李秀婷， 朱唯嘉， 吳秋華， 盧宏運， 丁 澤， 楊卯宸

(1.北京工商大學(xué) 食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100048；2.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院， 北京 100048；3.北京工商大學(xué) 北京市科協(xié)食品營養(yǎng)與安全專業(yè)智庫基地， 北京 100048)

近年來，低聚木糖作為一種調(diào)節(jié)腸道微生物組成、降低血漿膽固醇水平的高效益生元，深受人們青睞[1]。低聚木糖(xylooligosaccharides，XOS)是由2～7個木糖分子通過糖苷鍵連接形成的功能性低聚糖[2]。與其他低聚糖相比，XOS具有更高的效價比、更好的酸、熱穩(wěn)定性以及更高的選擇性增殖腸道雙歧桿菌等特點[3]，在健康食品領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。許多研究者高度關(guān)注XOS的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用，尤其是利用生物酶技術(shù)制備XOS已成為研究熱點。糖苷水解酶(glycoside hydrolase, GH)11家族木聚糖酶具有底物特異性強、催化效率高、分子質(zhì)量小(約20 kDa)等特點，在低聚木糖的生產(chǎn)中具有明顯優(yōu)勢[4-6]。Zhuo等[4]發(fā)現(xiàn)了高度催化堿處理玉米芯，反應(yīng)生成特異性產(chǎn)物XOS，產(chǎn)量高達440.7 mg/L的木聚糖酶rXyn162；但該酶存在熱穩(wěn)定性差的缺點，隨著溫度升高，rXyn162殘余酶活急劇下降，80 ℃下殘余酶活僅23%，限制了其在工業(yè)應(yīng)用中的推廣。Ayadi等[5]發(fā)現(xiàn)一株具有較高酶活性(630 U/mg)的天然木聚糖酶XYNII，但其在60 ℃下迅速失活，半衰期僅為2 min。為了滿足工業(yè)高溫、極端pH值和高有機溶劑等極端條件對具有優(yōu)越性質(zhì)木聚糖酶的需要，采用定點突變或定向進化對木聚糖酶進行分子改造已成為XOS工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱點[6-10]。

許多研究證實，二硫鍵作為一種共價相互作用力，可通過降低酶結(jié)構(gòu)的構(gòu)象熵來減少酶結(jié)構(gòu)變化，以提高酶的穩(wěn)定性[11-13]，表現(xiàn)為酶最適溫度提高、半衰期延長、pH值穩(wěn)定范圍變寬等。Cai等[12]在木聚糖酶XynZF-2的C端引入一個二硫鍵(A52C-T205C)，突變體pH值穩(wěn)定范圍變寬，由原來的5.0～7.0變?yōu)?3.0～9.0。Teng等[14]在酸性木聚糖酶PjxA的N端構(gòu)建兩個二硫鍵(T2C-T29C、S27C-S39C)獲得突變體DB-s1s4，其最適溫度較PjxA提高20 ℃，較引入單二硫鍵的突變體PjxA-DB高5 ℃，達70 ℃。結(jié)合木聚糖酶的結(jié)構(gòu)特點，在恰當(dāng)?shù)奈恢貌捎枚c突變等技術(shù)引入不同數(shù)目的二硫鍵，可顯著改善木聚糖酶的穩(wěn)定性[15]。本文擬從GH11木聚糖酶分子的結(jié)構(gòu)及其對酶熱穩(wěn)定性的影響，二硫鍵引入的常用策略，酶不同區(qū)域構(gòu)建不同數(shù)量二硫鍵對GH11木聚糖酶穩(wěn)定性影響進行分析，希望為GH11木聚糖酶的穩(wěn)定性研究提供參考。

1 GH11木聚糖酶的結(jié)構(gòu)及其對酶熱穩(wěn)定性的影響

1.1 GH11木聚糖酶的結(jié)構(gòu)特點

酶結(jié)構(gòu)是探索酶穩(wěn)定機理、挖掘酶功能特性以及酶理性設(shè)計的基礎(chǔ)。圖1展示了GH11木聚糖酶的結(jié)構(gòu)，由圖1可知，GH11木聚糖酶結(jié)構(gòu)呈右手半握狀，由一個α-螺旋和兩個相互平行的β-折疊組成，β-折疊A和B構(gòu)成了木聚糖酶三維結(jié)構(gòu)的Fingers和Palm，Cord區(qū)連接β-折疊B6和B9，Thumb區(qū)連接β-折疊B7和B8。與GH10木聚糖酶相比，GH11木聚糖酶的底物結(jié)合域較寬、結(jié)合能力較強、底物選擇較專一，具有廣泛的酸堿適應(yīng)性及較高的酶活性[16-18]。然而，由于大多數(shù)GH11木聚糖酶屬于中溫木聚糖酶，均存在穩(wěn)定性差的問題，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)實際中的應(yīng)用。目前的研究已經(jīng)證實，GH11木聚糖酶是一類高度同源的水解酶。盡管位于催化裂隙的氨基酸殘基在一級序列和三級結(jié)構(gòu)上均具有高度保守性，但微小的序列和空間結(jié)構(gòu)差異也會導(dǎo)致酶學(xué)性質(zhì)顯著改變，其中，大多性質(zhì)的變化集中體現(xiàn)在催化速率、最適pH值、最適溫度及穩(wěn)定性等方面。Ayadi等[5]在GH11木聚糖酶XYNII中將兩個絲氨酸變?yōu)樘K氨酸，構(gòu)建兩個突變酶S80T和S149T，突變酶在60 ℃下保溫5 min，其殘余酶活為60%，是野生型(32%)的兩倍；Zhang等[10]將GH11木聚糖酶SoxB的N端兩個氨基酸Asn、Ser分別變?yōu)镚ly、Pro，70 ℃下，突變體半衰期(87 min)是野生型(3.6 min)的24倍。由此可知，在酶分子結(jié)構(gòu)分析基礎(chǔ)上，利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，選擇合適的突變策略改變酶分子的一級序列和三維結(jié)構(gòu)，可達到改善GH11木聚糖酶穩(wěn)定性的目的。

圖1 GH11木聚糖酶結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Structure of GH11 xylanase

1.2 氫鍵作用、疏水作用及二硫鍵三種作用力對酶熱穩(wěn)定性的影響

目前，許多研究者對GH11木聚糖酶的分子改造進行了大量的探索，成功改善了酶的熱穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，分子內(nèi)部相互作用力如氫鍵相互作用力、疏水相互作用力、二硫鍵等在提高酶熱穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。Ayadi等[5]將木聚糖酶TRX II中第80位氨基酸Ser替換為Thr，構(gòu)建突變酶S80T，60 ℃下保溫5 min，突變酶S80T可保持45%的酶活力，而TRX II僅保留32%的酶活力；通過對木聚糖酶TRX II和S80T進行結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，Thr80和Ile84之間形成了氫鍵，Ile84靠近活性中心E85，氫鍵作用使得位于活性中心的β-折疊更加穩(wěn)定，突變酶S80T在較高溫度下保持酶活性，熱穩(wěn)定性得到改善。為提高木聚糖酶XynCDBFV的熱穩(wěn)定性，Han等[8]運用定點突變的方法，構(gòu)建4個突變體N88G、S90T、S89H、Q87R，突變體的耐熱性均有較大提高，在最適溫度60 ℃下孵育1 h，4個突變體的活力均保持在50%以上，而相同條件下，XynCDBFV的活力保留率僅為20.94%；研究運用分子動力學(xué)模擬和結(jié)構(gòu)分析探討了突變體的耐熱機制，發(fā)現(xiàn)突變位點與周圍氨基酸形成了氫鍵相互作用，4個單一突變體中與Q/R87、D215的氫鍵作用力比XynCDBFV中的氫鍵相互作用力強，增強了酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。Vogt等[19]通過比較16個具有不同熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)家族含有的氫鍵數(shù)量發(fā)現(xiàn)，超過80%的家族熱穩(wěn)定性與氫鍵數(shù)量、分子極性表面存在的氫鍵密度相關(guān)。由此可知，酶熱穩(wěn)定性與分子內(nèi)氫鍵相互作用密切相關(guān)。表1總結(jié)了3種作用力對酶熱穩(wěn)定性的改善效果[5,8,11,14,20-23]。

表1 氫鍵作用、疏水作用及二硫鍵作用對酶熱穩(wěn)定性的影響

Miyazaki等[20]運用隨機點突變、飽和突變和DNA改組相結(jié)合的方法，篩選出一個含有Q7H、N8F和S179C這3個氨基酸突變的耐熱突變體Xylst，與野生酶相比，60 ℃下Xylst可在2 h內(nèi)保持完整活性而野生酶在5 min內(nèi)失活，同時Xylst的最適溫度較野生酶提高了10 ℃，為65 ℃。比較野生型與突變木聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，突變位點氨基酸與鄰近氨基酸殘基形成疏水簇，增強了酶內(nèi)部及酶分子間的聯(lián)系，使得酶結(jié)構(gòu)更加緊湊，有利于酶在高溫下保持自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從而提高酶的熱穩(wěn)定性。Kim等[21]運用定點突變的方法，將木聚糖酶BCX中氨基酸Val168突變?yōu)槭杷被酙le，突變酶V168I與BCX相比，其熱穩(wěn)定性顯著提高，50 ℃下保溫30 min，V168I酶活力可保持在90%以上，而BCX酶活性則降低到70%以下。突變酶V168I氨基酸Ile側(cè)鏈甲基的增加，增強了BCX分子內(nèi)部的疏水相互作用力，從而增強了BCX的局部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，提高了BCX的熱穩(wěn)定性。Bhat等[24]通過將天然GH11木聚糖酶N-末端的前6個殘基RTITNN進行突變，引入芳香族氨基酸、半胱氨酸、脯氨酸等疏水氨基酸，通過均方根偏差、旋轉(zhuǎn)半徑和溶劑可及表面積等參數(shù)對GH11木聚糖酶及其突變株的結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性進行了分析，發(fā)現(xiàn)突變酶與野生酶相比，均方根偏差降低，旋轉(zhuǎn)半徑減小，溶劑可及表面積減小，說明突變酶結(jié)構(gòu)剛性增加。Ruller等[25]研究發(fā)現(xiàn)，保持蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定可在一定程度上提高酶的熱穩(wěn)定性。由此可知，疏水相互作用力在增強酶的結(jié)構(gòu)剛性、提高酶的熱穩(wěn)定性方面具有一定作用。

Xiong等[11]運用定點突變的方法在木聚糖酶PTxA的N端構(gòu)建二硫鍵(T2C-T29C)，PTxA的N端剛性增強，其在60 ℃下的半衰期為53.6 min，提高為野生型酶(30 s)的107倍。Turunen等[13]在木聚糖酶XYNII中引入二硫鍵S110C-N154C，突變酶在65 ℃下的半衰期由不足1 min增加到14 min。Teng等[14]在酸性木聚糖酶PjxA的N端構(gòu)建二硫鍵T2C-T29C，獲得突變體PjxA-DB，60 ℃下孵育30 min，殘余酶活由突變前的20%提高到80%以上。二硫鍵的引入對木聚糖酶的穩(wěn)定性具有一定的改善作用。

1.3 二硫鍵可顯著提高GH11木聚糖酶的穩(wěn)定性

較多研究證實，3種作用力均對木聚糖酶熱穩(wěn)定性具有改善作用，但其改善效果不同(表1)。Sutthibutpong等[22]研究了疏水相互作用、氫鍵相互作用、二硫鍵對木聚糖酶xyn11A熱穩(wěn)定性的影響：80 ℃下孵育10 min，含二硫鍵S100C-N147C的突變體酶活力可保持在40%以上；而增加疏水相互作用的突變D32G和增加氫鍵相互作用力的突變A155S，酶活力降至20%，野生型木聚糖酶酶活力降至10%以下。由此可知，構(gòu)建二硫鍵S100C-N147C得到的突變體具有最高的熱穩(wěn)定性。Watanabe等[23]通過在木聚糖酶XylC的N端進行定點突變以改善其熱穩(wěn)定性，設(shè)計了9個突變位點(S35C、N44H、Y61M、T62C、N63L、D65P、N66G、T101P、S102N)，并考察了單一突變與組合突變對XylC的熱穩(wěn)定性的影響。研究發(fā)現(xiàn)，同時含有上述9個突變位點的突變酶XylCmt9具有最高的熱穩(wěn)定性。通過解析XylCmt9的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)合所有突變酶的酶學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，除XylCmt9外，在XylC的N末端引入二硫鍵的組合突變酶S35C-T62C，相比于其他增加氫鍵相互作用的突變酶(T101P、S102N)和增加疏水相互作用的突變酶(Y61M/N63L、D65P/N66G)，其熱穩(wěn)定性顯著提高，75 ℃下孵育10 min，S35C-T62C能夠保持60%的酶活力，而其余單一或組合突變均低于20%。晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，二硫鍵使得XylCmt9的N端Cα-Cα、Cβ-Cβ距離較XylC縮短，N端結(jié)構(gòu)變得緊密，結(jié)構(gòu)熵值降低，酶結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。同時研究還發(fā)現(xiàn)，由于引入的二硫鍵使得酶結(jié)構(gòu)變得緊密，促進了其他氨基酸間氫鍵和疏水相互作用力增加[26]，如在XylCmt9中，觀察到N44H突變的His44的側(cè)鏈與Gly64主鏈的Nδ1和O原子形成了新的氫鍵，使得同時含有9個突變的突變酶XylCmt9具有最高的熱穩(wěn)定性。Kazlauskas等[27]研究發(fā)現(xiàn)，二硫鍵與蛋白質(zhì)的折疊過程密切相關(guān)，其鍵能遠(yuǎn)大于其他次級鍵，為12 552 J/mol，在維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面具有優(yōu)勢；因此，引入二硫鍵對改善酶穩(wěn)定性具有十分顯著的作用?；贕H11木聚糖酶的結(jié)構(gòu)特點，采用合適的策略在GH11木聚糖酶中構(gòu)建二硫鍵，對提高GH11木聚糖酶的穩(wěn)定性具有十分重要的意義。

2 GH11木聚糖酶中引入二硫鍵的常規(guī)策略

二硫鍵是蛋白質(zhì)分子兩個半胱氨酸間-SH被氧化而形成在硫原子間的共價鍵，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定有著非常重要的作用[28]。通常可基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，識別可能形成二硫鍵的兩個位點，并將該位點氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?，即可成功引入二硫鍵[29]。研究表明：通過對特定GH11木聚糖酶的結(jié)構(gòu)進行分析，選擇合適的引入二硫鍵策略，成功構(gòu)建二硫鍵是提高木聚糖酶熱穩(wěn)定性的重要途徑之一[4,30]；不恰當(dāng)?shù)亩蜴I引入方式或在不合適的結(jié)構(gòu)區(qū)域構(gòu)建二硫鍵，不僅難以達到改善酶的熱穩(wěn)定性的效果，甚至?xí)γ阜肿咏Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定產(chǎn)生負(fù)面影響[27]。因此，選擇適當(dāng)?shù)亩蜴I構(gòu)建策略十分重要。目前引入二硫鍵的常規(guī)策略有：氨基酸替換、定點突變和基于程序計算設(shè)計二硫鍵等。

2.1 氨基酸替換

一般來說，不同來源的GH11木聚糖酶基因在編碼其蛋白質(zhì)的一級序列上具有一定差異性。研究表明：將耐熱性較差的木聚糖酶氨基酸片段替換為耐熱性較高的含二硫鍵的氨基酸序列，可在一定程度上改善其熱穩(wěn)定性。由于氨基酸替換引入二硫鍵的相應(yīng)位點依據(jù)可靠，且具有易于操作，直接快速等特點，因而，該策略較為常用且成功率高。高樹娟等[31]將米曲霉(Aspergillusoryzae)源木聚糖酶AoXyn11A的N端37個氨基酸替換成耐熱木聚糖酶EvXyn11TS含有二硫鍵的42個氨基酸，在木聚糖酶AoXyn11A中引入一個二硫鍵(Cys5-Cys32)，獲得耐熱雜合突變酶AEx11A。與野生型AoXyn11A相比，突變酶AEx11A最適溫度提高了25 ℃，達到75 ℃，且在70 ℃的半衰期提高了197倍，為197 min。Yin等[32]將耐熱木聚糖酶EvXyn11TS含二硫鍵的62個氨基酸片段替換中溫木聚糖酶AoXyn11的N末端57個氨基酸，在AoXyn11的N端引入二硫鍵(Cys5-Cys32)[33]，AoXyn11最適溫度提高25 ℃，達到75 ℃，且半衰期由45 ℃條件下的52 min提高到70 ℃的60 min。Sun等[34]將褐色高溫單孢菌(Thermomonosporafusca)源耐熱木聚糖酶TfxA的含二硫鍵N端氨基酸序列替換黑曲霉(Aspergillusniger)源木聚糖酶AnxA的N端相應(yīng)位置的氨基酸序列，構(gòu)建雜合突變酶ATx，在70 ℃和pH值5.0的條件下保溫2 min，ATx殘余酶活為72%，而野生酶AnxA僅為42%；且ATx具有較寬的pH值穩(wěn)定范圍(3.0～10.0)，N端替換突變酶ATx表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性。許多研究表明，通過氨基酸替換引入二硫鍵，對酶的穩(wěn)定性具有一定的作用。

2.2 定點突變

定點突變是酶改造的常用方法，該方法通過比較不同性質(zhì)酶的氨基酸序列，準(zhǔn)確改變一個或多個氨基酸，從而改變酶的性質(zhì)[19]。相比于氨基酸替換的方法，定點突變法可有針對性的改變某個或某幾個氨基酸來構(gòu)建二硫鍵，避免了許多不必要的氨基酸突變，其更具準(zhǔn)確性、高效性。許多研究者利用定點突變技術(shù)在GH11木聚糖酶熱穩(wěn)定性的改造方面做了大量的探索。Li等[15]通過突變中溫木聚糖酶AoXyn11A中的兩個氨基酸為半胱氨酸，構(gòu)建了二硫鍵(S108C-N152C)，50 ℃條件下含二硫鍵突變酶AoXyn11AT的半衰期為71 min，約為野生酶AoXyn11A(25 min)的3倍。Fenel等[30]運用定點突變技術(shù)，在木聚糖酶XYNII的N端引入二硫鍵(T2C-T28C)，突變體XYNII-Y5在65 ℃條件下的半衰期由原酶的40 s提高到20 min，相較原酶提高30倍。Tang等[35]突變木聚糖酶Xyn2的兩個氨基酸Phe和Gln為Cys，引入二硫鍵(F14C-Q52C)，60 ℃下突變體半衰期提高為原酶的2倍(10.7 min)。研究表明：通過突變GH11木聚糖酶分子上的兩個氨基酸為半胱氨酸，使得兩個半胱氨酸間形成二硫鍵，實現(xiàn)酶分子中二硫鍵的引入，可在一定程度上改善酶的穩(wěn)定性。

2.3 基于程序計算設(shè)計二硫鍵位點

隨著計算機技術(shù)的不斷發(fā)展，利用計算機程序來預(yù)測并設(shè)計二硫鍵作為一種直接、簡便的方法[36]，受到了越來越多研究者的青睞。運用計算機程序計算，可量化構(gòu)建二硫鍵的影響因素，從而為二硫鍵的設(shè)計提供參考。計算機輔助設(shè)計二硫鍵區(qū)別于氨基酸替換和定點突變法，最大的特點在于，可不進行不同酶間的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)等的比較，利用程序計算的方法直接探索酶結(jié)構(gòu)中可能形成二硫鍵的位點。該方法對于一些結(jié)構(gòu)與性質(zhì)關(guān)系還未知或僅有初步了解的GH11木聚糖酶，挖掘其潛在的可形成二硫鍵的相應(yīng)位點，從而實現(xiàn)成功構(gòu)建二硫鍵十分具有優(yōu)勢。Dani等[37]根據(jù)形成二硫鍵前后構(gòu)建位點B因子變化、二硫鍵周圍空間變化等參數(shù)評估，完善了用于預(yù)測二硫鍵形成位點的自動化建模程序MODIP，可排除對二硫鍵形成不利的因素；Dombkowski和Craig開發(fā)了Disulfide by Design (DBD) 軟件和一個在線網(wǎng)站 (http:∥cptweb.cpt.wayne.edu/dbd2/)，以輔助預(yù)測可能形成二硫鍵的殘基對位點，通過分析鍵能、二面角、鍵距、鍵幾何形狀和B因子值，來識別潛在的二硫鍵[29,38]；Jeong等[39]利用二硫鍵設(shè)計程序DBD分析XynA的氨基酸序列，識別可能形成二硫鍵的氨基酸位點，發(fā)現(xiàn)含有S100和N150的區(qū)域與熱穩(wěn)定性有關(guān)[40]；將這兩個殘基突變?yōu)榘腚装彼針?gòu)建了二硫鍵，65 ℃下，突變酶的半衰期由7 min增加到25 min，通過引入額外的二硫鍵，顯著改善了XynA的熱穩(wěn)定性。

利用計算機模擬技術(shù)，結(jié)合特定參數(shù)變化，分析引入二硫鍵前后酶結(jié)構(gòu)變化，可對引入二硫鍵的效果進行檢驗。均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)為蛋白質(zhì)在一定的溫度和特定的時間從原來構(gòu)象到高溫下Cα原子的位移范圍[32],通過RMSD值檢測構(gòu)建二硫鍵前后氨基酸的柔性變化，可考察熱穩(wěn)定性的改善效果[38-39]。Define secon-dary structure of proteins(DSSP)算法作為蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)可變性評估的一種算法，可預(yù)測酶的熱穩(wěn)定性[32，40]。Zheng等[41]在來源于Candidaboidini的甲酸脫氫酶(CboFDH)中構(gòu)建二硫鍵，圓二色譜分析和分子動力學(xué)模擬表明，含有二硫鍵的異構(gòu)體降低了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)整體的RMSD，從而增強了蛋白質(zhì)的剛性。Yagi等[17]將來源于StreptomycesolivaceoviridisE-86的GH11木聚糖酶SyXyn11本身含有的二硫鍵斷裂，形成突變體SyXyn11C5T，突變酶SyXyn11C5T的RMSD值大于野生型SyXyn11，表明SyXyn11C5T的剛性小于SyXyn11，二硫鍵斷裂后，SyXyn11C5T熱穩(wěn)定性降低；同時，利用DSSP程序分析發(fā)現(xiàn)，SyXyn11C5T的解鏈速度較SyXyn11快，進一步表明SyXyn11本身存在的N端二硫鍵可在高溫下賦予該酶優(yōu)越的穩(wěn)定性。

3 GH11木聚糖酶不同區(qū)域引入一個二硫鍵對其穩(wěn)定性的影響

在GH11木聚糖酶合適位點或區(qū)域引入二硫鍵，可降低蛋白質(zhì)骨架的構(gòu)型熵，以增強酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[18,42-45]。研究表明，催化殘基所在的Palm區(qū)對酶結(jié)構(gòu)的解折疊具有較強抵抗力，其結(jié)構(gòu)具有一定剛性，而除Palm區(qū)外，位于GH11木聚糖酶Fingers區(qū)N端區(qū)域和靠近Thumb區(qū)的α-螺旋區(qū)域(圖1)具有較強靈活性，故在酶N端及α-螺旋區(qū)域引入二硫鍵，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有十分重要的作用[46-48]。圖2以里氏木霉(Trichodermareesei)源GH11木聚糖酶XYNⅡ(PDB ID：1xyp)為模型分別展現(xiàn)了N端(a)及α-螺旋區(qū)(b)引入二硫鍵的位置[30,46]。

藍(lán)色代表構(gòu)建的二硫鍵。圖2 XYNⅡ中構(gòu)建二硫鍵的不同區(qū)域Fig.2 Different regions of constructing disulfide bonds in XYNⅡ

3.1 GH11木聚糖酶N端二硫鍵對其穩(wěn)定性的影響

N端位于GH11木聚糖酶Cord區(qū)的對立面，即從N端初始氨基酸延伸至β-折疊B3處，包括A和B共5或6個β-折疊[46]，共同參與構(gòu)成GH11木聚糖酶結(jié)構(gòu)Fingers區(qū)(圖1)。β-折疊B是GH11木聚糖酶催化裂縫的組成部分，參與底物的結(jié)合和產(chǎn)物的釋放，β-折疊A則位于催化裂縫背面、木聚糖酶表面。在木聚糖酶N端引入二硫鍵，可以將相鄰β-折疊緊密結(jié)合，有效阻止木聚糖酶結(jié)構(gòu)的解折疊[25,47,49],與GH11木聚糖酶的穩(wěn)定性密切相關(guān)[7]。

許多研究通過在N端不同β-折疊片上引入二硫鍵，考察二硫鍵對酶穩(wěn)定性的影響。Tang等[35]在木聚糖酶Xyn2的B2與B3間引入二硫鍵(F14C-Q52C)，60 ℃下突變體半衰期提高為原酶的兩倍(10.7 min)。Fan等[50]在木聚糖酶T-Xyn的N端A區(qū)與B區(qū)(A3與B3)間引入二硫鍵T38C-S50C，與原酶相比，突變酶最適溫度降低15 ℃，為55 ℃，且引入二硫鍵后突變體在高于55 ℃時酶活力急劇下降到60%以下，而原酶殘余酶活在65 ℃時還可保持80%以上。二硫鍵T38C-S50C未賦予該酶改善的熱穩(wěn)定性，但提高了酶的pH值穩(wěn)定性，在pH值4.0下保溫30 min，突變酶殘余酶活可達80%，而原酶T-Xyn不足60%。Xiong等[51]在木聚糖酶TRXⅡ的N端A區(qū)和B區(qū)β-折疊區(qū)分別引入二硫鍵，構(gòu)建兩個突變體T2C-T28C和T7C-S16C，突變體均表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。與T2C-T28C相比，T7C-S16C具有較差的穩(wěn)定性，推測B1與B2間的二硫鍵(T7C-S16C)允許蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在高溫下部分展開，T2C-T28C表現(xiàn)出對酶熱穩(wěn)定性更突出的貢獻。因此，在N端A區(qū)和B區(qū)β-折疊片引入二硫鍵可有效提高酶的穩(wěn)定性，重要的是，相比于N端B區(qū)，N端A區(qū)引入二硫鍵對酶熱穩(wěn)定性具有更突出的改善效果。Wang等[52]在疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)源木聚糖酶TLX的N末端初始氨基酸與A2間引入二硫鍵Q1C-Q24C，突變酶在70 ℃下半衰期提高了20倍，其熱穩(wěn)定性顯著增強；Fenel等[30]在XYNII木聚糖酶相似區(qū)域引入二硫鍵T2C-T28C，65 ℃下半衰期由40 s提高到25 min；Teng等[14]在木聚糖酶PjxA的N末端與A2間引入二硫鍵T2C-T29C，突變體PjxA-DB的最適溫度為65 ℃，較原酶提高了15 ℃，同時引入二硫鍵后PjxA-DB酶活力由原酶的888.6 U/mg提高到2 871.6 U/mg。 研究表明：N端β-折疊A片位于木聚糖酶表面且遠(yuǎn)離催化中心，在此區(qū)域引入二硫鍵，尤其是N末端氨基酸與A2間(2和28位氨基酸、5和32位氨基酸附近)，通過增強酶蛋白表面剛性且間接影響酶和底物的結(jié)合與催化，可以提高其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，有利于實現(xiàn)酶的穩(wěn)定性及催化活性的雙重提高。表2總結(jié)了GH11木聚糖酶N端引入二硫鍵對其穩(wěn)定性的影響[14，30-31，33，35，50-51,53-58]。

3.2 GH11木聚糖酶α-螺旋與β-折疊間二硫鍵對其穩(wěn)定性的影響

α-螺旋位于木聚糖酶Palm區(qū)對立面，與中溫木聚糖酶相比，嗜熱木聚糖酶TLX和PVX在α-螺旋與β-折疊B7間均含有一個天然二硫鍵C110-C154，兩條主鏈間(α-螺旋與β-折疊B7)的距離減少了0.5 ?[59]，有利于該區(qū)域形成更緊湊的結(jié)構(gòu)，以防止β-折疊片展開，使木聚糖酶結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。此外，Tian等[60]在木聚糖酶XynB的α-螺旋與其相鄰β-折疊B7間引入二硫鍵S98C-N145C后，XynB在65 ℃下的半衰期提高5倍，由10 min增加到50 min。同時，在α-螺旋上突變一個氨基酸A153E，將該酶在65 ℃下的半衰期進一步提高到60 min。由此表明，在中溫木聚糖酶α-螺旋與β-折疊B7間引入二硫鍵，可以提高中溫木聚糖的穩(wěn)定性。

表2 GH11木聚糖酶N端引入二硫鍵對其穩(wěn)定性的影響

續(xù)表2

許多研究關(guān)注到α-螺旋與B9之間引入二硫鍵以改善酶的穩(wěn)定性(表3)。Yang等[61]在木聚糖酶XYNB-TB的α-螺旋與B9間引入二硫鍵，與不含二硫鍵的XYNB-TB相比，突變體表現(xiàn)出更好的耐酸性和熱穩(wěn)定性，pH值穩(wěn)定范圍變寬，由XYNB-TB的4.0～9.0變?yōu)?.0～9.0，在70 ℃半衰期提高了7.5倍，由20 min(XYNB-TB)增加至150 min。Xiong等[51]在木聚糖酶TRXⅡ的α-螺旋與β-折疊B9不同位置添加二硫鍵，獲得3個突變體DS2(S110C-N154C)、DS3(V108C-A158C)和DS4(L105C-Q162C)，表現(xiàn)出不同的酸穩(wěn)定性，DS4的pH值穩(wěn)定范圍低于其余突變體及原酶，DS2的pH值穩(wěn)定范圍偏堿，DS3的pH值穩(wěn)定范圍偏酸，突變酶的半衰期有不同程度的提高，表明三者熱穩(wěn)定性均改善。由此可知，在木聚糖酶的α-螺旋與B9之間引入二硫鍵不僅可以提高熱穩(wěn)定性，還能改變pH值穩(wěn)定性范圍。

表3 GH11木聚糖酶α-螺旋與β-折疊間構(gòu)建二硫鍵對其穩(wěn)定性及催化性質(zhì)的影響

在木聚糖酶的α-螺旋與B9之間引入二硫鍵對酶活性及底物親和力也產(chǎn)生一定影響。木聚糖酶XYNB-TB構(gòu)建了一個二硫鍵S109C-N153C[61]，其酶活力由883.36 U/mg減小為523.33 U/mg，Km由28.75 g/kg增加為33.60 g/kg，二硫鍵構(gòu)建后酶活力下降且底物親和力減弱。同樣的結(jié)果在木聚糖酶XYNII和XynB發(fā)現(xiàn)[13,60]，可能原因是B9折疊片與Cord區(qū)相連，B9折疊片結(jié)構(gòu)變化可能會影響Cord區(qū)的柔性。在木聚糖酶的α-螺旋與B9之間引入二硫鍵，可以增強α-螺旋與B9折疊片的結(jié)構(gòu)剛性，間接降低Cord區(qū)的柔性，在底物進入酶的催化裂縫后，限制酶構(gòu)象變化，不利于酶與底物的結(jié)合與催化。

3.3 GH11木聚糖酶其他區(qū)域二硫鍵對其穩(wěn)定性的影響

C端主要位于木聚糖酶β-折疊A3區(qū)域，該區(qū)域結(jié)構(gòu)具有較強柔性，與N端相比，C端影響酶穩(wěn)定性的相關(guān)研究較少。盡管C端位于木聚糖酶解折疊的末端，但其對酶熱穩(wěn)定性的貢獻不容忽視。Cai等[12]在木聚糖酶XynZF-2的C端添加二硫鍵，其最適溫度提高了15 ℃，即由45 ℃提高到60 ℃，50 ℃保溫30 min，突變酶殘余酶活由原酶的50%提高到90%，且pH值穩(wěn)定范圍由5.0～7.0提高到3.0～9.0，酶pH值穩(wěn)定性增強，這與Kumar的研究相似[59]。Gruber等[62]將來源于Thermomyceslanuginosus的耐熱木聚糖酶晶體結(jié)構(gòu)與其同源已知結(jié)構(gòu)的GH11木聚糖酶進行了比較，發(fā)現(xiàn)該耐熱酶的熱穩(wěn)定性與C端含有二硫鍵C122-C166有關(guān)。以上結(jié)果表明，在木聚糖酶C端引入二硫鍵可以在一定程度上改善酶的熱穩(wěn)定性。

Cord區(qū)位于木聚糖酶催化裂縫的側(cè)翼部分，連接β-折疊B6和B9，與α-螺旋、Thumb、Fingers相連，通過分子動力學(xué)模擬及酶分子晶體結(jié)構(gòu)分析，證明Cord區(qū)具有一定靈活性[63]。木聚糖酶Cord區(qū)域的二硫鍵較多存在于中溫木聚糖酶中，如木聚糖酶AKX、ANX和XynC[64-65]，表明Cord區(qū)二硫鍵對熱穩(wěn)定性貢獻較小。Michaux等[65]解析出木聚糖酶XYL1的晶體結(jié)構(gòu)，研究了Cord區(qū)域二硫鍵對木聚糖酶XYL1酸堿穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)其二硫鍵不是影響酶酸堿穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。綜上可知，Cord區(qū)域二硫鍵對木聚糖酶的穩(wěn)定性具有較小影響。一定程度上，Cord區(qū)構(gòu)建二硫鍵并不是穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)的最優(yōu)選擇。

較多研究證實，在GH11木聚糖酶N端、α-螺旋與β-折疊間以及C端引入二硫鍵對于該酶的穩(wěn)定性均有不同程度的改善效果，尤其是在N端的A區(qū)、α-螺旋與B7、B9間引入二硫鍵時，對酶熱穩(wěn)定性的影響顯著。值得注意的是，GH11木聚糖酶N末端氨基酸及A2間(2和28位氨基酸、5和32位氨基酸附近)的相應(yīng)位點，相較于α-螺旋以及C端，其位于酶結(jié)構(gòu)表面且遠(yuǎn)離酶的催化中心，在此成功引入二硫鍵后，不僅對酶穩(wěn)定性的改善效果突出，甚至可實現(xiàn)酶穩(wěn)定性及催化活性的雙重提高；在α-螺旋與B9間引入二硫鍵，雖可在改善酶熱穩(wěn)定性的同時改變pH值穩(wěn)定范圍，但由于B9與Cord區(qū)相連，且靠近酶的催化中心，引入二硫鍵可能會產(chǎn)生影響酶與底物結(jié)合的構(gòu)象變化，進而降低該酶活性。由此可知，在GH11木聚糖酶的分子改造過程中需根據(jù)實際情況選擇合適的引入二硫鍵的策略。盡管有研究表明：GH11木聚糖酶C端引入二硫鍵對酶的穩(wěn)定性具有一定改善作用，但相關(guān)研究數(shù)據(jù)較少，對比分析較為困難，需通過更多更系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)分析以及實驗驗證，才能有望更全面、深入地了解GH11木聚糖酶不同區(qū)域引入二硫鍵對其穩(wěn)定性的影響。

4 GH11木聚糖酶中引入多個二硫鍵對其穩(wěn)定性的影響

在木聚糖酶的N端、C端及α-螺旋處單個二硫鍵的引入可以增強酶的穩(wěn)定性，越來越多的研究表明通過在相同或不同區(qū)域構(gòu)建多個二硫鍵，在一定程度上可以增強二硫鍵對酶穩(wěn)定性的改善效果。Teng等[14]在嗜酸木聚糖酶PjxA的N端構(gòu)建兩個二硫鍵形成突變酶，與原酶PjxA(不存在二硫鍵)和含一個二硫鍵突變酶PjxA-DB相比，含兩個二硫鍵的突變酶熱穩(wěn)定性提高；在60 ℃下保溫30 min，突變體DB-s1s4殘余酶活為59.23%，高于突變體PjxA-DB(50%)。Paes等[66]在木聚糖酶Tx-xyl的N端與C端之間、β-折疊B9與α-螺旋之間均構(gòu)建了一個二硫鍵，在酶最適溫度(75 ℃)下，突變酶半衰期增加了10倍(從18 min增加到180 min)。

引入二硫鍵前后的酶空間結(jié)構(gòu)變化表明，引入額外的二硫鍵導(dǎo)致未折疊多肽的構(gòu)型鏈熵降低，說明每個二硫鍵均對該酶熱穩(wěn)定性有貢獻[42]。Wakarchuk等[46]通過比較引入單個、2個、3個二硫鍵對酶穩(wěn)定性的影響發(fā)現(xiàn)，69 ℃下具有2個或3個二硫鍵的組合突變體能在20 min內(nèi)保持活性，而含單個二硫鍵的突變體則失去活性。Xiong等[51]在木聚糖酶TRX Ⅱ的α-螺旋與β-折疊間、N端各引入一個二硫鍵，突變體DB1(T2C-T28C，S110C-N154C)在65 ℃下半衰期大于56 h，是原酶TRX Ⅱ(30 s)的5 000倍，并拓寬了pH值穩(wěn)定范圍(由5.0～6.8變?yōu)?.0～9.2)，但DB3(T7C-S16C,S110C-N154C)對酶熱穩(wěn)定性提高不顯著。由此可見，不同的二硫鍵組合對酶的熱穩(wěn)定性提升程度不同，表明多個二硫鍵對酶穩(wěn)定性的改善具有協(xié)同作用，而非累積作用[25-26]。

5 結(jié)論與展望

隨著GH11木聚糖酶的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定作用機制研究的逐步深入，引入二硫鍵作為可降低酶分子構(gòu)象熵以提高酶穩(wěn)定性的方法，在拓寬大多穩(wěn)定性差的GH11木聚糖酶的工業(yè)應(yīng)用范圍，尤其是高效生產(chǎn)功能性低聚木糖等方面得到了廣泛的關(guān)注。研究表明，GH11木聚糖酶的N端、C端及α-螺旋與β-折疊間構(gòu)建二硫鍵對酶的穩(wěn)定性至關(guān)重要。通過氨基酸替換、定點突變等方法成功引入二硫鍵可有效改善酶熱穩(wěn)定性；在酶蛋白結(jié)構(gòu)中的同一區(qū)域或多個區(qū)域構(gòu)建二硫鍵，可通過多個二硫鍵間的協(xié)同作用，進一步提升酶的熱穩(wěn)定性[46-67]。然而，不同木聚糖酶具有不同的結(jié)構(gòu)特點，相同的改造策略應(yīng)用至不同的木聚糖酶可能產(chǎn)生不同的效果，結(jié)構(gòu)相似的木聚糖酶其應(yīng)用特性也有較大差異。同時，實際生產(chǎn)對于酶的功能特性需求差別很大，如何設(shè)計選用適當(dāng)?shù)臉?gòu)建二硫鍵方法提升酶穩(wěn)定性，以適應(yīng)高溫或酸堿等工業(yè)生產(chǎn)條件一直是研究者高度關(guān)注的內(nèi)容。目前，盡管通過熱穩(wěn)定性改造研究已對GH11木聚糖酶的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定機制有了初步了解，獲得了熱穩(wěn)定性有所改善的木聚糖酶，但由于酶分子改造過程中所造成的催化活性降低以及底物特異性等變化的原因并未厘清，使得酶不能很好地兼具良好的穩(wěn)定性和較高的催化活性，制備功能性低聚木糖的工業(yè)生產(chǎn)和實際應(yīng)用陷入瓶頸[39,61]。進一步深入系統(tǒng)地研究二硫鍵在改善GH11木聚糖酶熱穩(wěn)定性方面的策略，通過綜合分析酶蛋白分子不同區(qū)域引入二硫鍵對其穩(wěn)定性的影響，在為酶分子改造提高穩(wěn)定性的相關(guān)研究積累實驗數(shù)據(jù)的同時，深入分析酶催化活性以及底物特異性、催化效率等變化的機理，有望為酶分子改造工程獲得高穩(wěn)定性的、適用于功能性低聚糖工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的GH11木聚糖酶提供科學(xué)參考。