張雯倩, 王 濤, 王 佳, 王培新, 顧建文, 趙全軍

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍306臨床學(xué)院，安徽醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，北京 1001012戰(zhàn)略支援部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)外科，北京 1001013商洛市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 726000

爆炸沖擊波導(dǎo)致的顱腦損傷是軍隊(duì)作戰(zhàn)最常見的損傷之一，而其中很大一部分比例屬于輕型顱腦損傷[1]，該損傷經(jīng)常導(dǎo)致記憶與認(rèn)知功能障礙、情緒障礙等神經(jīng)功能障礙[2]，因此，研究顱腦爆震沖擊傷是現(xiàn)代軍事醫(yī)學(xué)的重要熱點(diǎn)和研究方向。過去幾十年，魚油已被普遍證實(shí)其對于神經(jīng)系統(tǒng)有改善作用，促進(jìn)腦細(xì)胞神經(jīng)元的發(fā)育，尤其在一些神經(jīng)退行性病變和精神疾病模型中顯示出一定的保護(hù)作用。該研究將尋找神經(jīng)保護(hù)因素聚焦于“魚油”，以一種全新的密閉氣壓引爆裝置來建立顱腦爆炸沖擊傷模型，探索其對于輕型顱腦爆炸沖擊傷模型的神經(jīng)保護(hù)作用，為將魚油作為“神經(jīng)保護(hù)因素”加入部隊(duì)飲食提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)，為提高我軍部隊(duì)服役人員戰(zhàn)斗力提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物54只SD雄性乳鼠(斯貝福, 北京)，體質(zhì)量62～74 g，置于恒溫飼養(yǎng)房內(nèi)(溫度25 ℃，濕度約50%)。所有大鼠隨機(jī)均分為3組：對照組、模型組、治療組。其中對照組與模型組的大鼠給予普通維持飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，治療組大鼠給予富含魚油飼料進(jìn)行喂養(yǎng)[3]。飼養(yǎng)33 d后，模型組及治療組建立由沖擊波誘導(dǎo)的輕型顱腦爆炸沖擊損傷模型，對照組大鼠不接受爆炸沖擊波損傷處理。損傷后，分別選取6 h、24 h、3 d三個時間點(diǎn)對各組大鼠進(jìn)行處死，每次處死6只。

1.2 建立輕型顱腦爆炸沖擊傷模型

1.2.1爆炸裝置簡介 該模型的基本原理是利用密閉氣壓引爆裝置產(chǎn)生沖擊波對大鼠造成顱腦爆炸沖擊傷，其設(shè)計(jì)完全模擬野戰(zhàn)環(huán)境。此裝置由高壓氮?dú)馄?、壓力表、儲氣罐、雙法蘭結(jié)構(gòu)、十字槽鋁片和實(shí)驗(yàn)動物固定器組成。當(dāng)高壓氮?dú)馄坷锏膲毫_(dá)到十字槽鋁片的閾值時，沖擊波會沖破十字槽鋁片，對動物固定器里的大鼠造成爆炸沖擊傷。動物固定器是一個由鋼板制成的保護(hù)艙，有一個直徑為2 cm的圓孔與外界相通，大鼠被固定于保護(hù)艙后，僅頭部從圓孔暴露，胸部、腹部、四肢等其他部位皆被保護(hù)艙保護(hù)起來。見圖1。

圖1 密閉氣壓引爆裝置實(shí)物圖

1.2.2模型制備 大鼠用1.5%戊巴比妥鈉1 ml腹腔注射麻醉，麻醉成功后將大鼠固定于保護(hù)艙內(nèi)，用一個U形的鐵支架固定其頭部，保證大鼠在爆炸過程中盡量減少頭部運(yùn)動。通過調(diào)節(jié)裝置與固定器之間的距離、十字槽鋁片的刻度來控制爆破強(qiáng)度。按照之前的實(shí)驗(yàn)方法，最后選擇爆炸距離50 cm，鋁片刻度0.6 mm標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)用以模擬輕型顱腦爆炸損傷，測量沖擊波峰壓(71.16±1.65)kPa，與文獻(xiàn)[4]報道輕型顱腦損傷程度一致。

1.3 檢測方法及指標(biāo)

1.3.1腦組織切片制備 各組分別于6 h、24 h、3 d三個時間點(diǎn)各隨機(jī)抽取6只大鼠深度麻醉，用4%多聚甲醛(PFA)經(jīng)左心室灌注大腦，并完整取出，按4% PFA、10%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液的順序浸泡脫水。將選定范圍內(nèi)腦組織冰凍后行45 μm層厚連續(xù)冠狀切片，貼于已處理的載玻片上供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.2病理觀察和免疫組化染色 腦組織切片依次經(jīng)過蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察各組腦組織結(jié)構(gòu)的病理學(xué)變化。另外，腦組織切片用0.1 mmol/L PBS緩沖液(pH7.4)洗滌3次，在含5%山羊血清和0.3% Triton X-100的PBS液中封閉孵育1 h (37 ℃)后，分別用GFAP單抗(鼠源, 1 ∶2 000, Vector lab, 美國)和Iba-1單抗(鼠源, 1 ∶1 500, Vector lab, 美國)室溫孵育24 h，再經(jīng)過羊抗鼠IgG和交聯(lián)可吸收的橙/紅二抗( Vector lab)室溫孵育2 h。顯微鏡下觀察抗原抗體的染色情況并拍照。陰性對照染色用0.1 mmol/L PBS代替上述抗體。

1.3.3損傷神經(jīng)元染色 用Fluoro-Jade B組織熒光染色法檢測大鼠腦組織神經(jīng)元損傷情況。腦組織切片依次置于100%、75%、50%乙醇及超凈水中序貫復(fù)水，接著于0.006%高錳酸鉀溶液中輕微震蕩搖晃15 min并以超凈水清洗，接下來將切片置于0.001% FJ-B(Histochem, 美國)和0.1%醋酸染色液中染色(30 min, 避光)。最后在二甲苯中浸泡10 min后蓋片備用。

1.3.4細(xì)胞定量計(jì)數(shù) 對大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)采用的是人工計(jì)數(shù)的方法，每張切片相應(yīng)區(qū)域選取3個視野，測量每個視野中錐體細(xì)胞條帶長度，通過人工計(jì)數(shù)細(xì)胞膜、核膜完整，核仁清楚的存活錐體細(xì)胞，換算成錐體細(xì)胞數(shù)(個/mm2)。細(xì)胞定量采用的是Image-Pro Plus 6.0分析軟件，分別選擇海馬CA3區(qū)(一端以上下末端顆粒細(xì)胞進(jìn)入齒狀突為界，另一端以錐體細(xì)胞層變窄交界區(qū)即CA1/2交界區(qū)域?yàn)榻?以及暴露損傷周邊皮層為計(jì)數(shù)區(qū)域，測量每張圖片中相應(yīng)區(qū)域的GFAP、Iba-1和FJ- B陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠爆炸傷前后體質(zhì)量變化情況大鼠初始體質(zhì)量無差別，分別是(69.28±2.78)、(68.75±2.79)、(68.63±4.13)g。傷前共進(jìn)食33 d，三組大鼠體質(zhì)量增長變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.015)。至外傷當(dāng)天，三組大鼠實(shí)際體質(zhì)量無明顯差別，分別是(312.26±6.25)、(312.33±7.55)、(315.39±8.50)g。傷后第一天和第二天，模型組及治療組大鼠體重較對照組均出現(xiàn)了一定程度體質(zhì)量下降，從第三天開始體質(zhì)量逐漸上升，兩組大鼠傷后體質(zhì)量下降程度及恢復(fù)至傷前體重水平所需時間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.212)。見圖2。

圖2 大鼠爆炸傷前后體質(zhì)量變化情況

2.2 大鼠爆炸傷后腦組織CA1區(qū)錐體細(xì)胞變化情況所有輕型爆炸傷后腦組織大體病理學(xué)均顯示腦組織皮層結(jié)構(gòu)完整，無明顯挫裂傷及血腫表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)X組織神經(jīng)細(xì)胞觀察區(qū)域限定為雙側(cè)腦組織海馬CA1區(qū)，光鏡下各組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞排列整齊，胞仁胞質(zhì)清晰，模型組大鼠海馬錐體細(xì)胞層皺縮較明顯，神經(jīng)細(xì)胞大體分布較為稀疏。見圖3。通過立體細(xì)胞計(jì)數(shù)測量系統(tǒng)分析結(jié)果提示，輕型爆炸傷后6 h、24 h、3 d，模型組和治療組大鼠海馬觀察區(qū)域的錐體細(xì)胞數(shù)量均較對照組明顯減少(F=229.506，P<0.01)；與模型組相比，治療組可明顯增加傷后海馬區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)。不同組別各時間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.528)。見表1。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)單位面積錐體細(xì)胞數(shù)(個，

2.3 大鼠爆炸傷后腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞變化情況所有對照組大鼠腦組織海馬區(qū)均未發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量形態(tài)改變，見圖4。輕型顱腦爆炸沖擊傷后6 h、24 h、3 d，模型組及治療組免疫熒光染色均顯示海馬區(qū)GFAP陽性細(xì)胞減少，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=396.625，P<0.01)，見表2。同時在光鏡下觀察損傷海馬區(qū)域反應(yīng)性增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞，形態(tài)上表現(xiàn)為胞體肥大，細(xì)胞突起模糊不清。與模型組相比，治療組可明顯增加傷后GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)，不同組別各時間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.585)。見表2。

圖3 大鼠輕型顱腦爆炸沖擊傷后6 h海馬區(qū) HE ×100、×200

表2 各組大鼠海馬區(qū)GFAP細(xì)胞陽性數(shù)(個，

2.4 大鼠爆炸傷后腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞變化情況Iba-1染色分析結(jié)果顯示，輕型顱腦爆炸沖擊傷后6 h、24 h、3 d模型組及治療組大鼠腦組織海馬區(qū)激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞均較對照組有明顯增加(F=356.962，P<0.01)，且模型組多于治療組(P<0.01)，見圖5。對照組大鼠6 h、24 h、3 d三個時間點(diǎn)海馬區(qū)Iba-1陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組及治療組大鼠差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.263，P<0.01)，隨著時間延長，激活態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞逐漸增多，見表3。

2.5 大鼠爆炸傷后腦組織皮層神經(jīng)元凋亡情況對輕型顱腦爆炸沖擊傷后腦組織皮層神經(jīng)元FJ-B染色分析顯示，對照組大鼠各時間點(diǎn)均無明顯陽性染色，模型組及治療組大鼠中，爆炸傷后各時間點(diǎn)損傷神經(jīng)元均明顯多于對照組(F=821.864，P<0.01)，且模型組多于治療組(P<0.01)。同時，模型組及治療組各時間點(diǎn)損傷神經(jīng)元仍呈逐漸增多趨勢，3 d多于24 h多于6 h，各時間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=812.135，P<0.01)，見表4、圖6。

表3 各組大鼠海馬區(qū)Iba-1細(xì)胞陽性數(shù)(個，

表4 各組大鼠海馬區(qū)FJ-B細(xì)胞陽性數(shù)(個，

圖4 大鼠輕型顱腦爆炸沖擊傷后6 h海馬區(qū) GFAP×200

圖5 大鼠輕型顱腦爆炸沖擊傷后3 h, 24 h, 3 d海馬區(qū) Iba-1 ×200

圖6 大鼠輕型顱腦爆炸沖擊傷后6 h, 24 h, 3 d腦組織皮層 FJ-B ×200

3 討論

近年來，隨著局部地區(qū)高科技水平戰(zhàn)爭的爆發(fā)，爆炸性武器成為戰(zhàn)爭中的主要?dú)晕淦?，士兵們深受其害，而頭部在爆炸致傷的部位中占據(jù)比例尤其高。由于作戰(zhàn)時士兵們有防彈衣和防彈頭盔的保護(hù)，因此，士兵們的頭部爆炸傷大部分屬于輕型顱腦爆炸沖擊傷。

早在第一次世界大戰(zhàn)期間，就出現(xiàn)了所謂的“彈震癥”或“炮彈休克”的概念，即為輕型的爆炸相關(guān)性顱腦損傷。后來，隨著前輩們對輕型顱腦爆炸沖擊傷的深入研究，顱腦爆炸傷動物模型也應(yīng)運(yùn)而生?；谇拜厒儗︼B腦爆炸傷模型的研究，課題組發(fā)明了一種全新的密閉氣壓引爆裝置來建立顱腦爆炸沖擊傷模型，該裝置已獲得專利，且試用穩(wěn)定性好，完全模擬野戰(zhàn)環(huán)境，高度還原作戰(zhàn)時士兵所處環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性地使用此裝置來探究魚油對輕型顱腦爆炸沖擊傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

魚油是一種從多脂魚類中提取的油脂，富含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)多種n-3系多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)，其對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用得到大家的共同認(rèn)可。本課題組成員探討過進(jìn)食富含w-3多不飽和脂肪酸飲食對反復(fù)輕型顱腦損傷模型大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用[3]，本實(shí)驗(yàn)則聚焦于魚油對輕型顱腦爆炸傷后大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，顯示魚油可以減少海馬及皮層腦組織的神經(jīng)元凋亡，同時削弱輕型顱腦爆炸沖擊傷對星形膠質(zhì)細(xì)胞帶來的破壞，減弱了爆炸傷后大鼠腦組織的炎癥反應(yīng)。

眾所周知，星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持腦組織生理外環(huán)境的平衡、神經(jīng)元營養(yǎng)、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、毒性物質(zhì)的清除等過程中發(fā)揮著重要作用[5-6]，輕型顱腦爆炸沖擊傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，數(shù)目缺失、胞體突起腫脹，無疑會引起神經(jīng)元的二次損害及神經(jīng)功能障礙。研究[7]顯示，富含魚油飲食的小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞要更加活躍，證明w-3多不飽和脂肪酸飲食對星形膠質(zhì)細(xì)胞具有激活作用，保證在外傷來臨之前星形膠質(zhì)細(xì)胞處于一種“備戰(zhàn)”狀態(tài)，從而減弱腦組織受損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)顯示，無論是6 h、24 h、還是3 d，治療組大鼠腦組織海馬區(qū)GFAP陽性染色細(xì)胞數(shù)均多于模型組，這說明魚油在一定程度上保護(hù)了星形膠質(zhì)細(xì)胞免受破壞。

小膠質(zhì)細(xì)胞隸屬于單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，在外傷、感染等病理因素聚集下成為腦組織抵御損傷的第一道防線[8]。本研究顯示大鼠爆炸傷后6 h腦組織海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞即出現(xiàn)了活化，數(shù)量明顯多于對照組。且隨著時間的延續(xù)，小膠質(zhì)細(xì)胞不斷活化，形態(tài)上表現(xiàn)為突觸收縮，胞體增大融合，形成巨噬樣改變，吞噬有害物質(zhì)，數(shù)目越來越多，炎癥反應(yīng)越來越明顯。魚油是一種抗炎化合物[9]，可以增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞屏障[10]，提高小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能力，具有神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療組在各個時刻小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目均明顯少于模型組，這表明魚油減弱了爆炸傷后大鼠腦組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)了小膠質(zhì)細(xì)胞的屏障功能及抵御外來傷害的能力。

綜上，輕型顱腦爆炸沖擊傷對大鼠腦組織有損害作用，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷、炎癥的產(chǎn)生、神經(jīng)元的凋亡等，而魚油對大鼠的腦組織有一定的保護(hù)作用，可減弱這些損傷的發(fā)生及程度。