于 淼，楊 林，李偉靜，宋 宇，王玉輝，王 旭，鄭亮亮，宋玉國，

(1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013；3.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

血液中的單核細(xì)胞(Monocyte)來源于髓系前體細(xì)胞，既是機(jī)體固有免疫的重要組成細(xì)胞，又是一類重要的抗原提呈細(xì)胞，在特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用.有研究[1]發(fā)現(xiàn)：單核細(xì)胞是存在高度異質(zhì)性的細(xì)胞群體，發(fā)揮不同作用的細(xì)胞其表面標(biāo)志是不完全相同的.CD14分子是單核細(xì)胞表面重要的分化抗原，表達(dá)于成熟單核細(xì)胞表面；CD16分子是單核細(xì)胞表面Fc受體的一個亞類(FcγRⅢ).根據(jù)CD14和CD16表達(dá)強(qiáng)度的不同，可將單核細(xì)胞分為經(jīng)典型單核細(xì)胞(CD14brightCD16-)、中間型單核細(xì)胞(CD14brightCD16+)和非經(jīng)典型單核細(xì)胞(CD14dimCD16+)[1].本研究應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞技術(shù)，建立了單核細(xì)胞亞型檢測方法，重點(diǎn)探討檢測CD16+單核細(xì)胞的臨床應(yīng)用價值，并應(yīng)用在常見的自身免疫病——強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spond- ylitis，AS)患者的診治中.AS是脊柱關(guān)節(jié)炎(Spondy- loarthritis，SpA)中常見的臨床疾病類型，AS的致病因素較多，自身免疫功能紊亂是介導(dǎo)AS發(fā)病的重要因素，外周血單核細(xì)胞亞型及其相關(guān)細(xì)胞因子參與其發(fā)病過程[2-3].其中，CD16+單核細(xì)胞(包括CD14brightCD16+和CD14dimCD16+單核細(xì)胞)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)[4-7]、人類炎癥性腸病(IBD)[8]、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)[9]以及銀屑病性關(guān)節(jié)炎(PsA)[10]等許多自身免疫性疾病的進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用.單核細(xì)胞亞型檢測僅僅是對細(xì)胞表型進(jìn)行檢測分析，其具體作用機(jī)制要通過表達(dá)細(xì)胞因子等方面進(jìn)行功能分析.本研究應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)同步檢測了血漿相關(guān)細(xì)胞因子，并進(jìn)行了初步相關(guān)性分析.

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 研究對象

選擇2018年10月—2020年10月北華大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科強(qiáng)直性脊柱炎患者50例(AS組)，其中，男35例，女15例，男女比為7∶3；年齡21～74歲，平均(43.24±15.01)歲.AS診斷是基于修改后的紐約標(biāo)準(zhǔn)[11]，AS患者通過流式細(xì)胞分析儀(FCM)檢測HLA-B27[12]為陽性.健康對照組40例，來自北華大學(xué)附屬醫(yī)院健康檢查中心，其中，男26例，女14例，男女比13∶7，年齡21～79歲，平均(45.15±18.17)歲，經(jīng)FCM檢測HLA-B27為陰性.AS組和對照組在年齡、性別和其他自然條件上具有可比性，招募患者的臨床特征在組間無任何基線差異.

1.1.2 主要儀器和試劑

流式細(xì)胞儀(NAVIOS型，貝克曼庫爾特公司，美國)；熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD14-PE、CD16-FITC和HLA-DR-PEcy5(貝克曼庫爾特公司，美國)；人血漿細(xì)胞因子TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN -γ檢測試劑盒(深圳唯公生物科技有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)本采集

采用EDTA-K2抗凝真空采血管采集靜脈血2 mL.取抗凝全血100 μL用于流式細(xì)胞技術(shù)檢測單核細(xì)胞亞型；其余全血3 000 r/min離心10 min，分離上層血漿用于細(xì)胞因子檢測.

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD16+單核細(xì)胞及相關(guān)亞型

將10 μL CD14-PE和10 μL CD16-FITC標(biāo)記的單克隆抗體加入流式細(xì)胞儀專用試管中，再加入100 μL抗凝全血，室溫避光標(biāo)記15 min，再將紅細(xì)胞溶解，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測.以CD16-FITC為橫坐標(biāo)、CD14-PE為縱坐標(biāo)建立流式細(xì)胞儀檢測方案，檢測并記錄經(jīng)典型單核細(xì)胞(CD14brightCD16-)、中間型單核細(xì)胞(CD14brightCD16+)和非經(jīng)典型單核細(xì)胞(CD14dimCD16+)的百分率，重點(diǎn)分析后兩者CD16+單核細(xì)胞的變化情況.

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)定量檢測血漿相關(guān)細(xì)胞因子含量

定量校準(zhǔn)品制備：準(zhǔn)備8個1.5 mL離心管作為校準(zhǔn)品梯度管，標(biāo)記編號0～7；7號管留空，1號管中加入50 μL緩沖液，其他6管中加入150 μL緩沖液.向校準(zhǔn)品瓶中加入0.5 mL緩沖液，充分溶解混勻并轉(zhuǎn)移至7號管，為最高濃度校準(zhǔn)液；取50 μL 7號管中的校準(zhǔn)品溶液至6號管中混勻，即為1∶4稀釋校準(zhǔn)液，隨后依次從6～2號管中取50 μL校準(zhǔn)品溶液至下一校準(zhǔn)品梯度管，依次梯度稀釋得到5～1號管校準(zhǔn)液；0號管中的緩沖液作為0濃度校準(zhǔn)液.

細(xì)胞因子檢測：離心管中加入50 μL捕獲微球懸液(加入前充分混勻)、50 μL 樣本或校準(zhǔn)液，充分混勻，避光室溫孵育1 h；磁性分離捕獲微球并棄去上清液，加入100 μL熒光標(biāo)記抗體工作液，充分混勻，室溫避光孵育1 h；磁分離去上清，用200 μL磁珠稀釋液洗滌微球；再次磁分離去上清，用200 μL磁珠稀釋液重懸微球；最后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組血漿TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A和IFN-γ水平.

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 CD16+單核細(xì)胞及相關(guān)亞型檢測結(jié)果

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測AS組(50例)、健康對照組(40例)患者外周血中3種亞型單核細(xì)胞的百分率.以SS INT為橫坐標(biāo)、FS INT為縱坐標(biāo)建立坐標(biāo)圖，結(jié)果見圖1，圖中C門內(nèi)的細(xì)胞為單核細(xì)胞；以CD16-FITC為橫坐標(biāo)、CD14-PE為縱坐標(biāo)建立坐標(biāo)圖，結(jié)果見圖2.結(jié)果顯示：AS組CD16+單核細(xì)胞(CD14brightCD16+，CD14dimCD16+)百分率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)典型單核細(xì)胞(CD14brightCD16-)百分率低于對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見圖3.圖1和圖2中的粗點(diǎn)是用低概率方法處理后而顯示的散點(diǎn)圖，便于觀察.

圖1單核細(xì)胞群(C門)分析單核細(xì)胞亞型 Fig.1A monocyte population (phylum C) was selected for analysisN門.經(jīng)典型單核細(xì)胞;O門.中間型單核細(xì)胞;P門.非經(jīng)典型單核細(xì)胞.圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測單核細(xì)胞亞型Fig.2Monocyte subtypes detected by flow cytometry

*.P<0.05，***.P<0.001.

2.2 檢測AS組和正常對照組血漿細(xì)胞因子水平

利用多參數(shù)流式細(xì)胞儀對兩組外周血細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：AS組外周血5種細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17A和IFN-γ)水平均高于對照組(P<0.05)，且AS組TNF-α、IL-6、IFN-γ水平顯著高于對照組(P<0.01)，結(jié)果見圖4.IL-2、IL-4在兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異，故結(jié)果未進(jìn)行展示.

*.P<0.05，***.P<0.001.圖4AS組與對照組細(xì)胞因子Fig.4Cytokines in AS group and control group

2.3 AS組CD16+單核細(xì)胞百分率與3種細(xì)胞因子水平的相關(guān)性

Pearson相關(guān)檢驗結(jié)果顯示：AS患者外周血CD16+單核細(xì)胞(CD14brightCD16+和CD14dimCD16+)百分率與血漿細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-17A 的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.415 1、0.601 1和0.163 1 (P<0.01)，結(jié)果見圖5.

圖5細(xì)胞因子含量與CD16+單核細(xì)胞百分率的線性關(guān)系Fig.5Linear relationship between cytokine content and percentage of CD16+ monocytes

3 討 論

單核細(xì)胞作為一種重要的免疫細(xì)胞，在AS等自身免疫性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用.單核細(xì)胞具有明顯的異質(zhì)性，根據(jù)其表面標(biāo)記CD14和CD16表達(dá)量不同可分為經(jīng)典型單核細(xì)胞(CD14brightCD16-)、中間型單核細(xì)胞(CD14brightCD16+)和非經(jīng)典型單核細(xì)胞(CD14dimCD16+)[1，13-14]，不同亞型單核細(xì)胞在表型、功能及炎癥激活作用上均有顯著的差異.有研究[15]表明：成熟巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平的CD16，而表達(dá)低水平CD14，這個現(xiàn)象可使其與CD14bright單核細(xì)胞加以區(qū)分，進(jìn)一步表明CD16+單核細(xì)胞比CD14bright單核細(xì)胞更成熟.

本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測AS患者外周血單核細(xì)胞亞型的百分率，重點(diǎn)研究CD16+單核細(xì)胞的變化情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與健康對照組比較，AS患者CD16+單核細(xì)胞(CD14brightCD16+和CD14dimCD16+)的百分率明顯升高.經(jīng)典的單核細(xì)胞池向CD16+單核細(xì)胞傾斜，分化的刺激因子主要是M-CSF[16-17]，進(jìn)一步表明CD16+單核細(xì)胞在自身免疫性疾病中具有重要作用.

有研究[18]表明：CD16+單核細(xì)胞在多種自身免疫和感染性疾病的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、肺結(jié)核等.KAWANAKA N等[19]報道單核細(xì)胞亞群CD16表達(dá)升高是自身免疫性疾病和活躍性疾病狀態(tài)的特征.MELGERT BN等[20]研究表明：子癇前期患者外周血中經(jīng)典型單核細(xì)胞比例下降，CD16+單核細(xì)胞比例上升.對其他一些炎癥性疾病的研究[21]也證實了CD16+單核細(xì)胞在各種自身免疫性疾病過程中發(fā)揮重要作用，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、川崎病、感染性休克、多發(fā)性硬化、Ⅰ型糖尿病等.因此，我們推測CD16+單核細(xì)胞百分率升高可能是自身免疫性疾病和感染性疾病的共同現(xiàn)象.

為探究AS患者CD16+單核細(xì)胞百分率上調(diào)的具體作用機(jī)制，本研究應(yīng)用流式熒光技術(shù)同步對兩組血漿樣本中細(xì)胞因子含量進(jìn)行了檢測.本研究結(jié)果顯示：與健康對照組比較，AS組患者血漿炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17A和IFN -γ)的含量升高(P<0.05)，其中，以TNF-α、IL-6和IL-17A上調(diào)更為明顯(P<0.01).對所得結(jié)果進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗分析，結(jié)果顯示：AS患者外周血CD16+單核細(xì)胞百分率與血漿細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-17A 的表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R)分別為0.415 1、0.601 1和0.163 1 (P<0.01).提示AS患者CD16+單核細(xì)胞百分率的上調(diào)可促進(jìn)相關(guān)炎癥細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)一步加重了AS患者的炎癥反應(yīng).

綜上所述，本研究表明：CD16+單核細(xì)胞百分率在AS患者中顯著上調(diào)，且與AS患者異常的部分細(xì)胞因子的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，表明CD16+單核細(xì)胞可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)參與疾病的發(fā)生和發(fā)展，此結(jié)果為AS提供了一個免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的新觀點(diǎn)，未來針對AS患者CD16+單核細(xì)胞的檢測可能成為其疾病診斷的新指標(biāo).然而，本研究尚未闡明CD16+單核細(xì)胞調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的具體機(jī)制，未來將通過動物模型和體外實驗進(jìn)一步闡明其具體機(jī)制，為其在臨床疾病監(jiān)測中的應(yīng)用提供更加科學(xué)的依據(jù).