朱銳秋，殷佩浩

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)上海普陀中心臨床學(xué)院，上海 200062

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是新發(fā)癌癥病例的第三大原因，也是癌癥相關(guān)死亡的第二大常見原因。轉(zhuǎn)移頻率和耐藥性的增加導(dǎo)致 CRC 患者的預(yù)后不良。據(jù)估計(jì)，50%～60%的CRC患者可能有轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)移性CRC患者的5年總生存率僅為13.3%，而局限期患者的5年總生存率為91.1%[1-2]。其中，腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME) 是癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的必要先決條件。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibroblast, CAF)是CRC基質(zhì)的主要細(xì)胞類型之一，其通過利用旁分泌因子在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成和化學(xué)抗性中起重要作用[3-4]。越來越多的證據(jù)表明，STAT3信號(hào)通路的激活是CRC細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT)和侵襲性增加的關(guān)鍵因素，但關(guān)于CAF來源的白細(xì)胞介素-6 (interleukin- 6, IL-6)對于STAT3信號(hào)通路的激活的報(bào)道甚少[5]。蟾毒靈是從蟾蜍毒液中分離的主要生物活性成分，由于其對腫瘤細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移和增殖的影響，已被證實(shí)是一種有效的抗腫瘤藥物。有研究[6]表明，蟾毒靈具有靶向STAT3通路的作用。該研究旨在探索蟾毒靈對于CAF介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥品與試劑 DMEM培養(yǎng)基、RPIM-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、雙抗、胰酶均購自美國Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)耗材和Transwell小室購自美國Corning公司；基質(zhì)膠購自美國BD公司；RIPA裂解液、上樣緩沖液均購自美國Cell Signaling Technology公司；IL-6 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司 (Human, EK0428)；兔源FAP抗體 (英國Abcam公司, ab53066)、鼠源α-SMA (英國Abcam公司, ab124964)、鼠源STAT3抗體 (美國CST公司, 9139S)、兔源P-STAT3抗體 (美國CST公司, 9145S)、兔源E-cadherin (美國CST公司, 3195S)、兔源N-cadherin (美國CST公司, 13116S)、兔源Snail (英國Abcam公司, ab180714)、鼠源VIM (美國CST公司, 5741S)和鼠源β-actin (英國Abcam公司, ab6276)；蟾毒靈購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.1.2儀器 超低溫冰箱(青島海爾公司)，全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，凝膠電泳儀、電泳槽(美國BIO-RAD PowerPace Basic公司)，離心機(jī)(德國Hettich公司)，ChemiDoc MP成像儀(美國BIO-RAD公司)，共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)。

1.1.3細(xì)胞 該課題選取結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、CAF作為實(shí)驗(yàn)對象，HCT116來自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)細(xì)胞庫。CRC組織來源的CAF，從CRC患者的癌組織中分離得到。細(xì)胞培養(yǎng)條件是37 ℃、5% CO2。組織標(biāo)本的使用征得了患者的知情許可。

1.2 方法

1.2.1原代CAF細(xì)胞提取 在培養(yǎng)皿中加入適量的生理鹽水后將所取病人組織標(biāo)本塊置于其中，將多余脂肪、邊緣殘留組織清理掉，加入適當(dāng)10%雙抗 D-Hanks溶液45 ml清洗組織至澄清。用鑷子夾起組織，眼科剪剪碎至糊狀。用吹管將組織碎末轉(zhuǎn)移到15 ml離心管中，加入適量D-Hanks溶液完全淹沒組織，配平后1 000 r/min，25 ℃離心5 min，棄去上清液。關(guān)燈避光，加入膠原酶，封口膜封住管口，置于37 ℃恒溫?fù)u床中 150 r/min振蕩1 h。清洗膠原酶：消化后離心5 min，倒掉膠原酶，加入含15%胎牛血清完全培養(yǎng)基2 ml，吹打離散組織后離心5 min，重復(fù)此步驟3次，待膠原酶全部去除后加入培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至小培養(yǎng)皿中放入培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2細(xì)胞分組 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶CT116分成5組：對照組，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)未做任何處理；CAF-1條件培養(yǎng)基組，CAF-1條件培養(yǎng)基加入HCT116中培養(yǎng)24 h；CAF-2條件培養(yǎng)基組，CAF-2條件培養(yǎng)基加入HCT116中培養(yǎng)24 h；蟾毒靈+CAF-1條件培養(yǎng)基組，CAF-1條件培養(yǎng)基中加入蟾毒靈后加入HCT116作用24 h；蟾毒靈+CAF-2條件培養(yǎng)基組，CAF-2條件培養(yǎng)基中加入蟾毒靈后加入HCT116作用24 h，其中蟾毒靈濃度為35 nmol/L，作用時(shí)間為24 h。

1.2.3免疫熒光 CAF(2×104)在顯微鏡上接種培養(yǎng)過夜。用PBS洗滌兩次，甲醇固定15 min，0.2% TritonX-100滲透5 min，5% BSA在室溫下封閉1 h后一抗在4 ℃孵育過夜，一抗有FAP(1 ∶100，兔源)、VIM(1 ∶100，鼠源)，然后與二抗[山羊抗小鼠IgGH&L(AlexaFluor?488)]和[山羊抗兔IgGH&L(AlexaFluor?594)]孵育2 h。用DAPI進(jìn)行核定位評估。

1.2.4條件培養(yǎng)基 當(dāng)CAF增長到80%的濃度時(shí)，培養(yǎng)基被無血清的培養(yǎng)基取代。處理48 h后，收集細(xì)胞懸液作為條件培養(yǎng)基。高速離心后收集條件培養(yǎng)基，通過0.22 μm微孔膜過濾，在-20 ℃保存。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，置于冰上裂解30 min后離心提取蛋白，并使用BCA蛋白檢測試劑盒進(jìn)行蛋白定量。用10%的SDS-PAGE分離等量的細(xì)胞裂解物，并將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，依照蛋白分子量的大小截取不同條帶，將條帶與一抗孵育，一抗有FAP(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶2 000)、VIM(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶5 000)、P-STAT3(1 ∶1 000)、STAT3(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、N-cadherin(1 ∶1 000)、Snail(1 ∶1 000)。在4 ℃條件下孵育過夜，漂洗3次后與二抗在常溫下孵育1 h。洗膜3次，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色法進(jìn)行顯色，用Image J軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)分析。

1.2.6ELISA檢測IL-6水平 收集CAF、HCT116的條件培養(yǎng)基。使用ELISA試劑盒測定IL-6水平。將100 μl樣品加入抗體包被的96孔板的每個(gè)孔中，室溫下孵育2 h。將100 μl的工作檢測溶液加到每個(gè)孔中，在加入100 μl底物溶液之前，室溫下再孵育1 h。加入50 μl終止液終止反應(yīng)。在450 nm波長處讀取吸光度。

1.2.7劃痕實(shí)驗(yàn) 腫瘤細(xì)胞匯合后，用無菌移液管尖端直線劃痕HCT116。PBS清洗細(xì)胞，清除細(xì)胞碎片，加入培養(yǎng)基。24 h記錄劃痕照片，對不同樣本的劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)查和分析。使用Image J軟件測量劃痕面積。使用倒置顯微鏡獲得數(shù)碼照片。

1.2.8Transwell實(shí)驗(yàn) 預(yù)先用基質(zhì)膠包被Transwell小室的底膜并放入24孔 Transwell專用板中。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分散在300 μl無血清的培養(yǎng)基中并加入小室內(nèi)；向小室下部的孔中加入700 μl含10% FBS的培養(yǎng)基。孵育48 h后，將穿出到膜下表面的細(xì)胞用甲醇固定，結(jié)晶紫染色，并在顯微鏡下拍照，在光學(xué)顯微鏡下以×400放大倍數(shù)計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.2.9CCK-8檢測HCT116細(xì)胞活力 細(xì)胞鋪板于96孔板中，并在24 h內(nèi)用蟾毒靈作用。24 h后，使用CCK-8檢測方法評估細(xì)胞活力。

圖1 原代CAF提取及驗(yàn)證

2 結(jié)果

2.1 原代CAF提取及驗(yàn)證首先使用CRC組織標(biāo)本提取原代CAF細(xì)胞，對細(xì)胞株命名為CAF-1和CAF-2，由圖1結(jié)果可見，鏡下觀察其形態(tài)呈長梭形。提取的原代細(xì)胞表達(dá)CAF常見表面標(biāo)志物FAP、α-SMA和VIM。這一結(jié)果表明，提取的原代細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性。

2.2 CAF中IL-6的分泌水平CRC中，CAF通常有IL-6的分泌。如圖2所示，ELISA實(shí)驗(yàn)顯示，CAF的IL-6分泌強(qiáng)于CRC細(xì)胞。CAF中IL-6分泌水平高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=220.2，P<0.05 )。

圖2 各組細(xì)胞IL-6分泌水平

2.3 CAF促進(jìn)結(jié)直腸細(xì)胞STAT3信號(hào)通路激活為了進(jìn)一步探究CAF促進(jìn)CRC侵襲的機(jī)制，該研究選擇對照組、CAF-1條件培養(yǎng)基組和CAF-2條件培養(yǎng)基組進(jìn)行Western blot分析。如圖3所示，與對照組相比，條件培養(yǎng)基組中人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞HCT116的P-STAT3蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.32，P<0.05)。結(jié)果表明CAF可以促進(jìn)CRC的STAT3信號(hào)通路激活。

圖3 各組細(xì)胞P-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)量

2.4 CAF促進(jìn)CRC侵襲轉(zhuǎn)移能力提升為了觀察CRC細(xì)胞侵襲能力的改變，該研究選擇對照組、CAF-1條件培養(yǎng)基組和CAF-2條件培養(yǎng)基組進(jìn)行Western blot、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)。如圖4所示，與對照組相比，條件培養(yǎng)基組HCT116的E-cadherin蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=98.27，P<0.05)，N-cadherin和Snail蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FN-cadherin=56.3，F(xiàn)Snail=218，P<0.05)。遷移能力和侵襲能力提升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fscratch=199.1，F(xiàn)transwell=242.9，P<0.05 )。這一結(jié)果表明CAF可以促進(jìn)CRC的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

2.5 蟾毒靈對于CAF促轉(zhuǎn)移效應(yīng)的影響為了研究蟾毒靈對于CAF促轉(zhuǎn)移效應(yīng)的影響，本研究選擇CAF-1條件培養(yǎng)基組、CAF-2條件培養(yǎng)基組、蟾毒靈+CAF-1條件培養(yǎng)基組和蟾毒靈組、蟾毒靈+CAF-2條件培養(yǎng)基組進(jìn)行試驗(yàn)，其中蟾毒靈濃度為35 nmol/L，作用時(shí)間為24 h。如圖5A所示，蟾毒靈是蟾蜍毒液中分離的主要生物活性成分。如圖5B所示，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)，為該研究選擇出蟾毒靈的非殺傷濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(IC15=35 nmol/L)。如圖5C、D所示，蛋白免疫印跡分析表明蟾毒靈可以抑制CAF條件培養(yǎng)基對于HCT116中STAT3信號(hào)通路的激活，蟾毒靈組P-STAT3表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=159，P<0.05 )。通過蛋白免疫印跡分析、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示蟾毒靈組有效的抑制了CAF促進(jìn)腫瘤EMT、遷移和侵襲的效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FE-cadherin=109.8，F(xiàn)N-cadherin=64.53，F(xiàn)Snail=446.6，F(xiàn)scratch=59.5，F(xiàn)transwell=87.31，P<0.05 )。見圖5E、F。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是CRC晚期患者死亡的主要原因。大多數(shù)轉(zhuǎn)移性CRC患者的中位生存期僅為2年，遠(yuǎn)不能令人滿意[2]。為改善轉(zhuǎn)移性CRC患者的生存率，近年來越來越多的研究將重點(diǎn)放在對腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制探討當(dāng)中，如潘琪偉 等[7]的研究證明了氧化固醇結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白8(ORP8)能夠抑制CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能與阻斷EMT有關(guān)。

最近的研究[4]表明，腫瘤轉(zhuǎn)移密切依賴于腫瘤細(xì)胞與TME的相互作用，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、不斷變化的網(wǎng)絡(luò)。CAF被認(rèn)為是腫瘤基質(zhì)中的活化成纖維細(xì)胞，有助于惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。大量實(shí)驗(yàn)和臨床研究[4]支持CAF分泌生長因子來調(diào)節(jié)原發(fā)腫瘤中的腫瘤生長、EMT從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移。然而，CAF促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制還有待確定。

IL-6是一個(gè)多功能的細(xì)胞因子，能介導(dǎo)對損傷或感染的反應(yīng)，也參與免疫疾病和癌癥的過程中。最近有研究[8]表明，在癌癥中，IL-6由癌細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在原代CAF的提取后，通過ELISA實(shí)驗(yàn)觀察到IL-6在CAF中大量產(chǎn)生。IL-6水平升高會(huì)刺激STAT3信號(hào)通路的過度激活，這通常與腫瘤的EMT和患者預(yù)后不良有關(guān)[9]，本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)證明了CAF條件培養(yǎng)基會(huì)激活腫瘤細(xì)胞的STAT3信號(hào)通路。并且腫瘤STAT3信號(hào)通路的過度激活會(huì)促進(jìn)IL-6的分泌，形成正反饋，導(dǎo)致整個(gè)腫瘤微環(huán)境內(nèi)的IL-6含量進(jìn)一步增加[10]。根據(jù)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，STAT3信號(hào)通路激活后會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞EMT，并且腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力升高。雖然相較于對照組，CAF-1和CAF-2均促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞侵襲，但是促進(jìn)能力存在差異。結(jié)合文獻(xiàn)[4]顯示，這可能源于CAF存在異質(zhì)性，細(xì)胞因子分泌存在差異。所以靶向STAT3信號(hào)通路進(jìn)行治療至關(guān)重要。近幾年在鑒定和開發(fā)可應(yīng)用于臨床的STAT3抑制劑方面科學(xué)家付出了相當(dāng)大的努力。然而，鑒于STAT3作為細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的地位，其缺乏酶活性，通常被認(rèn)為是不可成藥，對STAT3可能的抑制劑開發(fā)一直很困難[11]。

蟾毒靈是一種中藥單體，是從中藥蟾酥中分離得到的主要活性成分。在過去的十年，蟾毒靈在各種癌癥中展示出杰出的抗腫瘤能力。蟾毒靈的抗癌機(jī)制可概括為抑制增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制血管生成和轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)耐藥性和誘導(dǎo)自噬[12]。最近的研究表明蟾毒靈可以有效抑制STAT3信號(hào)通路，Dong et al[13]的實(shí)驗(yàn)表明，蟾毒靈能顯著降低Mcl-1的表達(dá)，并適度降低Bcl-XL的表達(dá)水平。這些抗凋亡蛋白的下調(diào)與抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT3的激活密切相關(guān)。Wu et al[14]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，蟾毒靈在體內(nèi)和體外均抑制了JAK2和STAT3的磷酸化，進(jìn)而抑制STAT3信號(hào)通路的激活。本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)對此進(jìn)行了驗(yàn)證。通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著STAT3信號(hào)通路的抑制，CAF的促侵襲能力得到了抑制。并且根據(jù)以往研究[15]顯示，蟾毒靈還可以抑制其他促進(jìn)腫瘤侵襲的信號(hào)通路，同時(shí)指出蟾毒靈對TME細(xì)胞沒有直接影響。值得注意的是，與之前關(guān)于蟾毒靈的其他抗腫瘤研究相比，該實(shí)驗(yàn)選擇了較低濃度的蟾毒靈(IC15=35 nmol/L)[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低濃度蟾毒靈影響CAF介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并且STAT3信號(hào)通路直接作用于腫瘤細(xì)胞而不是CAF細(xì)胞，體現(xiàn)了蟾毒靈低毒性高效應(yīng)的特點(diǎn)。

綜上所述，本研究通過原代CAF的提取探討了CAF和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，提示STAT3信號(hào)通路是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，其中可以通過蟾毒靈阻斷STAT3信號(hào)通路的激活來抑制CAF介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移。