徐 源，楊 杰，姜健楠，嚴(yán)章煒，劉 健，向 欣

作者單位：貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，貴陽 550004

膠質(zhì)瘤是發(fā)病率最高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，起源于神經(jīng)外胚層的腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[1]。膠質(zhì)瘤呈現(xiàn)多灶發(fā)展，對(duì)放療和化療不敏感，且較易復(fù)發(fā)，因而膠質(zhì)瘤患者的平均生存期較短，預(yù)后很差[2]。探究膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲的分子機(jī)制對(duì)臨床的分子靶向診療可能具有重要價(jià)值。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類沒有蛋白編碼潛能的單鏈RNA，長度通常大于200個(gè)核苷酸[3]。研究[4]顯示，lncRNA在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)或表達(dá)缺失，能夠促進(jìn)或抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、侵襲，發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。RNF185-AS1定位于染色體22，是近年來新明確的一個(gè)lncRNA，RNF185-AS1在肝細(xì)胞癌中表現(xiàn)為癌基因作用，沉默RNF185-AS1能夠抑制肝細(xì)胞癌的生長、轉(zhuǎn)移[5]。RNF185-AS1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)和作用并無相關(guān)報(bào)道。miR-637是一種抑癌基因，過表達(dá)miR-637能夠抑制骨肉瘤、肝癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲[6]。該研究采用小干擾RNA沉默膠質(zhì)瘤細(xì)胞中RNF185-AS1表達(dá)，明確其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和侵襲的調(diào)控功能，探討miR-637在此過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人腦星型膠質(zhì)正常細(xì)胞系HEB和人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(SNB-19、LN382、U87MG、U251)購自美國ATCC公司。LipofectamineTM 3000和qRT-PCR試劑盒購自美國Invitrogen公司。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。pcDNA-sh-Con對(duì)照質(zhì)粒、miR-637 mimic、pcDNA-sh-RNF185-AS1質(zhì)粒(AACAAGTCAATAATGACGGAGCCTCGAGGTTTAGGGTGGT)、miR-Con mimic、雙熒光素酶報(bào)告基因載體(野生型pGL3-WT-RNF185-AS1和突變型pGL3-MUT-RNF185-AS1)購自上海生工生物工程有限公司。Transwell小室、基質(zhì)膠、MTT試劑盒購自美國Corning公司。雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒購自美國Promega公司。一抗兔源HMGA1、β-Tubulin、CDK3、Vimentin、N-Cadherin購自美國BD公司，二抗羊抗兔抗體購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 生物信息學(xué)方法通過GEPIA數(shù)據(jù)庫在線分析膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中RNF185-AS1的表達(dá)水平。通過linc2GO數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測RNF185-AS1的靶基因，RNF185-AS1和miR-637存在互補(bǔ)核苷酸序列。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染采用DMEM/F12培養(yǎng)基分別培養(yǎng)HEB、U87MG、U251細(xì)胞，采用RPMI 1640培養(yǎng)基分別培養(yǎng)SNB-19、LN382細(xì)胞，均含10%胎牛血清，培養(yǎng)在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱。本研究選取對(duì)數(shù)生長期U251細(xì)胞隨機(jī)分為：sh-Con組(轉(zhuǎn)染sh-Con對(duì)照質(zhì)粒)和sh-RNF185-AS1組(sh-RNF185-AS1質(zhì)粒)，根據(jù)LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑使用說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4 qRT-PCR檢測RNF185-AS1、miR-637和HMGA1 mRNA表達(dá)采用TRIzol法提取腦星型膠質(zhì)正常細(xì)胞系和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模版進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物如下，RNF185-AS1上游引物為5′- GTCACATGTGGGTTT CCCCT-3′，下游引物為5′- AACTGAACAAGCAGCC CTGT-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCA CA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-637上游引物為5′-ACUGGGGGCUUUCG GGCUCUGCGU-3′，下游引物為5′-GCAGAGCCCG AAAGCCCCCAGU-3′；GAPDH上游引物為5′- GGATTTGGTCGTATTGGGCG-3′，下游引物為5′- CGGTGCCATGGAATTTGCC-3′；HMGA1上游引物為5′-AGCGAAGTGCCAACACCTAAG-3′，下游引物為5′-GCCCCTTGGTTTCCTTCCT-3′。以2-ΔΔCt法計(jì)算RNF185-AS1、miR-637和HMGA1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平，HMGA1 mRNA和RNF185-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-637以U6為內(nèi)參。

1.5 MTT法檢測U251細(xì)胞的活力分別將sh-Con組和sh-RNF185-AS1組U251細(xì)胞按照150 μl/孔(3×103個(gè))接種到96孔板。分別于接種1、2、3、4、5 d，每孔加入5 g/L的MTT試劑15 μl。培養(yǎng)3.5 h后終止培養(yǎng)，吸去上清液，加入140 μl/孔的二甲基亞砜，震蕩25 min，保證結(jié)晶物溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀波長設(shè)定為490 nm，分別測定各孔的吸光度(A)值。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測U251細(xì)胞侵襲能力分別將sh-Con組和sh-RNF185-AS1組U251細(xì)胞采用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，將200 μl細(xì)胞懸液(3×104個(gè))接種到鋪有基質(zhì)膠的Transwell上室，加入600 μl含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基至Transwell下室，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞。24 h后用甲醇固定上室40 min，用0.8%的結(jié)晶紫染色40 min，棉簽拭去未穿過基質(zhì)膠和上室膜上層的U251細(xì)胞。倒置顯微鏡下隨機(jī)選7個(gè)視野，記錄侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測將構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(野生型WT-RNF185-AS1和突變型MUT-RNF185-AS1)分別與miR-Con或miR-637共轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h。按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒的使用說明書，檢測每個(gè)共轉(zhuǎn)染組U251細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性。

1.8 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測HMGA1蛋白及相關(guān)表型蛋白表達(dá)RIPA裂解液提取sh-Con組和sh-RNF185-AS1組蛋白樣品，配制SDS-PAGE凝膠，蛋白上樣電泳。濕式轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用封閉液搖床孵育3 h。加入一抗HMGA1(1 ∶1 000)、CDK3(1 ∶2 000)、Vimentin(1 ∶3 000)、N-Cadherin(1 ∶2 000)、β-Tubulin(1 ∶2 000)，4 ℃孵育15 h。封閉液洗膜3次，加入二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育3 h。封閉液洗膜3次，加入電化學(xué)顯色試劑，通過凝膠成像儀顯色和拍照。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中RNF185-AS1的表達(dá)水平GEPIA數(shù)據(jù)庫在線分析顯示(圖1)，RNF185-AS1在膠質(zhì)瘤組織中相對(duì)表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.01)。qRT-PCR結(jié)果顯示(圖2)，與HEB細(xì)胞相比，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中RNF185-AS1表達(dá)水平均明顯增加(P<0.01)，選取RNF185-AS1表達(dá)水平最高的U251進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 sh-RNF185-AS1質(zhì)粒的沉默效率qRT-PCR結(jié)果顯示，sh-RNF185-AS1組和sh-Con組U251細(xì)胞中RNF185-AS1表達(dá)分別為(1.17±0.34)和(6.89±0.29)，表明沉默RNF185-AS1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系構(gòu)建成功(P<0.01)。

2.3 沉默RNF185-AS1對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測顯示(圖3)，在接種細(xì)胞后2、3、4、5 d，sh-RNF185-AS1組U251細(xì)胞增殖活力均顯著低于sh-Con組(P<0.05)，提示沉默RNF185-AS1抑制U251細(xì)胞的增殖活力。

圖1 膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中RNF185-AS1的相對(duì)表達(dá)

圖2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和人腦星型膠質(zhì)正常細(xì)胞中RNF185-AS1的相對(duì)表達(dá)

圖3 沉默RNF185-AS1對(duì)U251細(xì)胞增殖活力的影響

2.4 沉默RNF185-AS1對(duì)U251細(xì)胞侵襲的影響Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示(圖4)，sh-RNF185-AS1組和sh-Con組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(48.78±12.83)個(gè)和(172.81±18.95)個(gè)，與sh-Con組相比，sh-RNF185-AS1組侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.01)，提示沉默RNF185-AS1抑制U251細(xì)胞的侵襲能力。

圖4 沉默RNF185-AS1對(duì)U251細(xì)胞侵襲能力的影響 結(jié)晶紫×100

2.5 RNF185-AS1與miR-637的靶向結(jié)合作用linc2GO數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示(圖5)，RNF185-AS1與miR-637存在部分連續(xù)互補(bǔ)的核苷酸序列。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測顯示(圖6)，轉(zhuǎn)染野生型WT-RNF185-AS1后，miR-637組的相對(duì)熒光素酶活性顯著低于miR-Con組(P<0.01)，表明RNF185-AS1的靶基因是miR-637。

圖5 RNF185-AS1與miR-637特異性互補(bǔ)的核苷酸序列

2.6 沉默RNF185-AS1表達(dá)對(duì)miR-637和HMGA1 mRNA表達(dá)的調(diào)控作用qRT-PCR檢測顯示，sh-RNF185-AS1組和sh-Con組U251細(xì)胞中miR-637表達(dá)分別為(4.73±0.47)和(1.07±0.29)，sh-RNF185-AS1組明顯高于sh-Con組(P<0.01)。sh-RNF185-AS1組和sh-Con組U251細(xì)胞中HMGA1 mRNA表達(dá)分別為(0.99±0.18)和(4.51±0.73)，sh-RNF185-AS1組明顯低于sh-Con組(P<0.01)，表明沉默RNF185-AS1能夠靶向正調(diào)控miR-637表達(dá)，抑制HMGA1 mRNA表達(dá)。

2.7 沉默RNF185-AS1表達(dá)對(duì)HMGA1蛋白及相關(guān)表型表達(dá)的影響Western blot檢測顯示(圖7)，沉默RNF185-AS1表達(dá)后，HMGA1蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞增殖表型蛋白CDK3表達(dá)降低，細(xì)胞侵襲表型蛋白Vimentin、N-Cadherin信號(hào)通路表達(dá)降低，表明U251細(xì)胞增殖能力和侵襲能力均降低。

圖6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證RNF185-AS1與miR-637的靶向結(jié)合

圖7 沉默RNF185-AS1表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞HMGA1蛋白及相關(guān)表型表達(dá)的影響

3 討論

大量研究[7]表明，lncRNA的表達(dá)異常與膠質(zhì)瘤的發(fā)生存在顯著相關(guān)性，是膠質(zhì)瘤血管生成、放療抵抗、化療抵抗的標(biāo)志物。lncRNA參與調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)、增殖活性、炎癥反應(yīng)、鐵死亡等關(guān)鍵細(xì)胞過程，在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮細(xì)胞調(diào)節(jié)因子作用[8]。lncRNA如NFIA-AS2在膠質(zhì)瘤組織中過度表達(dá)，其高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，可能是無病生存期和總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素[9]。如TTN-AS1在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，沉默TTN-AS1表達(dá)能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并加速細(xì)胞的凋亡[10]。RNF185-AS1是一個(gè)新型致癌作用的lncRNA，Huang et al[5]研究顯示，RNF185-AS1在肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中高度表達(dá)，高水平RNF185-AS1與晚期TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和較差的總生存率相關(guān)，敲低RNF185-AS1通過結(jié)合并抑制miR-221-5p，抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究顯示，RNF185-AS1在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中高度表達(dá)，沉默RNF185-AS1能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖活力和侵襲，表明RNF185-AS1在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮致癌基因的作用。

大量研究[11]顯示，lncRNA能夠阻斷微小RNA(miRNA)在膠質(zhì)瘤發(fā)生中的作用，恢復(fù)miRNA靶基因功能，從而調(diào)控膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。如lncRNA XIST通過靶向miR-133a促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲[12]。如lncRNA GAS5-AS1通過靶向miR-106b-5p抑制膠質(zhì)瘤U87MG和U251細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲[13]。本研究通過生物信息學(xué)分析顯示，RNF185-AS1可能在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中與miR-637互補(bǔ)結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)RNF185-AS1能夠互補(bǔ)結(jié)合miR-637。研究[14]顯示，miR-637在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)顯著下調(diào)，過表達(dá)miR-637能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究通過qRT-PCR結(jié)果顯示，沉默RNF185-AS1表達(dá)可上調(diào)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中miR-637的表達(dá)。以上結(jié)果表明，RNF185-AS1直接靶向miR-637抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。高遷移率族蛋白A1(high mobility group A1，HMGA1)是miR-637在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的直接靶基因，miR-637通過抑制HMGA1表達(dá)發(fā)揮抑癌基因作用[15]。本研究顯示，沉默RNF185-AS1表達(dá)后，HMGA1基因表達(dá)降低，間接證明RNF185-AS1通過靶向miR-637調(diào)節(jié)HMGA1基因的表達(dá)。