郭嘉，卞華，陳爽，單雨，卞博，

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南省中醫(yī)院風(fēng)濕病科，鄭州 450008；2.南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院，河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473004）

硬皮病也稱系統(tǒng)性硬化癥，其特征是廣泛的血管損傷和功能障礙，血管生成受損，免疫失調(diào)和皮膚、內(nèi)臟器官的進(jìn)行性纖維化［1］。纖維化的發(fā)病機(jī)制主要涉及缺血再灌注、氧化應(yīng)激以及纖溶和凝血功能失衡［2］。硬皮病發(fā)病有多種免疫異常，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［3］共同參與。硬皮病早期纖維性病變伴有血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，主要由T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞共同參與［2］。研究［2，4］顯示，超過90%的硬皮病患者能檢測(cè)到激活的血管、上皮和免疫細(xì)胞產(chǎn)生促纖維化的細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、脂質(zhì)介質(zhì)和自身抗體（抗DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ、抗著絲粒和抗RNA聚合酶抗體）。目前，多數(shù)研究認(rèn)為硬皮病發(fā)病與基因遺傳、環(huán)境誘導(dǎo)、病毒感染有關(guān)。本研究基于基因表達(dá)圖譜（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫芯片數(shù)據(jù)，并與正常人群進(jìn)行比較，探討硬皮病發(fā)病的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 GEO芯片數(shù)據(jù)及硬皮病差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）獲取

登錄GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ），以“scleroderma”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索；獲取以GPL14951-11332為平臺(tái)文件的GSE117928芯片數(shù)據(jù)［5］。該芯片使用illumina BeadChips方法對(duì)18例硬皮病患者（硬皮病組）和19例正常對(duì)照者（正常組）進(jìn)行全基因組mRNA轉(zhuǎn)錄和整體DNA甲基化分析。使用R軟件中的“l(fā)imma”包進(jìn)行t檢驗(yàn)，過濾條件為|logFC|＞1，調(diào)整P＜0.05，篩選硬皮病的DEGs；并通過R軟件中“pheatmap”包繪制熱圖。

1.2 基因本體（gene ontology，GO）富集分析及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)獲取

使用R軟件中的“colorspace”“stringi”“org.Hs.eg.db”“ggplot2”包對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集分析。將獲取的DEGs輸入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org ）進(jìn)行PPI分析，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最低互動(dòng)要求分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.9。下載相關(guān)數(shù)據(jù)，使用Cytoscape 3.8.0軟件，根據(jù)中介中心度、接近中心度、程度中心性、特征向量中心度、基于局部平均連接度的方法、信息中心度以及網(wǎng)絡(luò)中心性，設(shè)置過濾條件為每項(xiàng)皆大于中位值，階梯式過濾2次，最終獲取核心靶點(diǎn)。

1.3 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）通路分析

GSEA是用來確定一組先驗(yàn)定義的基因是否在兩種生物狀態(tài)之間顯示出統(tǒng)計(jì)上顯著、一致的差異的計(jì)算方法。將下載的GEO矩陣文件整理并分組為硬皮病組和正常組。使用GSEA 4.1.0軟件，基因功能數(shù)據(jù)庫選擇c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt［Curated］，檢驗(yàn)次數(shù)設(shè)置為1 000。一般認(rèn)為|NES|＞1，P＜0.05，F(xiàn)DRq＜0.25的通路存在顯著差異［6］。

1.4 免疫細(xì)胞浸潤（immune cell infiltration，ICI）分析

將獲取的GSE117928芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行ICI分析。采用CIBERSORT標(biāo) 準(zhǔn)，perm=1 000，P＜0.05為過濾條件，獲取硬皮病組和正常組中20類免疫細(xì)胞表達(dá)的相對(duì)含量。分析2組免疫細(xì)胞的差異和硬皮病組內(nèi)各免疫細(xì)胞的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 DEGs獲取結(jié)果

結(jié)果顯示，共獲取硬皮病組與正常組DEGs 722個(gè)，其中上調(diào)基因298個(gè)，下調(diào)基因424個(gè)。見圖1。

圖1 正常組與硬皮病組DEGs熱圖Fig.1 Heat map of differentially expressed genes between normal and scleroderma groups

2.2 GO富集分析及PPI核心靶點(diǎn)獲取結(jié)果

GO富集分析結(jié)果顯示，DEGs多富集在中性粒細(xì)胞活化參與免疫反應(yīng)、嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒、髓系細(xì)胞分化、對(duì)脂多糖反應(yīng)、積極調(diào)節(jié)防御反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌源分子的反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、正向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、對(duì)生物刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、核糖核酸分解過程等生物功能，見表1。登錄STRING數(shù)據(jù)庫，輸入DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。下載相關(guān)數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape軟件，使用CytoNCA插件對(duì)其進(jìn)行分析，獲取核心靶點(diǎn)包括RPS27A、BTRC、FBXO32、ZBTB16、FBXO21、VHL、ATG7、CBLB、ANAPC1、COMMD9、CSNK1E、RPS8、MPHOSPH10、KRR1、RPL5，見圖2。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)Fig.2 Core targets of PPI network

表1 GO富集分析結(jié)果（排名前十位）Tab.1 GO enrichment analysis results（top 10）

2.3 GSEA通路分析

通過GSEA通路分析，根據(jù)P值大小，篩選2組排名前五位的通路繪圖。結(jié)果顯示，硬皮病組排名前五位的通路為氨基糖和核苷酸糖代謝、溶酶體代謝、谷胱甘肽代謝、糖酵解糖異生和半乳糖代謝通路。正常組排名前五位的通路為自然殺傷細(xì)胞介質(zhì)細(xì)胞毒性、剪接體、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、小細(xì)胞肺癌、T細(xì)胞受體信號(hào)通路。見表2。

表2 GSEA富集通路分析Tab.2 GSEA enrichment pathway analysis

2.4 ICI結(jié)果

使用CIBERSORT篩選出20種免疫細(xì)胞表達(dá)的相對(duì)含量。結(jié)果顯示，正常組CD8+T細(xì)胞、幼稚CD4+T細(xì)胞表達(dá)明顯增加，而硬皮病組單核細(xì)胞表達(dá)明顯增加，見圖3。

圖3 硬皮病組與正常組免疫細(xì)胞表達(dá)相對(duì)含量比較Fig.3 Comparison of immune cell expression between normal and scleroderma groups

硬皮病組各免疫細(xì)胞相關(guān)分析結(jié)果顯示，漿細(xì)胞與巨噬細(xì)胞M1、激活的肥大細(xì)胞，巨噬細(xì)胞M1與激活的肥大細(xì)胞，巨噬細(xì)胞M2與激活的樹突狀細(xì)胞，巨噬細(xì)胞M0與靜息的肥大細(xì)胞呈正相關(guān)；CD8+T細(xì)胞與靜息的CD4+T細(xì)胞、單核細(xì)胞，激活的CD4+T細(xì)胞與濾泡輔助T細(xì)胞、單核細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與單核細(xì)胞，靜息的NK細(xì)胞與巨噬細(xì)胞M2呈負(fù)相關(guān)，見圖4。

圖4 硬皮病組內(nèi)免疫細(xì)胞表達(dá)相對(duì)含量相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of immune cell expression in scleroderma group

3 討論

本研究結(jié)果顯示，硬皮病組與正常組DEGs共722個(gè)，其中上調(diào)基因298個(gè)，下調(diào)基因424個(gè)。已有研究［7］顯示，氧化應(yīng)激發(fā)生與硬皮病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，已知中性粒細(xì)胞在硬皮病的發(fā)病過程中會(huì)產(chǎn)生大量活性氧。在中性粒細(xì)胞激活過程中，由于氧化應(yīng)激，細(xì)胞釋放被組蛋白、酶和其他抗菌蛋白覆蓋的DNA細(xì)絲。這些細(xì)絲稱為中性粒細(xì)胞外陷阱，參與細(xì)菌防御過程，但它們的形成在大多數(shù)情況下會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞死亡［8］。中性粒細(xì)胞與血小板衍生的微粒相互作用，促進(jìn)自噬和硬皮病患者凈副產(chǎn)物的產(chǎn)生［9］?？怪行粤＜?xì)胞胞質(zhì)抗體（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）是在單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和溶酶體初級(jí)顆粒中發(fā)現(xiàn)的酶自身抗體，與小血管炎癥的發(fā)病機(jī)制直接相關(guān)。研究［10］顯示ANCA與硬皮病患者肺間質(zhì)肺炎、肺栓塞患病率增加有關(guān)。先天免疫在硬皮病發(fā)病過程中占據(jù)著重要地位。先天性淋巴樣細(xì)胞（innate lymphoid cells，ILCs）被發(fā)現(xiàn)于人類和小鼠的黏膜系統(tǒng)和內(nèi)臟器官中，皮膚、肺和腸黏膜中含量豐富。ILCs存于胎兒肝臟和成人骨髓中，可以產(chǎn)生先天淋巴祖細(xì)胞以及B、T細(xì)胞系［11］。國際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合將ILCs分為自然殺傷細(xì)胞、ILC1、ILC2、ILC3和淋巴組織誘導(dǎo)物5個(gè)分型［12］。研究［13］顯示，ILC2在促纖維化的“2型”途徑中處于中心地位，能夠引發(fā)下游的一系列事件，通過這些事件使轉(zhuǎn)化生長因子-β信號(hào)上調(diào)，使膠原過度沉積而導(dǎo)致異常纖維化。ILCs在協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)、維持代謝穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)組織炎癥方面發(fā)揮著重要作用［11］。GO富集分析顯示，DEGs多富集在中性粒細(xì)胞活化參與免疫反應(yīng)、嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒、髓系細(xì)胞分化、對(duì)脂多糖反應(yīng)、積極調(diào)節(jié)防御反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌源分子的反應(yīng)、先天免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)、正向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、對(duì)生物刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、核糖核酸分解過程等生物功能，與已有研究相互佐證。

本研究結(jié)果顯示，核心靶點(diǎn)包括RPS27A、BTRC、FBXO32、ZBTB16、FBXO21、VHL、ATG7、CBLB、ANAPC1、COMMD9、CSNK1E、RPS8、MPHOSPH10、KRR1、RPL5?，F(xiàn)有研究［14］顯示，F(xiàn)BXO32、過表達(dá)的miR-26可增加骨骼肌橫截面積，降低FBXO32/atrogin-1和TRIM63/MuRF1的上調(diào)，抑制了心肌纖維化病變。ZBTB16與代謝綜合征關(guān)系密切，影響脂肪生成、心肌肥大和纖維化、血脂水平和胰島素的敏感性［15］。細(xì)胞外纖維連接蛋白和膠原網(wǎng)絡(luò)受VHL蛋白調(diào)節(jié)，VHL蛋白過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)纖維連接蛋白、膠原蛋白和細(xì)胞外纖維連接蛋白的表達(dá)。一項(xiàng)關(guān)于腎臟的研究［16］表明，受VHL和TGFb1調(diào)節(jié)的MXRA5蛋白具有抗炎和抗纖維化的功能。ZHOU等［17］研究發(fā)現(xiàn)VHL蛋白在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中起著關(guān)鍵作用，可能是通過非依賴缺氧誘導(dǎo)因子的途徑。ATG7是傳統(tǒng)的大分子自噬的重要組成部分，它允許微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3B（LC3BI）通過磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)轉(zhuǎn)化為LC3BII［18］。LC3BII在ATG12-ATG5：ATG16L1復(fù)合物的幫助下整合到吞噬體膜上，且ATG7也參與其中，導(dǎo)致自噬小體成熟；成熟的自噬小體與溶酶體結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解［19］。多項(xiàng)研究顯示ATG7缺陷與肺纖維化［18］、肝纖維化［20］、腸纖維化［21］、腹膜纖維化［22］關(guān)系密切。

GSEA富集分析結(jié)果顯示，硬皮病組排名前五位的通路包括氨基糖和核苷酸糖的代謝、溶酶體代謝、谷胱甘肽代謝、糖酵解糖質(zhì)新生、半乳糖代謝。自噬-溶酶體是重要的細(xì)胞內(nèi)自我降解系統(tǒng)，當(dāng)自噬功能紊亂時(shí)對(duì)炎癥疾病（感染、自身免疫和癌癥、代謝紊亂、神經(jīng)退行性變以及心血管和肝臟疾?。?3］）產(chǎn)生影響。研究［24］顯示自噬-溶酶體途徑與硬皮病硬化期皮膚纖維化密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，正常組排名前五位的通路包括自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、剪接體、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、凱格小細(xì)胞肺癌、T細(xì)胞受體信號(hào)通路。T細(xì)胞中Th17、Treg、Th2、Th9和Th22與硬皮病的纖維化病變密切相關(guān)［25］。

ICI結(jié)果顯示，與正常組比較，硬皮病組單核細(xì)胞顯著增多，而CD8+T細(xì)胞、靜息CD4+T細(xì)胞減少，提示CD8+T細(xì)胞在硬皮病發(fā)病過程發(fā)揮重要作用。研究［26］顯示，硬皮病患者外周血CD8+T細(xì)胞和活化/記憶性CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，與硬皮病的臨床亞型、進(jìn)展階段、器官受累以及毛細(xì)支氣管鏡評(píng)估的微血管異常有關(guān)。但是，目前關(guān)于硬皮病患者外周血中T細(xì)胞異常的證據(jù)仍是相互矛盾的，一些研究［27］顯示CD4+T和CD8+T細(xì)胞增加，另一些研究［28］則顯示CD4+T和CD8+T細(xì)胞降低，還有研究［29］顯示硬皮病患者和正常組之間沒有顯著差異，因此還需進(jìn)一步論證。

綜上所述，硬皮病發(fā)病可能是通過調(diào)節(jié)RPS27A、BTRC、FBXO32、ZBTB16、FBXO21、VHL、ATG7、CBLB、ANAPC1等基因，參與中性粒細(xì)胞活化參與免疫反應(yīng)、嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒等生物過程，上調(diào)氨基糖和核苷酸糖代謝、溶酶體代謝、谷胱甘肽代謝、糖酵解糖異生和半乳糖代謝等通路來實(shí)現(xiàn)的。硬皮病發(fā)病與單核細(xì)胞增多密切相關(guān)。本研究從生物信息學(xué)角度對(duì)硬皮病發(fā)病機(jī)制進(jìn)行探究，為今后臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，但存在樣本量少，未進(jìn)行細(xì)胞分子學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等不足之處，期待今后進(jìn)一步研究論證。