盧萌，鄭陽，王曉明

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，沈陽 110004）

缺氧缺血性腦損傷早期可通過自由基的產(chǎn)生激發(fā)炎癥或氧化應(yīng)激反應(yīng)［1］。缺氧缺血后，活性氧（reactive oxygen species，ROS）迅速增加，過量的ROS直接作用于細(xì)胞大分子，導(dǎo)致級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)和蛋白酶分泌。這些衍生物參與了多種途徑（炎癥、凋亡、自噬和壞死）的復(fù)雜相互作用，最終導(dǎo)致腦損傷［2］。

神經(jīng)細(xì)胞中鈉鉀ATP酶是維持細(xì)胞功能必不可少的跨膜蛋白，直接調(diào)節(jié)并維持細(xì)胞內(nèi)外Na+、K+離子濃度，間接影響Ca2+、Cl-等離子濃度以維持膜電位，對神經(jīng)元的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控具有重大意義［3］。鈉鉀ATP酶活性改變是缺氧的最早反應(yīng)，對細(xì)胞存活至關(guān)重要［4］。鈉鉀ATP酶還作為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，激活多種信號(hào)通路（鈉鉀ATP酶與Src形成的復(fù)合物及其關(guān)聯(lián)的下游多種通路［5］）介導(dǎo)細(xì)胞損傷，并與Beclin-1共同介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［6］。因此，保持鈉鉀ATP酶活性對于神經(jīng)元的功能及存活至關(guān)重要。有研究［7］表明，CaMKⅡ作為RIP3等的底物介導(dǎo)心肌缺血和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌壞死。此外CaMKⅡ與瞬時(shí)受體電位M7通道、p38、cofflin等共同介導(dǎo)細(xì)胞死亡［8］；與鈉鉀ATP酶相似，CaMKⅡ通過Beclin-1介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］。除此之外，研究［10］顯示，腦內(nèi)CaMKⅡ和N-甲基-D天冬氨酸受體、代謝型谷氨酸受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體等共同參與長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)的過程，影響大腦學(xué)習(xí)與記憶的功能。因此推測缺氧缺血性腦病中CaMKⅡ?qū)δX內(nèi)神經(jīng)元的存活和功能維持發(fā)揮重要作用。本研究通過建立新生豬缺氧缺血性腦損傷模型，探討缺氧缺血損傷對新生豬腦內(nèi)鈉鉀ATP酶、CaMKⅡ表達(dá)的影響，旨在為闡明新生兒缺氧缺血性腦損傷后離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

28頭3～5日齡雄性約克夏豬由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物室提供，體質(zhì)量1～1.5 kg。隨機(jī)分為對照組（n=4）及模型組（（n=24）。模型組根據(jù)缺血缺氧時(shí)間均分成6個(gè)亞組：0～2 h組、2～6 h組；6～12 h組、12～24 h組、24～48 h組、48～72 h組，每組4頭。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 動(dòng)物模型制備

動(dòng)物模型的制備參照本課題組既往研究［11］。

1.2.1 對照組：室溫保持在28～30 ℃，于新生豬臀大肌緩慢注入速眠新注射液（0.6 mL/kg）麻醉。麻醉后觀察新生豬生理狀態(tài)，當(dāng)新生豬活動(dòng)度明顯減低時(shí)，以干凈棉簽輕觸角膜外緣，確定角膜反應(yīng)遲鈍后，將新生豬以仰臥位固定。首先，在喉鏡引導(dǎo)下以2.5 mm氣管插管對新生豬進(jìn)行機(jī)械通氣，通入100%氧氣，呼吸機(jī)通氣參數(shù)值設(shè)置為呼吸比1 ∶1.5，呼吸頻率30 次/min。監(jiān)測新生豬的心率和血氧飽和度。固定氣管插管，對新生豬頸前區(qū)及周圍皮膚進(jìn)行消毒，取頸正中切口，逐層分離，將雙側(cè)頸總動(dòng)脈與毗鄰的頸內(nèi)靜脈、迷走神經(jīng)分離，40 min后縫合切口。

1.2.2 模型組：麻醉、機(jī)械通氣及頸總動(dòng)脈分離操作與對照組相同。隨后進(jìn)行缺氧缺血損傷建立：小動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈（注意避開頸動(dòng)脈竇），阻斷雙側(cè)頸動(dòng)脈血流，與此同時(shí)機(jī)械通入6%氮氧混合氣，持續(xù)40 min。隨后撤去動(dòng)脈夾，恢復(fù)雙側(cè)頸動(dòng)脈血流，機(jī)械通氣改為100%氧氣，縫合切口。在新生豬恢復(fù)自主呼吸后停止機(jī)械通氣，拔出氣管插管。缺氧缺血損傷建立過程中密切監(jiān)控新生豬生命狀態(tài)（血氧、心率等）。若術(shù)中發(fā)現(xiàn)心率明顯降低或抽搐等預(yù)示新生豬生命狀況不良狀況應(yīng)暫時(shí)中斷手術(shù)，及時(shí)處理。術(shù)后將新生豬轉(zhuǎn)移至35 ℃恒溫箱內(nèi)。

1.3 免疫熒光染色及圖像處理

對照組在縫合切口后即處死新生豬，模型組各亞組 按照缺氧缺血時(shí)間（＞0～2 h、＞2～6 h、＞6～12 h、＞12～24 h、＞24～48 h、＞48～72 h）分別處死新生豬，然后立即取出完整腦組織，置于4%多聚甲醛中固定48 h。將固定后的腦組織冠狀切片（4 mm），然后經(jīng)脫水、二甲苯透明，石臘包埋后切片（4 μm）。隨后對切片進(jìn)行鈉鉀ATP酶及CaMKⅡ免疫熒光染色，切片脫蠟后對切片進(jìn)行3次PBS溶液洗滌，每次5 min，隨后將切片置入微波爐中檸檬酸鹽修復(fù)（高火 7.5 min，靜置30 min），取出切片自然冷卻至室溫，再次進(jìn)行5 min×3次PBS溶液洗滌。擦干切片后山羊血清封閉40 min，完成后甩去多余血清。一抗使用PBS稀釋；切片分組滴加一抗，完成后4 ℃過夜（16 h）；次日取出切片放置30 min使切片恢復(fù)至室溫。使用PBS溶液洗滌5 min×3次。避光條件下滴加熒光二抗（1 ∶100），室溫狀態(tài)下孵育4 h。PBS溶液洗滌切片5 min×3次。避光條件下滴加含DAPI的封片液，室溫孵育5 min后封片。

每張切片光鏡下（400倍）隨機(jī)取相互不重疊的4～6個(gè)視野，采用NIKON圖像采集系統(tǒng)照相。細(xì)胞染色呈綠色、DAPI核染色為陽性表達(dá)（除外血管內(nèi)血細(xì)胞染色），應(yīng)用Image J進(jìn)行免疫熒光染色分析，鈉鉀ATP酶、CaMKⅡ的表達(dá)采用圖片陽性面積/圖片總面積×100%來表示。表達(dá)結(jié)果由2位主治醫(yī)師共同判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組鈉鉀ATP酶表達(dá)比較

結(jié)果顯示，各組均見鈉鉀ATP酶陽性表達(dá)，6～12 h組表達(dá)水平最低。相鄰各組兩兩比較結(jié)果顯示，0～2 h組與2～6 h組（P=0.015）、2～6 h組與6～12 h組（P=0.008）、6～12 h組 與12～24 h組（P＜0.001）、12～24 h組與24～48 h組（P=0.014）鈉鉀ATP酶表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著時(shí)間的推移，缺氧缺血損傷模型新生豬鈉鉀ATP酶表達(dá)呈現(xiàn)先下降后上升然后繼續(xù)下降的“橫S型”趨勢。見圖1、表1。

表1 各組鈉鉀ATP酶及CaMKⅡ表達(dá)比較Tab.1 Comparison of Na+，K+-ATPase and CaMKⅡ expression in each group

圖1 各組鈉鉀ATP酶免疫熒光染色結(jié)果 ×400Fig.1 Results of Na+，K+-ATPase expression in each group by immunofluorescent staining ×400

2.2 各組CaMKⅡ表達(dá)水平比較

結(jié)果顯示，各組均見CaMKⅡ陽性表達(dá)，6～12 h組降至最低水平。0～2 h組與2～6 h組（P=0.012）、2～6 h組與6～12 h組（P＜0.001）、6～12 h組與12～24 h組（P＜0.001）、24～48 h組與48～72 h組（P=0.009）CaMKⅡ表達(dá)水平比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著時(shí)間的推移，缺氧缺血模型新生豬CaMKⅡ表達(dá)呈“雙谷雙峰”改變，見表1、圖2。

圖2 各組 CaMKⅡ免疫熒光染色結(jié)果 ×400Fig.2 Results of CaMKⅡ expression in each group by immunofluorescent staining ×400

鈉鉀ATP酶及CaMKⅡ表達(dá)水平均在6～12 h組最低，提示在此段時(shí)間內(nèi)腦損傷最重。

3 討論

研究［12］顯示，神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元膜電位的維持至關(guān)重要。鈉鉀ATP酶失活則離子轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)［13］，可引起膜電位紊亂、細(xì)胞腫脹，從而造成神經(jīng)元功能維持障礙，甚至不可逆地觸發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，缺氧缺血后鈉鉀ATP酶表達(dá)不是立即下降至最低，而是在缺氧缺血后6～12 h達(dá)到最低。目前腦缺氧缺血損傷治療大多要求在出現(xiàn)缺氧缺血后6 h內(nèi)進(jìn)行亞低溫治療［14］，但在腦組織開始出現(xiàn)缺氧缺血到機(jī)體表現(xiàn)出缺氧缺血癥狀尚且需要一定時(shí)間。本研究結(jié)果表明鈉鉀ATP酶表達(dá)在缺氧缺血早期未出現(xiàn)明顯下降，如果能在這段時(shí)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)缺氧缺血并實(shí)施治療，則能更好保護(hù)神經(jīng)元功能。因此需要對如何在更細(xì)微的層面上做出診斷進(jìn)行深入研究［15］。

本研究結(jié)果顯示，缺氧缺血損傷后12～24 h組鈉鉀ATP酶表達(dá)水平較6～12 h組明顯增高（P＜0.05），與對照組鈉鉀ATP酶表達(dá)水平未見明顯差異（P＞ 0.05），提示此時(shí)細(xì)胞功能恢復(fù)，其原因可能是此時(shí)血氧再灌注、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成增加所致。而后鈉鉀ATP酶表達(dá)降低，可能是能量不足以支持高水平的物質(zhì)合成所致，具體原因尚待進(jìn)一步研究。鈉鉀ATP酶表達(dá)越高則表明細(xì)胞活性越高，但是本研究并未區(qū)分神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，無法判斷鈉鉀ATP酶表達(dá)升高來自于神經(jīng)元抑或是膠質(zhì)細(xì)胞，需進(jìn)一步研究論證。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可通過不同亞型來區(qū)分鈉鉀ATP酶，α2亞型主要在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，α3則具有神經(jīng)特異性［16］。

本研究結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，缺氧缺血腦損傷的新生豬CaMKⅡ表達(dá)呈“雙谷雙峰”改變。與對照組比較，缺氧缺血2～6 h 組CaMKⅡ表達(dá)增高。CaMKⅡ是多個(gè)程序性死亡的節(jié)點(diǎn)信號(hào)［17］，缺氧缺血損傷后ROS作為損傷因子之一，在Ca2+激活CaMKⅡ之后進(jìn)一步增加了CaMKⅡ的活性［18］；但同時(shí)有研究［19］表明，在缺血再灌注的過程中CaMKⅡ δ亞基的過表達(dá)促進(jìn)了神經(jīng)元的存活，2～6 h組CaMKⅡ表達(dá)呈現(xiàn)出高值，推測是神經(jīng)元自我保護(hù)的表現(xiàn)，可以作為較佳的干預(yù)節(jié)點(diǎn)。此外，本研究結(jié)果顯示，12～48 h 2組CaMKⅡ表達(dá)逐漸增加，而在48～72 h組CaMKⅡ表達(dá)下降，分析其原因可能是新生豬的喂養(yǎng)條件有限，使新生豬糖分、鹽分及水分?jǐn)z入不足所致。

有研究［20］表明，不同時(shí)段出生（早產(chǎn)、正常）的新生兒血管成熟程度、線粒體功能狀態(tài)不同，意味著缺氧缺血時(shí)早產(chǎn)兒的血管調(diào)節(jié)功能不良，同時(shí)早產(chǎn)兒和正常新生兒腦血管分布狀況不同，提示應(yīng)對早產(chǎn)兒進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本研究利用免疫熒光來分析新生豬缺氧缺血腦損傷后不同時(shí)間鈉鉀ATP酶及CaMKⅡ的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)鈉鉀ATP酶表達(dá)在缺氧缺血腦損傷后6～12 h內(nèi)最低，隨著時(shí)間的推移鈉鉀ATP酶表達(dá)呈“橫S型”；CaMKⅡ表達(dá)在缺氧缺血腦損傷后2～6 h最高，隨著時(shí)間的推移CaMKⅡ表達(dá)呈 “雙谷雙峰”樣改變。本研究對明確缺氧缺血性中樞神經(jīng)損傷后病理改變具有一定意義，但本研究未對新生豬腦進(jìn)行分區(qū)，且樣本量較小，今后應(yīng)進(jìn)一步研究論證。