朱 清，張光輝，趙 艷

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是一種缺乏人類表皮生長因子受體2和雌激素、孕激素表達的乳腺癌亞型[1]。TNBC組織學(xué)上分化低、增殖快、轉(zhuǎn)移早、臨床上抗激素和HER2治療無效，目前TNBC的治療主要行常規(guī)化療，循證醫(yī)學(xué)[2]表明TNBC病人復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差、生存時間短。因此，發(fā)現(xiàn)靶基因免疫治療對TNBC的臨床診斷、治療和預(yù)后有重要意義[3]。有研究[4]表明組成型激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活劑3(STAT3)可參與 TNBC的血管生成、發(fā)生發(fā)展、侵襲和遷移。短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)是一種DNA分子，可以克隆到表達載體中，表達小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA,RNA雙鏈19～21個核苷酸)[5]?；赟TAT3設(shè)計shRNA序列并將其克隆成特定的載體，本文旨在探討STAT3在TNBC中的調(diào)控機制及其作為治療靶點的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2017年在本院接受乳腺腫瘤切除的130例病人作為研究對象。病人術(shù)前均未接受任何治療，術(shù)后病理診斷為TNBC。腫瘤組織為實驗組，腫瘤鄰近(距腫瘤病灶邊緣3 cm以上)的正常乳腺組織為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細胞系和主要試劑 實驗細胞：人乳腺癌細胞株(MDA-MB-231)由上海弘順科技有限公司提供。實驗試劑及材料：STAT3-shRNA表達載體由Santa Cruz Biotechnology,Inc.提供。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由Pro-mega Bio提供，SYBR Real-Time PCR試劑盒由大連Takara提供。DMEM(高)培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS平衡液由GIBCO提供。兔抗人單克隆一抗STAT3和兔抗β-肌動蛋白由美國Bioword提供。LipofectamineTM2000，Trizol試劑由Invitrogen提供。CCK-8試劑、Transwell小室由Beyotime Biotechnology(中國上海)提供；結(jié)合基質(zhì)膠(Matrigel,BD) 由 Merck 提供。

1.3 免疫組織化學(xué) 分離石蠟切片并水合，置于0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液中，微波加熱抗原修復(fù)。在3% H2O2去離子水中浸泡10 min，封閉15 min，加入STAT3一抗(工作濃度1∶200)4 ℃孵育過夜。PBS洗滌后，加入HRP標(biāo)記的抗兔二抗室溫孵育15 min。PBS洗滌后加入DAB溶液顯色，水洗，蘇木精復(fù)染，脫水，固定，顯微鏡下觀察。陰性對照使用PBS代替一抗。

1.4 細胞培養(yǎng) 將混有10%胎牛血清、50 U/mL青霉素和50 U/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶置于37°C 和5% CO2飽和度的培養(yǎng)箱中孵育MDA-MB-231，隔天換液,每2 d傳代。

1.5 設(shè)計與合成 STAT3-shRNA表達載體 根據(jù)人類基因序列[Genbank,NM_008210,STAT3]轉(zhuǎn)錄siRNA的作用原理設(shè)計、合成和選擇目標(biāo)：763-1278，TTG TAG ACG GAT CTA GCC GAT;GC含量52.63%，在目標(biāo)位點合成的寡核苷酸：5′-CTA GGG ATC GTC TTA GAG TTG AAG TCT AAG TTG TCT AGA CTT CAA CTC TAA GAC GAT TGA AAC CTA-3′,3′-GAT CCC TAG CAGAAT CTC AAC TTC AGA TTC AAG AGA TCT GAA GTT GAG ATT CTG CTA TTT TTG GAT-5′。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染和分組 將MDA-MB-231以3×105個細胞/孔接種于6孔板中，根據(jù)lipofectamineTM2000試劑說明書轉(zhuǎn)染STAT3-shRNA(50 nmol /L)至 MDA-MB-231 細胞后孵育48 h，更換培養(yǎng)基后繼續(xù)孵育24 h。熒光顯微鏡下計算細胞轉(zhuǎn)染效率：每個高倍視野綠色熒光的細胞數(shù)/細胞總數(shù)，取5個高倍視野平均值。實驗分組：實驗組(轉(zhuǎn)染STAT3-shRNA)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無序RNA)、空白對照組(未轉(zhuǎn)染)。

1.7 Western blotting檢測 如上所述的蛋白質(zhì)和細胞分組。細胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰蛋白酶消化、提取并測定蛋白濃度。根據(jù)Western blotting試劑盒說明書，每孔加入50 μg電泳分離的跨膜蛋白溶液，5%脫脂奶粉封閉，STAT3一抗(工作濃度1 ∶400)孵育過夜。TBST洗滌后，加入二抗孵育2 h成像。以β-actin為內(nèi)參，用Bandscan 5.0凝膠分析軟件分析蛋白表達量。

1.8 RT-PCR檢測 根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書檢測STAT3 mRNA的相對表達量。引物合成：STAT3上游引物5′-GTC ACT GTT CCG TCT TCT-3′，STAT3下游引物：5′-TGA GCT AGG GAC TGT TTT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-ATC GTG TCA GTC GGC GTA GAA GAA-3′，GAPDH下游引物：5′-TGG TTT AGG CAA CTG AGG CTG GAA-3′。實時熒光定量PCR儀熱循環(huán)反應(yīng)體系：分別加入0.4 μL上下游引物、2 μL cDNA、10 μL SYBR和去離子水至20 μL。PCR反應(yīng)條件：90 ℃預(yù)變性35 min，90 ℃10 s，70 ℃20 s，PCR循環(huán)35次。繪制溶解曲線：90 ℃ 10 s、70 ℃ 20 s、90 ℃ 10 s。驗證STAT3基因和GAPDH基因的擴增效率，使用2-ΔΔCt法計算表達量的比值。每組設(shè)置 3 個重復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次。

1.9 CCK-8 測定 于96孔板中消化、重懸和計數(shù) MDA-MB-231細胞100 μL( 5×103個細胞/孔)。待分組后的MDA-MB-231轉(zhuǎn)染24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液反應(yīng)4 h。酶標(biāo)儀(TECAN safire 2)測定450 nm波長處的吸光度值，計算各組細胞增殖活性。實驗重復(fù)3次。

1.10 細胞侵襲和遷移實驗 侵襲實驗：于Transwell小室中均勻鋪上25 μL Matrigel結(jié)合基質(zhì)膠，消化、重懸和計數(shù)100 mL MDA-MB-231懸液(5×104細胞/孔)，加200 μL的無血清培養(yǎng)基至小室中，放置在24孔板中孵育48 h。棄去每孔中的培養(yǎng)基后加入PBS沖洗5 min，加入0.1%結(jié)晶紫染色1 h后擦去腔室中的細胞后放置顯微鏡下觀察，隨機計數(shù)5個高倍視野中穿透膜的細胞數(shù)。在遷移實驗中，Transwell小室的細胞膜不覆蓋Matrigel結(jié)合基質(zhì)膠，其余步驟同侵襲實驗。每組設(shè)置3個重復(fù)孔。實驗重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 采用配對t檢驗、配對χ2檢驗、非參數(shù)秩和檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 STAT3在不同乳腺組織中的表達 STAT3蛋白主要在細胞核中表達。結(jié)果表明，正常乳腺組織核染色表達減弱甚至缺失，而乳腺癌組織核染色表達呈陽性,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.53,P<0.01)(見圖1、表1)。

表1 STAT3在不同乳腺組織中的表達

2.2 STAT3表達與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系 TNBC中STAT3蛋白的高表達與腫瘤大小、組織學(xué)分級、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05～P<0.01)。即腫瘤體積越大，組織學(xué)分級越高，TNM分期越晚，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中STAT3陽性表達率越高(見表2)。

表2 STAT3表達與乳腺癌臨床病理特征的聯(lián)系

2.3 Western blotting檢測STAT3蛋白表達 乳腺癌組織中STAT3蛋白的表達(1.01±0.02)顯著高于正常乳腺組織(0.24±0.02)(t=-310.40，P<0.01)(見圖2)。MDA-MB-231轉(zhuǎn)染48 h后，實驗組STAT3蛋白與陰性對照組和空白對照組相比表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見圖3、表3)。

2.4 RT-PCR檢測STAT3mRNA表達 MDA-MB-231轉(zhuǎn)染48 h后，實驗組mRNA表達水平與陰性對照組和空白對照組相比表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表3)。

表3 shRNA轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231細胞中STAT3的蛋白和mRNA表達比較

2.5 STAT3-shRNA對MDA-MB-231增殖活性的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示，MDA-MB-231轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，細胞生長抑制率分別為5.6%、17.2%和39.1%。實驗組細胞增殖活性與陰性對照組和空白對照組相比下降緩慢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表4)。

表4 STAT3-shRNA對MDA-MB-231 增殖率的影響

2.6 STAT3-shRNA對MDA-MB-231侵襲遷移的影響 Transwell實驗表明，實驗組細胞的侵襲和遷移能力低于陰性對照組和空白對照組(見表5)。侵襲和遷移實驗結(jié)果顯示，實驗組通過基底膜的細胞數(shù)與陰性對照組和空白對照組相比顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見圖4)。

表5 STAT3對MDA-MB-231 侵襲和遷移能力的影響

3 討論

世界衛(wèi)生組織 2022 年 1 月 12 日公布的數(shù)據(jù)顯示，2021 年確診癌癥病人數(shù)達到1 918萬[6]。其中，乳腺癌占新發(fā)癌癥病例的 12.1%，女性癌癥中乳腺癌的發(fā)病率和死亡率持續(xù)增高，且乳腺癌已超過肺癌成為世界第一大癌[7]。由于 TNBC 特殊的生物學(xué)特性，TNBC 也更容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，現(xiàn)有的分子靶向治療并不能獲得較好的臨床效果[8-9]，極易出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的癥狀，往往導(dǎo)致治療失敗和死亡，因此，尋找新的 TNBC 治療靶點極其重要[10]。

STAT3 是Janus 激活激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(JAK-STAT) 、 STATs 家族的重要成員之一[11]，且是JAK-STAT 信號通路的重要調(diào)節(jié)因子[12]。STAT3是一種原癌基因，在許多惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，其活化后導(dǎo)致腫瘤免疫抑制和抗凋亡，參與細胞增殖、促進血管生成、侵襲[13]，如食管鱗狀細胞癌、肺腺癌和結(jié)直腸腺癌[14]且與JAK-STAT信號通路的表達水平密切相關(guān)。最近的一組14 種乳腺癌細胞系的研究[15]表明，激活的STAT3細胞僅在TNBC中發(fā)現(xiàn)，并且80%的STAT3被激活[15]。本研究結(jié)果顯示，STAT3蛋白在乳腺癌組織中的表達高于正常乳腺組織，且STAT3的高表達促進乳腺癌的增殖、侵襲和遷移；后續(xù)研究結(jié)果表明，TNBC中STAT3蛋白和STAT3 mRNA的陽性表達高于正常乳腺組織，且STAT3在TNBC病人中的表達水平越高，腫瘤增殖越快，腫瘤亦越大，臨床分期越晚，侵襲轉(zhuǎn)移能力越強，預(yù)后越差。細胞轉(zhuǎn)染后增殖活性緩慢下降，細胞的侵襲和遷移能力明顯降低。

STAT3與雌激素和孕激素受體的表達無關(guān)[16]，但STAT3 在三陰性或雌激素和孕激素受體陰性的乳腺癌組織中高度表達，其中在TNBC的發(fā)生發(fā)展中，STAT3的過表達是影響TNBC病人預(yù)后的獨立因素。這也為推測STAT3可以作為乳腺癌臨床篩查的標(biāo)志物和TNBC免疫靶向治療提供了理論依據(jù)[17]。未來臨床運用聯(lián)合STAT3抑制劑的治療方案可能是對于TNBC一種新的治療方法[18]。

綜上所述，STAT3與TNBC的臨床病理相關(guān)，提示STAT3可能參與調(diào)控TNBC的發(fā)生和發(fā)展，對乳腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用，其高表達與預(yù)后不良密切相關(guān)。后續(xù)實驗將對其發(fā)生機制進行進一步深入研究。