任秀芳，劉佳妹，亢野，關(guān)曉嬌，楊向紅

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽(yáng) 110004）

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，來(lái)源于神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，約占顱內(nèi)腫瘤的50%～60%，侵襲和復(fù)發(fā)率明顯高于其他顱內(nèi)腫瘤［1］。目前針對(duì)膠質(zhì)瘤的治療方式以最大安全范圍的手術(shù)為主，術(shù)后聯(lián)合放療和化療，但患者的預(yù)后很差［2］，中位生存期僅14.6個(gè)月［3］，5年生存率不足10%［4］。根據(jù)癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）基因表達(dá)數(shù)據(jù)，將膠質(zhì)瘤分為前神經(jīng)元亞型、神經(jīng)元亞型、經(jīng)典型和間質(zhì)亞型［5］。目前，膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制尚未明確，進(jìn)一步挖掘極具預(yù)后價(jià)值的關(guān)鍵基因?qū)槟z質(zhì)瘤的預(yù)后評(píng)估與治療提供潛在靶點(diǎn)。

腫瘤壞死因子受體超家族（tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF）10D，又稱腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體4（tumor necrosis factorrelated apoptosis inducing ligand-receptor 4，TRAIL-R4）或誘餌受體2（decoy receptor2，DcR2），作為TNFRSF的一員，通過(guò)與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）的結(jié)合和（或）與TRAIL-R1/-R2 的相互作用，負(fù)向調(diào)節(jié)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［6-7］。作為誘餌受體，TNFRSF10D可在細(xì)胞內(nèi)、外自主發(fā)揮作用，影響腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性［8］。目前，尚未見(jiàn)有關(guān)TNFRSF10D與膠質(zhì)瘤臨床病理特征及免疫微環(huán)境細(xì)胞之間的關(guān)系的報(bào)道。本研究擬利用生物信息學(xué)及免疫組織化學(xué)法探討TNFRSF10D基因表達(dá)與膠質(zhì)瘤組織病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系，及其在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中的作用。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

通過(guò)TCGA（https：//portal.gdc.cancer.gov/）和中國(guó)腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA，http：//www.cgga.org.cn/）下載RNA-Seq表達(dá)譜數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床信息。去除數(shù)據(jù)不完整的樣本，最終納入分析病例共 946例，其中CGGA 310例，TCGA 636例。

1.2 方法

1.2.1 評(píng)估不同膠質(zhì)瘤組織中TNFRSF10D的表達(dá)情況：在數(shù)據(jù)庫(kù)中收集數(shù)據(jù)，按世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分級(jí)、病理分型、TCGA分型及分子分型不同，比較TNFRSF10D的表達(dá)情況。

1.2.2 評(píng)估TNFRSF10D基因表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響：以中位數(shù)為界限，按照TNFRSF10D基因表達(dá)水平進(jìn)行分組，其中，≥TNFRSF10D中位表達(dá)水平者為高表達(dá)組，＜TNFRSF10D中位表達(dá)水平者為低表達(dá)組。用Kaplan-Meier 生存分析曲線及l(fā)og-rank檢驗(yàn)方法，比較2組的預(yù)后。通過(guò)Cox回歸分析進(jìn)一步檢測(cè)TNFRSF10D不同表達(dá)水平患者的預(yù)后情況。

1.2.3 基因本體（gene ontology，GO）分析和基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）：通過(guò)Metascape（http：//metascape.org/）進(jìn)行GO分析，選擇在CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中與TNFRSFI0D基因表達(dá)相關(guān)性＞0.4 的基因進(jìn)行GO分析。使用GSEA（http：//www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）確定TNFRSF10D不同表達(dá)水平患者間的差異表達(dá)基因是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用標(biāo)準(zhǔn)化富集得分（normalized enrichment score，NES）和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）確定統(tǒng)計(jì)顯著性。

1.2.4 評(píng)估TNFRSF10D在不同級(jí)別、免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和腫瘤純度膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況：在CGGA和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，分析不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中TNFRSF10D表達(dá)水平與免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和腫瘤純度的關(guān)系。

1.2.5 CIBERSORT算法分析免疫細(xì)胞構(gòu)成：將欲分析的膠質(zhì)瘤mRNA數(shù)據(jù)上傳至CIBERSORT（https：//cibersort.stanford.edu/），利用網(wǎng)頁(yè)分析工具進(jìn)行分析，獲得22種免疫細(xì)胞數(shù)據(jù)，過(guò)濾去除不符合要求的樣本后做可視化。進(jìn)而比較TNFRSF10D高表達(dá)組與低表達(dá)組免疫細(xì)胞的差異。

1.2.6 TNFRSF10D在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況：收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤石蠟標(biāo)本共60例，其中30例為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，30例為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。采用免疫組化SP法染色，比較TNFRSF10D在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和低級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況。石蠟標(biāo)本切片（厚度5 μm），烤片后經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，PBS反復(fù)沖洗，抗原修復(fù)，加入TNFRSF10D抗體（稀釋1 ∶400，中國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)16781-1-AP）孵育，DAB顯色。顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），TNFRSF10D的表達(dá)水平依據(jù)其在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)的染色情況判定。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：2022PS001K）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R語(yǔ)言4.0.1版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。采用Pearson相關(guān)分析評(píng)估不同指標(biāo)與TNFRSF10D表達(dá)的相關(guān)性。采用Student’st檢驗(yàn)行組間連續(xù)變量的比較，采用χ2檢驗(yàn)行組間率的比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TNFRSF10D表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度正相關(guān)關(guān)系

對(duì)CGGA及TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)收集的946例膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TNFRSF10D表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的增高而增高（圖1）。在不同WHO分型及病理分型膠質(zhì)瘤中，WHO Ⅳ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中TNFRSF10D表達(dá)水平最高。在不同TCGA分型膠質(zhì)瘤中，間質(zhì)型膠質(zhì)瘤TNFRSF10D表達(dá)明顯高于其他分型。在不同分子分型膠質(zhì)瘤中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤IDH野生型TNFRSF10D表達(dá)水平較高。說(shuō)明TNFRSF10D的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)（圖2）。

圖1 數(shù)據(jù)庫(kù)資料收集結(jié)果Fig.1 Database data collection

圖2 TNFRSF10D的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系Fig.2 The relationship between the expression of TNFRSF10D and the clinicopathological characteristics of glioma patients

2.2 TNFRSF10D的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果提示，在全級(jí)別膠質(zhì)瘤中，TNFRSF10D高表達(dá)的患者預(yù)后較差，這種差異在低級(jí)別膠質(zhì)瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中均存在（圖3）。單因素Cox回歸分析結(jié)果提示，TNFRSF10D可能是膠質(zhì)瘤的預(yù)后因素（表1）。以上結(jié)果提示TNFRSF10D高表達(dá)可導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后。

表1 膠質(zhì)瘤患者臨床特征和TNFRSF10D基因表達(dá)水平對(duì)預(yù)后影響的 Cox 回歸分析Tab.1 Cox regression analysis of clinical characteristics and TNFRSF10D gene expression level on prognosis of glioma patients

圖3 TNFRSF10D的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系Fig.3 The relationship between the expression of TNFRSF10D and the prognosis of glioma patients

2.3 TNFRSF10D相關(guān)的GSEA富集分析

選擇在CGGA數(shù)據(jù)庫(kù)中與TNFRSF10D基因表達(dá)相關(guān)性0.4以上的基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)TNFRSF10D與多種免疫相關(guān)通路關(guān)系密切（圖4）。GSEA進(jìn)一步證實(shí)，CGGA和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中TNFRSF10D高表達(dá)患者的免疫相關(guān)基因呈高活化狀態(tài)（圖5）。說(shuō)明TNFRSF10D可影響膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的免疫過(guò)程。

圖4 TNFRSF10D與多種免疫相關(guān)通路關(guān)系密切Fig.4 TNFRSF10D is closely related to multiple immune-related pathways

圖5 高表達(dá)TNFRSF10D的患者中高活化狀態(tài)的免疫相關(guān)基因Fig.5 Immune-related genes with high activation status in patients with high TNFRSF10D expression

2.4 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中TNFRSF10D表達(dá)水平與免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和腫瘤純度的關(guān)系

為了進(jìn)一步探究TNFRSF10D表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境內(nèi)細(xì)胞構(gòu)成的影響，本研究對(duì)比分析了不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中TNFRSF10D高、低表達(dá)組的免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分及腫瘤純度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNFRSF10D高表達(dá)組免疫評(píng)分及基質(zhì)評(píng)分均升高，而腫瘤純度降低，且這種趨勢(shì)在不同級(jí)別內(nèi)均存在。說(shuō)明TNFRSF10D的表達(dá)水平可影響膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境中免疫細(xì)胞的構(gòu)成。

2.5 腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞構(gòu)成分析

用CIBERSORT算法對(duì)膠質(zhì)瘤腫瘤內(nèi)22種免疫細(xì)胞構(gòu)成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TNFRSF10D的表達(dá)與巨噬細(xì)胞的富集具有較強(qiáng)的相關(guān)性，說(shuō)明其可能對(duì)巨噬細(xì)胞的影響最多。

2.6 免疫組化結(jié)果

免疫組化染色結(jié)果顯示，TNFRSF10D定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。與低級(jí)別膠質(zhì)瘤相比，TNFRSF10D在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈高表達(dá)（圖6）。

圖6 TNFRSF10D在低級(jí)別膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況 SP法×200Fig.6 Expression of TNFRSF10D in low-grade gliomas and glioblastoma SP ×200

3 討論

TRAIL/Apo2L是腫瘤壞死因子超家族（tumor necrosis factor superfamily，TNFSF）的成員之一。TNFSF的成員通過(guò)其相應(yīng)的TNFRSF發(fā)出信號(hào)［9］。TRAIL可以選擇性地誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，因此成為一種潛在的癌癥治療方法。TNFRSF10D作為TRAIL的一種誘餌受體，參與致癌作用信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與分化［10］。目前，TNFRSF10D已被認(rèn)為是癌癥中TRAIL抗性的一種機(jī)制，如在結(jié)直腸癌細(xì)胞株、宮頸癌及淋巴瘤組織中TNFRSF10D高表達(dá)與對(duì)靶向TRAIL通路治療的抗性有關(guān)［11-12］。TNFRSF10D除能抑制TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，還可誘導(dǎo)非凋亡信號(hào)通路，如核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和蛋白激酶（protein kinase，AKT），從而發(fā)揮其促腫瘤功能［13-14］。因此，本研究對(duì)TNFRSF10D在膠質(zhì)瘤中產(chǎn)生的影響進(jìn)行了探討。

由于大腦獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征和免疫微環(huán)境，為腦腫瘤的治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。腦腫瘤免疫微環(huán)境（tumor immune microenvironment，TME）由不同細(xì)胞組成，包括成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞等。而在眾多免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞最為豐富［15］。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）在腫瘤刺激下可產(chǎn)生免疫抑制，從而維持基因不穩(wěn)定性，支持癌癥干細(xì)胞，促進(jìn)上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，并通過(guò)免疫檢查點(diǎn)配體的表達(dá)抑制適應(yīng)性免疫，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和T細(xì)胞凋亡，且癌癥干細(xì)胞可為TAMs促進(jìn)腫瘤發(fā)生提供關(guān)鍵促腫瘤信號(hào)［16-17］。由于TAMs主要來(lái)源于骨髓單核細(xì)胞，小鼠的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤模型研究［18］發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可募集單核細(xì)胞釋放的炎癥信號(hào)，并分化為TAMs，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。然而，在胰腺癌和膠質(zhì)瘤中，TAMs也可源自胚胎階段卵黃囊發(fā)育的紅細(xì)胞-髓樣祖細(xì)胞，TME會(huì)促進(jìn)這些祖細(xì)胞分化為新的腫瘤相關(guān)表型，但通常是促腫瘤表型［19-20］。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，膠質(zhì)瘤干細(xì)胞通過(guò)TAMs分泌的骨膜蛋白，從外周血募集單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)M2型TAM極化，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性生物學(xué)行為的發(fā)生［21-22］。

本研究首次在膠質(zhì)瘤患者隊(duì)列中分析了TNFRSF10D基因的表達(dá)，利用臨床信息和 RNA測(cè)序數(shù)據(jù)研究了TNFRSF10D基因表達(dá)與膠質(zhì)瘤分級(jí)預(yù)后的關(guān)系，并分析了TNFRSF10D基因表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性，及其對(duì)膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境細(xì)胞構(gòu)成的影響。

本研究結(jié)果顯示，TNFRSR10D基因的表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤級(jí)別增高而增高（P＜0.000 1），在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)水平最高。生存分析結(jié)果表明，TNFRSF10D基因的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后有關(guān)，TNFRSF10D高表達(dá)患者的預(yù)后不良。單因素Cox回歸分析顯示，TNFRSF10D基因表達(dá)水平是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=1.214/1.001，P＜0.000 1）。

本研究還發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤組織中TNFRSF10D基因表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)，與免疫評(píng)分及基質(zhì)評(píng)分呈正相關(guān)。膠質(zhì)瘤的特點(diǎn)是高度的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，精準(zhǔn)的免疫治療至關(guān)重要，尋找合適的靶標(biāo)非常關(guān)鍵。TAMs是TME中最豐富的免疫細(xì)胞，可占腫瘤實(shí)體的50%［23］，參與惡性腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。TAMs作為TME中最關(guān)鍵的先天性免疫細(xì)胞，通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、炎癥底物和蛋白水解酶，在調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、血管形成、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、抗腫瘤適應(yīng)性免疫等方面發(fā)揮重要作用［24］。本研究還發(fā)現(xiàn)TNFRSF10D的表達(dá)與巨噬細(xì)胞的富集呈較強(qiáng)的相關(guān)性，說(shuō)明其有可能成為腫瘤免疫治療潛在的生物標(biāo)志物。

綜上所述，TNFRSF10D表達(dá)水平是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。TNFRSF10D表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)，是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的指標(biāo)，可影響膠質(zhì)瘤的免疫過(guò)程及免疫微環(huán)境內(nèi)的細(xì)胞構(gòu)成，尤其是巨噬細(xì)胞。TNFRSF10D作為膠質(zhì)瘤患者的獨(dú)立預(yù)后因素，有可能成為未來(lái)膠質(zhì)瘤免疫治療的一個(gè)新方向。