俞方毅，寧波，葉勁超，梁一鳴，陳家祥，許智蕾

（廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院 神經(jīng)外科，廣東 廣州 510220）

腦膠質(zhì)瘤是最常見的成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤，目前研究［1］表明大量miRNA與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而miRNA－221在多種腫瘤的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是腫瘤相關(guān)的關(guān)鍵miRNA之一。本研究通過檢測miRNA－221在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及通過沉默miRNA－221，探討其對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為腦膠質(zhì)瘤的診治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年至2019年術(shù)后病理證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤和瘤周組織35例手術(shù)標(biāo)本。其中男性19例，女性16例，年齡（54.13±5.78）歲。

1.2 qRT-PC檢測Trizol法提取組織細(xì)胞RNA。miRNA－221基因引物上游下游分別為：5＇－AAAAAAAAAAGCCCGCAGC TA CATTGTCTGCTG－3＇，5＇－AAAAAAAAAAG T GCAGGGTCCGAGGT－3＇。內(nèi)參GAPDH引物上游下游分別為：5＇－TGACTTCAACAGCGACACCCA－3＇；5＇－CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA－3＇。檢測腦膠質(zhì)瘤組織和瘤旁組織的miRNA－221表達(dá)水平。

1.3 細(xì)胞克隆形成、凋亡、周期檢測構(gòu)建miRNA－221沉默的腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，miRNA－221干擾效率采用qRT－PCR檢測，兩組細(xì)胞分別采用培養(yǎng)板以實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔為基礎(chǔ)，接種細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、換液、洗滌、固定后進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Student＇s t檢驗(yàn)。所有分析均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR NA-221在腦膠質(zhì)瘤組織和瘤旁組織的表達(dá)qRT－PCR檢測35例腦膠質(zhì)瘤組織及相應(yīng)瘤旁組織顯示，miR NA－221在腦膠質(zhì)瘤組織的表達(dá)水平高于瘤周組織（P＜0.05）。見圖1。

圖1 腦膠質(zhì)瘤組織和瘤旁組織中的miRNA-221表達(dá)水平

2.2 miRNA-221的干擾效率白色熒光和熒光顯微鏡下U251－miRNA－221組和U251－miRNA－221沉默組的慢病毒感染效率均高于80%，且兩組細(xì)胞生長良好，未見明顯細(xì)胞毒性作用，提示慢病毒感染效果良好。qRT－PCR檢測結(jié)果顯示，U251－miRNA－221沉默組中miRNA－221表達(dá)水平僅為U251－miRNA－221組的29.13%，明顯低于U251－miRNA－221組（P＜0.05），提示miRNA－221沉默的腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系構(gòu)建成功，可用于下一步細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。

2.3 miRNA-221沉默對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖能力的影響細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，慢病毒感染后，U251－miRNA－221沉默組的腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞形成的克隆數(shù)量明顯少于U251－miRNA－221組（P＜0.05），提示沉默miRNA－221可抑制腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖。見圖2。

圖2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 miRNA-221沉默對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，miRNA－221沉默后，U251－miRNA－221沉默組的細(xì)胞凋亡率高于U251－miRNA－221組（P＜0.05），提示miRNA－221沉默可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡。見圖3。

圖3 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

2.5 miRNA-221沉默對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞檢測顯示，miRNA－221沉默后，兩組細(xì)胞的G1、S和G2／M期細(xì)胞比例比較無明顯差異（P＞0.05），提示miRNA－221沉默對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞周期無明顯影響。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤為顱內(nèi)常見腫瘤，發(fā)病機(jī)制不明，與等位基因雜合缺失、遺傳性變異、細(xì)胞信號(hào)通路異常、功能性紊亂及DNA損傷修復(fù)干細(xì)胞等相關(guān)［2］。本研究以慢病毒介導(dǎo)的小干擾RNA沉默人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞miRNA－221的表達(dá)，觀察miRNA－221對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和凋亡的影響。本研究采用qRT－PC技術(shù)分別檢測miRNA－221在腦膠質(zhì)瘤組織和瘤旁組織的表達(dá)，結(jié)果顯示miRNA－221在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平高于瘤旁組織；熒光顯微鏡下U251細(xì)胞的熒光染色情況顯示，兩組慢病毒感染效率均高于80%，提示慢病毒感染效果良好；qRT－PCR檢測結(jié)果也顯示，miRNA－221沉默后miRNA－221表達(dá)水平明顯下降，提示miRNA－221沉默的腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系構(gòu)建成功。本研究采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測U251細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示miR－221沉默可抑制腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖。范崇桂等［3］在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中采用抑制劑沉默miRNA－221表達(dá)，結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力顯著下降，提示miRNA－221確實(shí)可在體外調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，其機(jī)制可能與靶向激活蛋白APAF1相關(guān)。本研究流式細(xì)胞儀檢測顯示，miRNA－221沉默后兩組腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞G1、S和G2／M期細(xì)胞比例未見明顯差異，提示miRNA－221沉默對(duì)細(xì)胞周期無明顯影響。而張春智等［4］的研究表明，miRNA－221／222抑制劑同時(shí)敲低miRNA－221和miRNA－222的表達(dá)可誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞G1期阻滯。本研究流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，miRNA－221沉默后，U251－miRNA－221沉默組的細(xì)胞凋亡率高于U251－miRNA－221組，提示miRNA－221沉默可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系凋亡。范崇桂等［3］的體外實(shí)驗(yàn)也得到了同樣結(jié)果，并通過生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)一步確定了凋亡蛋白酶活化因子1是miRNA－221的靶基因。miRNA的一些異常表達(dá)，如miRNA－221等也被證實(shí)對(duì)癌基因及抑癌基因有調(diào)控作用［5］?；诒緦?shí)驗(yàn)結(jié)果可推測，miRNA－221沉默可誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。有研究［6］顯示在脊髓膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中亦有相同結(jié)果，但單純沉默miRNA－221是否也可抑制U251細(xì)胞侵襲尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，miRNA－221基因在人腦膠質(zhì)瘤組織呈高表達(dá)，而慢病毒介導(dǎo)小干擾RNA沉默miRNA－221可明顯抑制腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系的生長增殖并促進(jìn)其凋亡，提示miRNA－221是一個(gè)潛在的腦膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)。