，給藥后0 d、1 d、2 d、3 d用鼠尾光照測痛儀測定并記錄大鼠甩尾反應時間，測量3次，每次間隔5 min，取平均值。換算成最大抗輻射熱效應百分比（%MPE），轉換公式=（實測值-基礎值）/（最大值-基礎值）×100%，防止鼠尾出現(xiàn)損傷，最大值為16.01 s。大鼠后肢BBB評分：0分是后肢運動功能消失，21分是后肢運動功能完全正常。為避免大鼠晝夜差異，測定時間固定于同一時間點進行。

1.5.2 光鏡觀察脊髓蘇木精—伊紅（HE）病理改變 各組大鼠于給藥后3 d，采用10%水合氯醛進行麻醉，后用4 ℃生理鹽水進行心臟灌注，取脊髓腰膨大處，迅速固定于4%多聚甲醛。腰膨大固定24 h后，石蠟包埋，切成4 μm 大小的連續(xù)厚片，進行HE染色。

1.5.3 Western blotting檢測相關蛋白指標 每組脊髓腰膨大凍存標本加入RAPA、蛋白酶抑制劑、磷酸酶進行勻漿，后置于冰上裂解30 min，13 000 r/min，15 min，吸取上清。用BCA 法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃水煮5 min。使用8%和12%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，使蛋白質進行分離，使用濕法將蛋白轉移至PVDF 膜上，BSA 封閉1 h，按一抗說明書指示進行抗體稀釋，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，小鼠來源的一抗用二抗HRP標記的山羊抗體室溫孵育1 h，TBST 洗膜，ECL 化學發(fā)光發(fā)暗室曝光顯影。兔來源的一抗采用熒光標記的山羊抗體室溫孵育1 h，TBST洗膜，Odessey 紅外熒光掃膜儀器掃描所得PVDF 膜。掃描結果采用Image J 軟件分析條帶灰度值，以條帶灰度值來反應蛋白質表達量的水平。

1.5.4 免疫熒光法 檢測Bax 和Bcl-2 在細胞中表達量，取各組預先制好的石蠟切片至于60 ℃烤箱烤片1～2 h，脫蠟后用檸檬酸鈉高壓抗原修復，PBS 洗片，3%的過氧化氫室溫孵育10 min，0.3%Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗片，5%驢血清室溫封閉30 min，Bax和Bcl-2一抗（1∶50）4 ℃孵育過夜，PBS洗片，羊抗兔488 熒光二抗（1∶800）室溫避光孵育1 h，PBS漂洗后DAPI染核室溫5 min，PBS洗片，滴加抗熒光淬滅劑蓋蓋玻片封片；于熒光顯微鏡下觀察拍照，藍色熒光為細胞核染色，代表整片所有細胞數，綠色熒光為Bax和Bcl-2陽性表達。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，非正態(tài)分布的計量資料以中位數（四分位數）[M（P25～P75）]表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組感覺功能比較

S 組，B 組，D 組在置管前%MEP 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。B組和D 組在給藥后0 d、1 d、2 d、3 d%MEP均大于S組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。與B 組比較，D 組在給藥后的3 d%MEP 較小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組感覺功能比較

表1 各組感覺功能比較

與S組比較，*P＜0.05；與B組相較，#P＜0.05。

2.2 各組大鼠不同時間點后肢BBB評分比較

S組、B組、D組給藥前BBB評分均為21分。與S 組比較，B 組、D 組在給藥后的0 d、1 d、2 d、3 d BBB評分較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組不同時間點大鼠BBB評分比較分,M（P25～P75）

2.3 各組脊髓病理組織HE染色的改變

光鏡下S組神經元結構完整，輪廓規(guī)則清晰，尼氏體豐富，核仁清晰，核膜完整。B組和D組神經元出現(xiàn)不同程度水腫、萎縮、數目減少，細胞核出現(xiàn)固縮、深染，溶解，核膜不完整。與B 組相較D 組損傷輕，神經元的水腫、萎縮較輕，核仁相對清晰，核膜相對完整，損傷的神經元個數較少，見圖1。

圖1 各組HE染色光鏡下脊髓組織損傷情況

2.4 各組脊髓組織蛋白的表達情況

與S組比較，B組和D組凋亡相關蛋白Cleavedcaspase3、Bax表達量增多，Bcl-2、p-Akt、p-Pi3k表達量下降（均P＜0.05）。與B 組比較，D 組Bcl-2、p-Pi3k、p-Akt表達量上升，凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3 和Bax 表達量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組脊髓組織Cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、Pi3k、p-Pi3k蛋白的表達情況

2.5 各組脊髓組織凋亡相關蛋白在神經元中的表達情況

各組脊髓組織凋亡相關蛋白Bax 和Bcl-2 均在細胞質中表達，B組和D組陽性表達量較多，S組較少；見圖3、圖4。

圖3 各組脊髓組織Bax蛋白在神經元中的表達情況

圖4 各組脊髓組織Bcl-2蛋白在神經元中的表達情況

3 討論

腰麻是將局麻藥注入蛛網膜下腔，阻滯神經根使其相應支配區(qū)域產生麻醉效果，局麻藥已經被證實存在神經毒性，臨床上出現(xiàn)局麻藥神經毒性主要包括馬尾綜合征、短暫神經綜合征等。在本研究中布比卡因處理的大鼠其感覺功能和運動功能受損，不能對熱刺激及時做出甩尾反應，表現(xiàn)為BBB評分下降和TFL評分上升；HE染色神經元數量減少，神經元水腫明顯，神經元周圍空泡增多。應用右美托咪定預處理后的大鼠TFL 評分在第3 天后明顯下降，HE染色神經元的水腫得到一定改善，神經元周圍空泡減少。本實驗可以證實布比卡因存在脊髓神經毒性，與本課題組前期研究結果一致，右美托咪定預處理后可以減輕布比卡因導致的脊髓神經毒性。布比卡因是臨床最常使用的局麻藥之一，有實驗證實布比卡因可以誘導各種類型的神經細胞損傷，從而導致神經毒性。其中包括誘導小鼠背根神經節(jié)的神經元出現(xiàn)退變和神經元凋亡[11]；通過t型鈣通道誘導SHSY5Y 細胞凋亡[12]，通過損害線粒體功能，從而增強谷氨酸誘導的大鼠海馬興奮性毒性[13]，通過增強內質網應激促進細胞凋亡[14]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)布比卡因處理的大鼠凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3和Bax表達量增多，抑制凋亡相關蛋白Bcl-2表達量下降?？梢宰C實布比卡因誘導神經元凋亡從而產生了神經毒性。

凋亡作為脊髓神經毒性的重要機制之一已經得到證實，抑制凋亡具有神經保護效應。右美托咪定是高度選擇性α2受體激動劑，可以結合突觸前α2腎上腺素受體，激活交感反應的負反饋回路，減少去甲腎上腺素的釋放，從而抑制交感反射和應激反應，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抗交感的作用[15]。有實驗表明右美托咪定可通過抑制內質網應激，氧化應激，炎癥反應，細胞凋亡、焦亡等機制減輕創(chuàng)傷性腦損傷[16]、腦缺血再灌注損傷[17]、創(chuàng)傷性脊髓損傷[18]、脊髓缺血再灌注損傷[19]。在本實驗布比卡因脊髓神經毒性模型中，應用右美托咪定預處理后凋亡相關蛋白Cleaved-caspase3和Bax表達量下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達量上升。本實驗研究結果證實右美托咪定抑制脊髓神經元凋亡減輕了布比卡因的神經毒性從而產生神經保護作用，其神經保護作用和上述研究結果一致。

Pi3k/Akt 信號通路已經被證實和細胞生長、增殖、分化、生存、死亡密切相關。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，Pi3k）是一種異二聚體酶，是體內重要的信號傳導分子，在接受外來信號刺激后活化，活化的Pi3k可以產生生磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），PIP3 是活下游蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）的第二S 信使，蛋白激酶B 是一種進化上保守的特異性蛋白激酶，被激活后蛋白激酶B可以下調Bad、Bax、caspase等促凋亡蛋白，在細胞存活和凋亡中發(fā)揮重要作用，是PI3K的重要靶點[20]。有實驗證實右美托咪定可以調控Pi3k/Akt信號通路抑制細胞凋亡[21]，本實驗也發(fā)現(xiàn)類似結果，B組的p-Pi3k、p-Akt 水平下降，而D 組p-Pi3k、p-Akt水平上升，表明布比卡因促進神經元凋亡可能與抑制Pi3k/Akt 通路有關，而右美托咪定減少神經元凋亡可能與激活Pi3k/Akt通路有關。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)布比卡因具有脊髓神經毒性，其機制可能是布比卡因抑制Pi3k/Akt 信號通路誘導脊髓神經元的凋亡。右美托咪定可以減輕布比卡因導致的脊髓神經毒性，其機制是激活的Pi3k/Akt信號通路抑制了脊髓神經元的凋亡。本實驗通過建立布比卡因大鼠脊髓神經毒性模型，為局麻藥布比卡因脊神經毒性提供的新的治療思路。本實驗存在一定的局限性，布比卡因是如何抑制Pi3k/Akt信號誘導脊髓神經元凋亡以及右美托咪定如何激活Pi3k/Akt信號抑制脊髓神經元凋亡的仍需進一步的探究。